Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I . Материал и методы .21-38
ГЛАВА II. Лизогения кулїїгур citrobacter и выделение фагов 39-45
ГЛАВА III. Физико-химические свойства фагов citrobacter .46-69
ГЛАВА ІV . Основные биологические сюйства фагов czcrobacter . ' 70-84
ГЛАВА V. Взаимодействие фагов citrobacterс чувствительными клетками 85-96
Обсщжйе полученных результатов .97-104
Выводы 105-106
Литература 107-
- . Материал и методы
- Лизогения кулїїгур citrobacter и выделение фагов
- Физико-химические свойства фагов citrobacter
- . Основные биологические сюйства фагов czcrobacter .
Введение к работе
В последние десятилетия значительно возросла роль условно патогенных микроорганизмов в патологии человека. Повсеместно отмечается рост обусловленных ими заболеваний, увеличивается удельный вес таких заболеваний, условно патогенные микроорганизмы часто являются возбудителями внутрибольничных инфекций (В.Д.Беляков с соавт., 1976; Л.А.Фаворова и Н.Б.Мордвинова,: 1977; В.В.Влодавец и И.Й.Колкер, 1977; С.В.Прозоровский и Л.А.Генчиков, 1983; И.Н.Моргунов и М.М.Колесников, 1983).
Причины такого явления многообразны. К ним относится совершенствование методов диагностики и лечения, применение новой медицинской аппаратуры, широкое использование разнообразных медикаментозных препаратов, осуществляющих в организме селекцию устойчивых вариантов, а также подавляющих защитные силы организма, приводя к нарушению эволюционно сложившихся микробиоценозов, возможность приобретения условно патогенными микробами факторов патогенности в результате генетического обмена (А.З.Смолянская и С.Д.Воропаева, 1983; С.В.Прозоровский и Л*А.Генчиков, 1983; В.М.Бондаренко и В.Я.Прохоров,1983).
Одной из причин роста патологии, вызванной условно патогенными микробами, является недостаточная изученность биологии и путей распространения этих микроорганизмов, несовершенство их диганостики (И.В.Голубева, 1977; Ф.Л.Вильшанская и Р.В.Эпштейн-Литвак, 1978). В этом плане существенную роль могут сыграть специфические бактериофаги, которые находят применение для идентификации и типирования различных возбудителей инфекционных заболеваний (сальмонелл брюшного тифа, шигелл, холерных вибрионов).
Бактериофаги условно патогенных микроорганизмов изуче-
ны недостаточно, основное внимание уделялось бактериофагам стафилококков, эшерихий, псевдомонад.
Среди условно патогенных микроорганизмов ведущая роль принадлежит представителям семейства Eaterobacteriaceae. Эти микробы высеваются при острых кишечных заболеваниях, при различных воспалительных процессах, при раневой инфекции ( J.Adler и соавт., 1971; V.Lorian и B.Topf , 1972; В.П,Рагинская и соавт,, 1977; С.В.Прозоровский и Л.А.Генчи-ков, 1983). По данным литературы, около 50 процентов случаев острых кишечных инфекций остаются нерасшифрованными (В.И.Покровский, 1977; И.В.Голубева, 1977; Е.П.Бернасовская и Ю.А.Барштейн, 1984).
Одним из сравнительно мало изученных представителей условно патогенных энтеробактерий являются бактерии рода Citrobacter, об этиологической роли которых в патологии имеются многочисленные, порой противоречивые, данные. Биологическая характеристика этих микробов исследована достаточно широко, однако о бактериофагах имеются лишь отрывочные сведения.
Учитывая сказанное выше, мы поставили целью выделение и изучение бактериофагов, активных против представителей рода Citrobacter. При этом мы исходили из необходимости расширения представлений об этих мало изученных объектах, а также из возможности их практического использования.
Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:
1. Изучение распространения лизогении среди бактерий
рода Citrobacter,
2, Выделение из лизогенных штаммов бактериофагов цитро-
5 бактера.
3. Изучение основных биологических и физико-химических
свойств бактериофагов Citrobacter.
4, На основании проведенных исследований выяснение во
проса о возможности использования бактериофагов цитробактера
для идентификации и разграничения данных бактерий.
Научная новизна» В результате изучения культур цитробактера выявлены лизогенные штаммы этих микробов, из которых изолированы фаги цитробактера. Впервые проведено исследование морфологии фагов цитробактера, показано содержание в них двухнитчатой ДНК гуанин-цитозинового типа, дана характеристика основных биологических свойств выделенных фагов, установлена высокая специфичность фагов Citrobact ег, показана возможность использования фагов для идентификации и разграничения культур цитробактера.
