Введение к работе
Актуальность работы
Streptococcus agalactiae - грамположительный микроорганизм, вызывающий широкий спектр заболеваний, таких как пиелонефрит, артрит, абсцессы, эндокардит, септицемия и др. (Sendi P. et al., 2008). S. agalactiae может приводить к патологии беременности (Larsen J. et al., 2008), вызывать тяжелые формы сепсиса, менингита, пневмонии новорожденных, часто приводящие к летальному исходу (Berardi et al., 2007).
Не менее важное значение S. agalactiae имеет в ветеринарии, поскольку может вызывать хронические маститы у крупного рогатого скота, которые наносят большой экономический ущерб (Keefe G., 1997). При этом многие домашние животные, не только коровы, но и кошки, собаки, лошади, свиньи и др., могут быть бессимптомными носителями S. agalactiae, что обуславливает наличие обширных очагов инфекции.
Использование молекулярно-генетических методов исследования позволяет провести сравнительный анализ штаммов S. agalactiae и предположить потенциальную способность отдельных штаммов вызывать инфекционные процессы в организмах различных хозяев. Так, например, наличие у штамма тех или иных генов патогенности является одной из важных характеристик его потенциальной способности к адгезии, инвазии и подавлению иммунного ответа хозяина. Ряд генов патогенности, таких как су IE, hylB, cfb, scaAB присутствуют во всех штаммах S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от животных. В то же время, каждый из генов Ъса, Ъас и scpB присутствует не у всех штаммов (DmitrievA. et al, 2002).
Штаммы S. agalactiae способны быстро адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, используя различные регуляторные механизмы. Одним из таких механизмов является регуляция транскрипции генов двухкомпонентными регуляторными системами. Двухкомпонентные системы участвуют в регуляции метаболизма бактерий, включая их способность использовать различные питательные вещества (Gao R. et al., 2009), в регуляции устойчивости к стрессовым воздействиям и действию антибиотиков и др. (Jordan S. et al., 2009). Кроме того, двухкомпонентные регуляторные системы часто контролируют экспрессию генов патогенности, что отражается на взаимодействии микроорганизма и организма хозяина, обеспечивает колонизацию органов и тканей и приводит к патологическим процессам.
Одним из генов патогенности S. agalactiae является ген Ъас, интенсивно изучаемый отделом молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в последние годы. При этом ген Ъас присутствует лишь у отдельной субпопуляции штаммов S. agalactiae, которые характеризуются специфическими рестрикционными паттернами ДНК, риботипами и аллелью гена sakl92 (Дмитриев А. В. с соавт., 2007). Ген Ъас кодирует белок Вас, способный связывать IgA человека и фактор Н комплемента человека. Вас является перспективным кандидатом в состав вакцинного препарата (Леонтьева Г. Ф. с
соавт., 2005; Грабовская К. Б. с соавт., 2007). Недавно было показано, что ген Ьас локализован в пределах "островка" патогенности размером 8992 п.н., содержащего семь генов, в том числе гены двухкомпонентной системы sakl88 и sakl89, кодирующие сенсорную гистидинкиназу Sakl88 и ДНК-связывающий белок Sakl89 (Dmitriev A. et al., 2006). Учитывая близкое расположение этих генов, логично предположить участие двухкомпонентной системы Sakl88/Sakl89 в регуляции транскрипции гена Ьас и синтеза белка Вас, и, как следствие, в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae.
Таким образом, актуальность изучения S. agalactiae, его факторов патогенности, а также механизмов их регуляции и формирования вирулентного фенотипа не вызывают сомнений. Имеющиеся данные о двухкомпонентной регуляторной системе Sakl88/Sakl89, потенциально участвующей в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae, открывают перспективные направления исследований. Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящей работы.
Цель исследования
Изучение роли двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89 в регуляции метаболизма, транскрипции гена Ьас и синтеза белка Вас и вирулентности S. agalactiae.
Задачи работы
Изучить генетическую гетерогенность штаммов S. agalactiae на основе наличия у них генов патогенности и аллели гена sakl92; выявить штаммы, содержащие ген Ьас и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89.
Инактивировать гены sakl88 и sakl89 у штамма S. agalactiae и провести сравнительный анализ свойств штамма дикого типа и мутантных штаммов с использованием методов биохимии, микробиологии и молекулярной биологии.
3. В штамме S. agalactiae, мутантном по генам sakl88 и sakl89,
восстановить экспрессию: а) обоих генов sakl88 и sakl89; б) только гена sakl89;
провести сравнительный анализ полученных штаммов.