Практическая ценность. В ходе выполнения работы предложен метод определения лизогении с использованием штампа-репликатора. Создан набор фагов цитробактера, характеризующихся высокой специфичностью. Разработана методика приготовления фаговых суспензий и выяснены условия хранения фагов. Фаги цитробактера могут найти использование в практике микробиологических лабораторий для идентификации бактерий рода Ci-Grobacter. Показана принципиальная возможности типизации v культур цитробактера с помощью полученных фагов.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 5 работ. Фрагменты работы были представлены на УІ Северо-Кавказской конференции "Актуальные вопросы иммунологии и молекулярной биологии" (Нальчик, 1981), на УП Северо-Кавказской конференции "Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и
молекулярной биологии"( Краснодар, 1983) , на итоговой научной конференции медицинского факультета Кабардино-Балкарского госуниверситета ( Нальчик, 1983) , на УІ Международном конгрессе по вирусологии ( Япония, 1984) . Материалы диссертации обсуждены на заседании Кабардино-Балкарского отделения Всесоюзного микробиологического общества ( Нальчик, 1984) , на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Кабардино-Балкарского госуниверситета ( Нальчик, 1985)
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы.
Работа изложена на 126 страницах мишинописи, содержит 28 таблиц, б рисунков, 9 фотографий. Список литературы включает 72 работы отечественных авторов и 82 - иностранных.
7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Самостоятельный род Citrobacter был выделен в 1932 году Werkman и Gill en. Предложение о выделении этих бактерий в отдельный род в <. течение ряда лет отвергалось, и местонахождение их в классификационно-диагностических схемах не было стабильным. Согласно первоначальной классификации F.Kauffmann (1954) С разделением семейства Enterobacteriaceae на 4 трибы и 9 родов описываемая группа бактерий была отнесена к трибе Eschericheae роду Escherichia f точнее к разновидности E.freundii.
Согласно решения, принятого в 1958 году Международным номенклатурным подкомитетом по Enterosbaeteriaceae , семейство кишечных бактерий было подразделено на 10 родов, одним из которых является Citrobac-fcer.
В 1966 году F.Kaumann предложил новую классификацию, в которой бактерии семейства Enterobacteriaceae разделены на 3 трибы и 12 родов. Род Citrobacter вместе с родами Salmonella, Shigella и Escherichia включен В трибу Eschericheae. Новым явилось включение этих бактерий в качестве 5 подрода в род Salmonella, в связи с чем он был обозначен как Salmonella coll.
В настоящее время род Citrobacter входит в трибу Escherichieae семейства Enterobacteriaceae (J.Seulak, 1974).
Интерес к бактериям рода Citrobacter в последние годы значительно возрос в связи с появлением в литературе данных, указывающих на их возможную этиологическую роль при различных кишечных расстройствах (легко протекающие гастроэнтериты, энтериты, энтероколиты). H.cioppet и соавт.
(1977) отмечают, что эти бактерии относятся к так называемым
микробам "оппортунистам" и в будущем могут иметь большое зна
чение в инфекционной патологии, вытеснив других представите
лей семейства Enterobacteriaceae.
Бактерии рода Citrobacter обнаруживаются в кишечнике у здоровых людей, причем частота их выделения колеблется по данным разных авторов довольно широко* Так, В.С.Петрус и со-авт. (1977) выеевалдэти микробы у 20 процентов обследованных здоровых людей, О.Н.Костюковская и соавт. (1983) - у 20,2$, А.И.Акопова (1977) отмечает, что цитробактер чаще высевается у детей - эти микробы обнаружены у 20 процентов обследованных детей, тогда как у взрослых они высевались в 6,3 процента случаев. По материалам Е.П.Бернасовской и Ю.А.Барштейна (1984), высеваемость цитробактера у здоровых лиц составляла 5,8 процента, а по данным і.Л.Вильшанской и Р.В.Эпштейн-Литвак
(1978) - 3,9 процента.
В то же время С.Т.Мнацаканов и соавт. (1983) у здоровых детей обнаруживали бактерии рода Citrobacter в 0,85 процента случаев, Г.К.Калашникова и соавт. (1975) находили эти микробы у 0,4 процента здоровых взрослых, a M.Stejskalova и соавт. (1975) - у 0,05 процента.
Частота выделения цитробактера у больных с различными желудочно-кишечными заболеваниями возрастает. Так, по материалам В.С.Петруса и соавт. (1977), у больных она составляла 38 процентов (у здоровых - 20$), Е.П.Бернасовской и Ю.А.Бар-штейна (1984) - 19,4 процента против 5,8 процента у здоровых, А.И.Акоповой (1977) - 19,4 процента против 6,3 процента у здоровых взрослых и 37,6 процента против 20 процентов у детей. Г.К.Калашникова и соавт. (1975) у больных дизентерией высева-
ли представителей рода Citrobacter в 4 процентах случаев, у больных гастроэнтеритом и энтероколитом - в 3,2 процента (у здоровых лишь в 0,4% случаев). Отмечается повышение высе-ваемости цитробактера у людей, длительно принимавших антибиотики ( M.Slifkin и C.Engwail , 1969; Г.К.Калашникова и соавт., 1975).
Описаны случаи массовых заболеваний, при которых доказана этиологическая роль цитробактера. В частности, М.ТагаЪсак (1957) приводит данные о вспышке токеикоинфекции у 14 человек, употреблявших в пищу молоко. У всех заболевших были выделены бактерии рода Citrobacter серовара За, 3b, Іс:8, а в крови обнаруживались антитела к этим микробам. Имеется сообщение о вспышке заболеваний, связанных с употреблением ливерной колбасы (из 400 заболевших у 240 были выделены бактерии серовара 8а, 1с:8, а у 60 процентов из них обнаружены в крови антитела к этому серовару цитробактера). Наблюдались случаи гастроэнтерита у более чем 200 человек, вызванного цитробактером серовара 22:64 ( J.Sedlak и H.Riscne, 1968). В литературе имеются многочисленные указания на этиологическую роль бактерий рода Citrobacter при различных кишечных заболеваниях ( L.Barnes и W.Ghery, 1946; P.Edwards И W.Ewing, 1966; J.Beiniein ' и c.Fica, 1969; С.Н.Кагановская и соавт., 1973; В.Г.Финн, 1977, 1978; Г.М.Гедзе и Р.М.Чупрун, 1978; А.М.Домбровский, 1983).
Г.К.Калашникова и соавт. (1976) находят связь между выделением из испражнений бактерий рода Citrobacter и дис-бактериозом кишечника. Данное обстоятельство позволило им рассматривать факт обнаружения цитробактера как показатель дисбактериоза.
Бактерии рода Citrobacter связывают с возникновением инфекций мочеполового тракта ( S.Jones и соавт., 1973; Н.И.Ан-дронова, 1978; В.Г.Петровская и соавт., 1983; Л.Т.Теблоева и М.Б.Цванг, 1983). Эти микробы могут быть причиной лихорадочного состояния - так, В.М.Бондаренко и О.В.Лопушанская (1983) обнаруживали их в крови у 7,1 процента лихорадящих больных*
Большой интерес представляют попытки связать способность представителей рода Citrobacter вызывать различные патологические процессы с их сероваром, подобно тому, как это имеет место у эшерихий. И*И.Гориенко и соавт, (1978) обнаруживали эти микробы у 6,3-8,7 процента больных с кишечными расстройствами различной тяжести. Чаще высевались культуры сероваров 04, 022, реже - 03, 021, Об, 08, 015, 01, 07, ОН. По данным В.П.Рагинской (1973), у больных с кишечными заболеваниями и при пищевых токсикоинфекциях наиболее часто выделяются культуры цитробактера сероваров 08, 022, 07, Об, 013, 05, 01, 012.
В испражнениях обнаруживались бактерии сероваров 022, 01, 05, 012, в моче - 036, 019, 014, 015 (В.Г.Петровская и соавт*, 1983). Авторы рассматривают последние штаммы как "не-фритогенные". З.И.Найман и соавт. (1978) находили, что 73 процента выделенных при кишечных заболеваниях штаммов Citrobacter относились к сероварам 04, 01, 05, 08, 07, 03, 022. Чаще высевались культуры цитробактера у больных дизентерией (36%), га-строэнтероколитом, энтеритом, диспепсией (28%), пищевой ток-сикоинфекцией (13,7%)* Отмечена определенная связь между клиникой заболевания и частотой выделения культур сероваров 03, 04, 01, 09, 05, 07. При этом штаммы сероваров 07, 022 высевались лишь у больных, а сероваров 01, 05 - преимущественно у больных. В то же время И.Т.Тимофеева (1983) не отмечает суще-
ственных различий в сероварах цитробактера, выделенного от здоровых и от больных.