4. Выявить штаммы, содержащие неактивные аллели генов sakl88 и/или
sakl89; восстановить в них экспрессию генов sakl88 и sakl89 и провести
последующий анализ свойств штаммов.
Научная новизна
обнаружены штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, содержащие ген Ьас и другие гены "островка" патогенности, в том числе, гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89;
показано, что штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и содержащие ген Ьас, характеризуются аллелью 1.1 генаш&792;
- методом инсерционного мутагенеза создан штамм S. agalactiae,
мутантный по гену sakl88, и штамм, мутантный по обоим генам
двухкомпонентной регуляторной системы sakl88 и sakl89;
- выявлено, что одновременная инактивация генов sakl88 и sakl89
приводит к значительному снижению уровня транскрипции гена Ьас (в 17 раз) и к
ингибированию синтеза белка Вас in vitro, в то время как инактивация одного
гена sakl88 методом инсерционного мутагенеза не влияет на уровень
транскрипции гена Ьас и экспрессии белка Вас;
- показано, что одновременная инактивация генов sakl88 и sakl89 приводит
к повышению вирулентности мутантного штамма по сравнению со штаммом
дикого типа при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей, а
инактивация одного гена sakl88 методом инсерционного мутагенеза не влияет на
вирулентность S. agalactiae;
- показано, что восстановление под контролем природного промотора
полноразмерного гена sakl89 в штамме S. agalactiae, мутантном по генам sakl88
и sakl89, приводит к активации синтеза белка Вас;
- обнаружен штамм S. agalactiae, содержащий ген Ьас, но не
экспрессирующий белок Вас вследствие точечной делеции гуанина в положении
439 в TQHQsakl89;
- выявлено, что восстановление экспрессии полноразмерных генов sakl88 и
sakl89 в штамме S. agalactiae, содержащем природную неактивную аллель гена
sakl89 приводит к активации экспрессии белка Вас.
Научно-теоретическая и практическая значимость исследования
Показано, что гетерогенность структуры и нуклеотидной последовательности гена sakl92 может быть использована в качестве одного из генетических и эпидемиологических маркеров штаммов S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от коров. Характеристика штаммов по аллели гена sakl92 в дополнение к другим методам исследования позволяет эффективно предсказывать их естественную экологическую нишу.
Полученные результаты необходимы для понимания механизма регуляции транскрипции гена патогенности Ьас S. agalactiae двухкомпонентной регуляторной системой Sakl88/Sakl89. Эти данные открывают новое направление исследований по разработке методов направленного воздействия на регуляторные механизмы экспрессии факторов патогенности с целью влияния на вирулентные свойства микроорганизмов.
Фрагменты ДНК, секвенированные в настоящем исследовании, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами: EU484325-EU484332, FJ890928, HQ840774.
Положения, выносимые на защиту
1. В геномах штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, может
присутствовать "островок" патогенности, содержащий ген Ьас и гены
двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89; штаммы S. agalactiae,
выделенные от коров и человека, которые содержат ген Ьас, характеризуются
аллелью 1.1 гена sakl92;
2. Инактивация генов sakl88 и sakl89 в штамме S. agalactiae приводит к
уменьшению уровня транскрипции гена Ьас и экспрессии белка Вас, а также
увеличению вирулентности при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей;
3. ДНК-связывающий белок Sakl89 необходим для активации синтеза
белка Вас;
4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sakl89 приводит к
потере функциональной активности белка Sakl89 и нарушению синтеза белка
Вас.
Личный вклад автора включал самостоятельное формулирование задач работы, проведение большинства исследований, адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов и их статистическую обработку. Методическая помощь была оказана Mikula I. Jr. при постановке и освоении метода SSCP и к.м.н. Грабовской К.Б., к.б.н. Королевой И.В., Зуткис А.А., Ильясовым Ю.Ю. при работе с лабораторными мышами.
Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов) и доложены на 5 международных и всероссийских конференциях: XVII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, г. Порто-Хели, Греция, 2008; 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, г. Хельсинки, Финляндия, 2009; XIII Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века' ', г. Пущино, 2009; 25th Congress of Czechoslovak Society of Microbiologists, г. С. Лесна, Словакия, 2010; Всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия", г. Санкт-Петербург, 2010.
Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в 2007, 2008 и 2011 гг.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов, 4 главы результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов и общее заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 9 таблиц и 57 рисунков, указатель литературы содержит 154 источника, в том числе 7 отечественных и 147 иностранных.