Предпринимались попытки обнаружить у выделяемых от больных штаммов цитробактера, факторы, определяющие патогенность микробов. Так, А.П.Батуро и соавт, (1971) при исследовании 91 штамма бактерий рода Citrobacter у 20 обнаружили фимб-рии, с помощью которых эти бактерии могут прикрепляться к клеточной стенке, причем никакой связи с 0-типом бактерий установлено не было» Различные факторы патогенности (гемолитическая способность, гиалуронидаза, коагулаза, нейраминидаза) описали Л.К.Вепхвадзе и соавт» (1979) у культур цитробактера, изолированных при патологических процессах разной локализа-ции» В то же время А*С»Иванова и Т»Б«Смирнова (1972) отмечают слабую патогенность культур цитробактера для белых мышей при внутрибрюшинном и энтеральном заражении» Опыты Б.Б.Перши-на и соавт. (1975) на стерильных морских свинках показали, что введение животным штамма цитробактера приводит к размножению бактерий в количествах, превышавших общее число всех представителей нормальной микрофлоры у обычных животных* В течение 46 дней у таких животных не отмечено антителообразование»
Культуры цитробактера зачастую выделялись в период минимальной бактериологической расшифровки кишечных инфекций, который приходится на летний период, по мере увеличения бактериологического подтверждения диагноза дизентерии высеваемость бактерий рода Citrobacter снижалась (3»И»Найман и соавт*, 1978). Бактерии рода Citrobacter нередко обнаруживались у работников предприятий питания, медицинского персонала, которые могут служить источником распространения этих микробов»
Однако в изучении распространения цитробактера имеются трудности, обусловленные нечеткостью их внутриродового разграничения, пестротой биологических свойств, недостаточной разработкой критериев их разграничения.
Согласно 8-го издания "Определителя Берги" ( J.Sedlak, 1974) к роду Citrobacter относятся"подвижные палочки с пе-ритрихиальными жгутиками, некапсулированные. Хорошо растут на обычных средах и могут использовать цитрат как единственный источник углерода. Глюкозу и другие углеводы сбраживают с образованием кислоты и газа (GOg и Н^ в соотношении 1:1). Лактозу иногда не сбраживают или сбраживают с задержкой. Из глицерина образуется триметиленгликоль* КОТ не ингибирует рост'.' В данный род включены два вида - C.freundii и C.intermedius, причем последний разделен на два биотипа (а иь).
В последнее время в литературе появились предложения о включении в род Citrobacter новых видов* Наиболее существенным является предложение о включении вида C.diversus (B.Davis и W.Ewing, 1966; W.Ewing И B.Davis, 1972; B.Holmes и соавт,, 1974). Эти микробы в отличие от C.freundii стабильно ферментируют адонит, не растут на среде с цианистым калием. Кроме того, они способны утилизировать ма-лонат натрия, образовывать индол, декарбоксилировать орнитин, но не образуют сероводород (W.Ewing, 1973; J.Farmer, 1981). Описание этого вида соответствует описанию биотипа Ъ вида C.intermedius в: "Определителе Берги" ( J.Sedlak, 1974). Дополнительными признаками дифференциации C.freundii и C.diversus является чувствительность C.diversus к цефа-лоспорину, a C.freundii - к карбенициллину ( H.Smith и соавт., 1973; P.Southern и M.Bagly, 1977; G.Prieto
и соавт., 1977)» В антигенном отношении эти микробы самостоятельны.
G представителями O.diversus. связывают возникновение разнообразных патологических процессов. S.Jones и соавт., (1973) обнаруживали их при поражениях кожи, уха, глотки, желчных путей при различных диагнозах, A.Madrazo и соавт. (1975), G.Prieto и соавт. (1977) - при менингитах, инфекциях мочеполового тракта, В.П.Рагинская и соавт. (1980) - при инфекционных осложнениях у хирургических больных.
Бактерии рода Citrobacter обладают пестрыми биохимическими свойствами, вследствие чего их идентификация довольно затруднительна и требует комплекса дифференциально-диагностических биохимических тестов. Поэтому важное значение, имеет изучение антигенных свойств этих микробов.
Впервые схема дифференциации бактерий рода Citrobacter по антигенному строению была предложена M.West и P.Edwards (1954). У цитробактера было установлено наличие 32 0-анти-генов и 88 Н-антигенов, причем отмечено 75 комбинаций. У штаммов группы 027 обнаружен б -антиген, а в группах 05 и 029 -Vi -антиген» Последнее обстоятельство использовано при конструировании живой энтеральной вакцины против брюшного тифа, в которую включен vi-позитивный штамм Citrobacter (Б.Б. Перший и соавт., 1976). В дальнейшем к роду Citrobacter были отнесены еще 10 0-групп ( J.Sedlak и M.Slajso.va, 1966; J.Sedlak, 1970), а затем еще 2 группы ( O.Luderitz и соавт., I9&8; L.Le Minor и соавт., 1970). Таким образом, в настоящее время C.freundii включает 44 0-группы и более 200 серологических вариантов. Между группами 02 и 025, 029 и 030, 07 и 08, 07 и 017, 03 и 08, 029 и 03 выявлено антигенное
14 родство (В.П.Рагинская; 1972).
У представителей рода Oitrobacter установлены определенные антигенные связи с другими энтеробактериями. В частности, отмечена взаимосвязь между О-антигенами Oitrobacter и Б.соїі. Еще М.West и р*Edwards (1954) установили наличие
* *
двусторонних рецепторних связей между антигенами 01 цитробак-тера и 09 Е.соіі, 07 и 099, 09 и 07 и т.д. Имеются выраженные связи между антигенами Oitrobacter и Morganella morganii. Наиболее широко представлены и изучены антигенные взаимоотношения между цитробактером и сальмонеллами. Выявлено серологическое и химическое родство О-антигенов Oitrobacter и О-антигенов Salmonella, общность химического состава полисахаридов, обусловливающих специфичность О-антигенов. Наиболее четкие связи отмечаются между антигеном 022 цитробакте-ра и рецепторами 4, 5, 12 S.parathyphi В,антигеном 03 и рецептором 41 S.waycross, антигеном 09 и рецептором 30 Б.шЪапа и др. ( O.Westphal и соавт., 1958; I960; A.Staub и соавт., 1959; O.Luderitz и соавт,, 1966, 1973; O.Westphal, 1967). Исследования указанных авторов показали, что О-антигены энтеробактерий являются сложными химическими соединениями и состоят из видоспецифического полисахарида и многих общих компонентов (липида А, белка, липида В). О-антигены бактерий каждого рода имеют определенный комплекс Сахаров, состоящий из 5-7 различных моносахаров, которые составляют так называемое общее ядро. Кроме того, О-антигены содержат сахара, характерные для каждого антигена. Они присоединены к общему ядру, образуют специфические боковые цепи и являются детерминантными группами, обусловливающими О-антигенную видоспецифичность.
В состав этих детерминантных групп входят обычно 2-3 сахара из ограниченного набора (глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, рамноза, колитоза, абеквоза, паратоза, тивилоза). Установлена тесная связь между углеводным составом специфического полисахарида и его серологической специфичностью» Данные о качественном составе полисахаридов О-антигенов Salmonella, Citrobacter, Escherichia свидетельствуют о том, что серологически родственные О-антигены содержат одни и те же сахара и принадлежат к одному и тому же хемотипу. Таким образом, двустороннее родство антигенов у представителей Citrobacter и Salmonella объясняется общностью химического строения этих антигенов, а имеющиеся серологические различия обусловлены, видимо, разными количественными пропорциями и способами связи общих полисахаридов (В.П.Рагинская, 1973).
Учитывая наличие антигенного родства у цитробактера и сальмонелл, важное значение приобретает разграничение этих микробов. Существенная роль в этом принадлежит определению некоторых биохимических тестов, в частности 8-галактозидаз-ной активности и декарбоксилазы лизина. Штаммы цитробактера обладают выраженной ft-галактозидазной активностью. По данным Н.И.Гридневой и соавт. (1977), такая активность отмечена у 88,6 процента музейных культур и у 100 процентов свежевы-деленных, причем эта активность выявлялась раньше, чем у сальмонелл.
Способность бактерий рода Salmonella декарбоксилиро-вать лизин позволяет отдифференцировать их от цитробактера, не обладающего такой способностью.
Помимо антигенных различий предпринимались попытки разграничить представителей рода Citrobacter по чувствительно-
сти к антибиотикам. Эти бактерии очень часто проявляют множественную устойчивость к антибиотикам. Так, по данным Н.В.Баланина и Г.К.Калашниковой (1978), 44,6 процента исследованных штаммов цитробактера были устойчивыми к антибиотикам, причем шлирезистент-нбстью обладали 60,5 процента культур, а монорезистентностью -лишь 39,5 процента. Чаще всего культуры цитробактера были устойчивыми к тетрациклину (25,9%), к стрептомицину (24,8$), к лево-мицетину (24%). На основании чувствительности к антибиотикам авторам удалось выделить 24 типа культур рода Citrobacter .По наблюдениям Л.М.Тетериной и В.Г.Финна (1977), 79 процентов исследованных культур цитробактера были устойчивыми к 4-6 различным антибиотикам. Наибольшей устойчивостью бактерии рода Citrobacter обладали к линкомицину (98%), олеандомицину (97%), левомицетину (84%), ампициллину (39%), стрептомицину (37%). Все испытанные культуры были устойчивыми к ристомицину.
Все изученные В.Е.Курашвили и соавт. (1981) 72 культуры Citrobacter обладали множественной устойчивостью к 2-II антибиотикам. При этом 7 из 19 штаммов оказались устойчивыми к четырем препаратам, 5 - к трем, I - к шести антибиотикам. Чувствительных ко всем испытанным антибиотикам штаммов не оказалось. Культуры цитробактера были малочувствительными к цепорину, ампициллину, эритромицину, рифампицину.
A.Molina и соавт. (1968), Н.НакаЬагаи. соавт.(1984) получили доказательства связи устойчивости штаммов цитробактера к антибиотикам с наличием у них R-факторов. M.Swiderski и A.Jeazejewski (1976) показали наличие r -плазмиды у штаммов Citrobactei>, выделенных при интоксикации поросят.
При проведении внутривидового разграничения патогенных
микробов важную роль играют бактериофаги, с помощью которых осуществляется типирование ряда патогенных бактерий, В частности, широко используется метод фаготипирования брюшнотифозных микробов, разработанный J*Craigie и С.Yen (1938), сальмонелл паратифа В, разработанный A.Felix и В.Callow (1943), коагулазоположительных стафилококков, предложенный J.Blair и. E.Williams (1961).
Бактериофаги условно патогенных энтеробактерий широкого применения в этом плане еще не нашли, хотя в литературе имеются данные о фагах, активных в отношении условно патогенных представителей различных родов этого семейства.
Наиболее полно изучены фаги E.coli, многие из которых являются модельными объектами в молекулярно-генетических исследованиях, К таким стандартным фагам относятся колифаги Т-серии, пассирующиеся на общем хозяине -E.coli в( M.Demerec и U.Pano, 1945), фаг / - классический представитель умеренных бактериофагов ( E.Lederberg, 1951), фаг JZ&I74, содержащий однонитчатую ДНК ( R.Sinslielmer, 1959), РНК-содержащие фаги ( Т.ЬоеЪ и IT.Zinder, 1961)* Однако, несмотря на многочисленную литературу по колифагам, вопросу использования их для разграничения бактерий должного внимания не уделялось -исследовались в основном фаги энтеропатогенных кишечных палочек (Л.Б.Борисов и соавт., 1962; Л.Б.Борисов и В.А.Хан-Фими-на, 1970).
Имеется'значительная литература, посвященная фагам Klebsiella. Эти фаги предлагались для типирования клебсиелл склеромы (И.М.Габрилович, 1963; 1967; Т.И.Ваканчикова, 1965; А.П.Красильников и Н.А.Израитель, 1966), бактерий рода Klebsiella С H.Milch и S.Deafc, 1965, 1966; A.Przondo-
Hessek, 1966; S.Slopek и соавт,, 1967).
Морфология фагов Klebsiella описана С.Б.Стефановым и И.М.Габриловичем (1966), И.М.Габриловичем и соавт. (1969)» T.Krzywy и соавт. (1972) провели электронномикроскопи-ческое исследование большого числа выделенных из разных источников фагов Klebsiella, которые по морфологии и размерам частиц были разделены на 4 группы: с коротким отростком, длинным изогнутым отростком, с сокращающимся чехлом отростка и гексагональной головкой, с сокращающимся чехлом отростка и удлиненной головкой. В дальнейших работах T.Krzywy (1972, 1972а) представил детальные данные об ультраструктуре фагов этой группы. Имеются данные о нуклеотидном составе ДНК фагов Klebsiella (И.М.Габрилович и соавт., 1968) и об аминокислотном составе белков (Н.И.Анисимова и соавт,, 1971).
Описаны отдельные штаммы фагов Serratia. D.Bradley (1965а) обнаружил различные морфологические типы этих фагов, фаги Serratia изучены М.Жегі и соавт. (1966).
Больше^внимания уделялось фагам, активным против бактерий Proteus и Providencia. Описаны фаги различных морфологических типов, лизирующие эти бактерии ( O.Prozesky и соавт., 1965; J.Coetzee и соавт., 1966; J.Coetzee и J.Smit, 1970). Установлено, что ДНК фага Pr.vulgaris 107/69 содержит 39,8$ ГЦ ( J.Coetzee и соавт,, 1967), ДНК фага Pr. morganii М - 48,6$, а фага Providencia Rl26 -41,6$ ( J.Coetzee и соавт., 1966). Как показал J.Coetzee (1963), фаги Pr. retfegeri лизируют штаммы Pr. hauseri и Providencia а фаги Providencia - штаммы Pr.rettgeri
В последние годы много внимания уделяется фагам Y.enterocolitis са. Предложены схемы фаготипирования этих микробов ( -Р.ЗЯГІСoilе, 1973; B.Nilehn, 1973; P.Baker и
J.Parmer, 1982). Большая группа фагов X.enterocoiitica выделена на кафедре микробиологии Кабардино-Балкарского госуниверситета (Т.Ч.Жугова, 1984).
Сведения о бактериофагах, активных в отношении бактерий рода Citrobacter, весьма ограничены. В доступной нам литературе мы встретили лишь работу R.Goodman и M.Picketfc (1965), посвященную этим фагам. Авторы изучили лизогению у
C.freundii. Среди 123 штаммов ими были выделены 8 умеренных фагов, которые испытаны на 165 штаммах Citrobacter и 172 штаммах других энтеробактерий. Фаги оказались высоко специфичными и не лизировали культуры других видов энтеробактерий. Выделенные фаги различались по морфологии негативных колоний. Из испытанных на чувствительность к этим фагам 165 культур цитробактера фагочувствительными оказались 31 процент. Авторы отметили корреляцию между фагочувствительностью культур Citrobacter и способностью их сбраживать сахарозу. Однако штаммы цитробактера оказались чувствительными к гете-рологичным энтерофагам: один штамм лизировался колифагом Т4, один - фагом Т7, один - фагами ТЗ и Т7, один - поливалентным сальмонеллезным фагом 0-1. Подобное явление описано и другими авторами. Отмечена чувствительность культур цитробактера к VI -фагам S.typhi ( V.Lenk, 1964). Из 10 испытанных штаммов цитробактера 8 оказались чувствительными к экспериментальному интести фагу Тбилисского НИИВС (В.Е.Курашвили и соавт., 1981). Кроме того, в литературе имеются данные о выделении фагов, лизирующих бактерии рода Levinea , которые близки к бактериям вида C.diversus ( D.Markel и С.ЕШша, 1974)« Из сточных вод были изолированы 3 фага, специфичные в антигенном отношении. Фаги лизировали культуры
L. amalonatica и L. malonatica.
Из данных литературы по рассмотренным вопросам видно, что условно патогенные бактерии рода Citrcrtiacter распространены довольно широко и играют определенную роль в патологии человека,
В литературе достаточно широко освещались вопросы о культуральных, биохимических, антигенных свойствах цитробак-тера. Однако практически отсутствуют сведения о бактериофагах этих микробов.
. Материал и методы
При выполнении работы использованы 60 штаммов, отнесенных к роду Citrobacter и к виду c.freundii. 51 культура была получена из музея Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича (ГНИИСК), 9 культур выделены из патологического материала в микробиологической лаборатории городской клинической больницы города Нальчика. Перечень этих культур представлен в таблице I.
Среди изученных культур 4 являются типовыми из музея Meждyнapo ного центра по определению типовых культур в Лозанне, 9 изолированы в Праге (Институт гигиены и эпидемиологии), Z - в Софии (Государственный институт по контролю лекарственных средств), 35 выделены и идентифицированы в Московском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова (МНИИВС), I - в ГНИИСК.
Исследованные культуры были типичными по морфологии и культур-эдьным свойствам. Для характеристики ферментативной активности изучаемых культур использован набор "А" систем индикаторных бумажных (СИБ) производства Горьковского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии, предназначенный для иден kMVM«U
Лозанна, Международный центр по определению типовых культур 1975 - - 46. 1738 tt и и 1974 I 1:8,9 47. 86401 H и и 1974 - - 48. 84387 H и tt 1974 - - 49. Be 107/75 и и ЧССР, Прага, ин-т гигиены и эпидемиологии 1975 2 2а,1ъ :22,22 50. Be 43/75 n n п 1975 3 За,ЗъДс:22,23 51. 105/59 II n мниивс 1972 15 15:32,34 52. - Респ. СЭС 6.II.82 г.Нальчик, городская больница 1982 - - точл- « tt п 1982 4 4а,4ъ :18а,18ъ 54. - и n и 1982 - - 55. - и и tt 1982 36 36:54 56. - и и II 1982 8 8а,1 :8 57. - n it tt 1982 - - 58. - « tt tt 1982 - и» 59. - и и tt 1982 - - 60. - Бак.лабор. горбольницы 1981 г.Нальчик, городская больница 1981 4 4а,4Ъ :18.а, 18ъ 26 тификации микроорганизмов семейства Eaterobacteriaceae (З.М.Андреева и соавт., 1983). Исследования проводились с выращенными на 1,5%-ном питательном агаре суточными культурами согласно "Наставления по применению систем бумажных индикаторных (СИБ) для идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae " (1982). Определяли образование бактериями индола, сероводорода, уреазы, фенилаланиндезаминазы, А-галактозидазы, утилизацию цитрата и малоната натрия, ферментацию лактозы, лизина. Результаты испытаний приведены в таблице 2. Таблица 2 Ферментативные свойства культур Citrobacter Свойство Число по- : Число отри-: Процент полонитель- : цательных : ложительных ных ре- : результа- ; результатов зультатов ; тов : О Образование индола Образование сероводорода Уреазная активность Образование фенилаланиндезаминазы Образование (Ь -галакто-зидазы Усвоение цитрата натрия Усвоение малоната натрия Ферментация лактозы Ферментация лизина 3,3 26 34 43,3 8 . 52 13,3 о 12 80,0 31 29 51,7 28 .32 46,6 32 28 53,3 0 60 Все испытанные штаммы не образовали фенилаланиндезаминазы, не ферментировали лизина; за исключением 2 штаммов, не образовывали индол,за исключением 12 культур не образовывали й -галакто-зидазу. Усвоение цитрата и малоната натрия отмечено соответственно у 51,7 % и 46,6 % испытанных культур. Изученные штаммы по своим ферментативным свойствам соответствуют характеристикам бактерий рода Citrobacter. Серологическое типирование проведено в реакции агглютинации с адсорбированными 0-сыворотками цитробактера производства Московского научно-исследовательского института вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова. Типировались 50 штаммов, 10 отнесены к нетипируемым (таблица I). Испытанные культуры принадлежат к различным сероварам. Штаммы мало различались по чувствительности к антибиотикам, определенной методом дисков (таблица 3). Таблица 3 Чувствительность культур Citrobacter к антибиотикам Антибиотики : Число : штаммов Пенициллин 60 Стрептомицин 60 Мономицин 60 Неомицин 60 Гентамицин 60 Эритромицин 60 Левомицетин 60 Тетрациклин Число рези- : Процент резистентных стентных штам-штаммов : мов 88,3 15,0 3,3 Все испытанные культуры были чувствительными к стрептомицину, мономицину, неомицину, гентамицину, левомицетину. Подавляющее большинство штаммов оказались устойчивыми к пеницилли-лг ну (88,3%), 9 штаммов (15%) - к эритромицину и 2 штамма (3,3%) -к тетрациклину. При обработке испытанных культур акридиновым оранжевым по методике Y.Hirota (I960) в концентрации 63-75 мкг/мл 5 штаммов (№№ 7, 10, 16, 20, 25) изменили свою чувствительность к пенициллину и эритромицину - все эти штаммы стали чувствительными к данным антибиотикам. Подобное отношение к указанным препаратам бактерии сохраняли и после серии пассажей, что указывает на возможную элиминацию плазмид акридиновым оранжевым.
Лизогения кулїїгур citrobacter и выделение фагов
Выявление лизогении производилось путем перекрестного испытания надосадочной жидкости бульонных культур на газонах испытуемых штаммов (И.М.Габрилович, 1973). Газоны готовились двухслойным методом: в 2 мл расплавленного 0,7$ питательного агара вносилось 0,2-0,3 мл суточной бульонной культуры и содержимое выливалось на поверхность чашки Петри с питательным агаром. После застывания агара производились испытания.
Суточные бульонные культуры центрифугировались при 5000 g в течение 15-20 минут, и надосадочная жидкость накапывалась петлей диаметром в 3 мм на газон. После нанесения капель чашки выдерживались 20-30 минут до полного их впитывания, после чего инкубировались 18-20 часов при температуре 37. На одной чашке испытывались 18-20 культур. Кроме того, для выявления лизогении использован металлический штамп-репликатор, предназначенный для определения чувствительности бактерий к антибиотикам. 4-5 часовые бульонные культуры испытуемых "бактерий центрифугировались при 5000 g в течение 10 минут и надосадочные жидкости помещались по 0,2 мл в ячейки основания штампа-репликатора, стерилизованного обжиганием спиртом. Крышка штампа-репликатора также стерилизовалась обжиганием, после остывания она погружалась в ячейки основания штампа-репликатора и осторожно переносилась на подсушенный газон индикаторной культуры в чашке с питательным агаром. Чашки подсушивались при комнатной температуре, после чего инкубировались при 37, На одной чашке при использовании штампа-репликатора испытывались 25 культур. В случае обнаружения лизогенных культур отмечался полный лизис индикаторной культуры, появление отдельных негативных колоний, зона подавления роста индикаторного штамма вокруг нанесенной капли. В положительных случаях опыты повторялись и производилось выделение фага из негативных колоний или из надосадочной жид-. кости.
Индукцию лизогенных культур производили облучением бульонных культур ультрафиолетовым излучением при экспозиции при помощи бактерицидной лампы БУВ-І5 на расстоянии 40 см 30-60 секунд, а также воздействием митомицина G в концентрации 0,5 мкг/мл в течение 2 часов.
Результаты исследованийНа лизогенность испытаны 60 штаммов Citrobacter. Все штаммы исследовались как "лизогенные" и как индикаторные. При перекрестном испытании признаки лизогении отмечены у 16 культур. Однако выделение фагов удавалось не всегда. Индукция ультрафиолетовым излучением и митомицином С не позволила выявить новые культуры с признаками лизогенных. При испытании культур цитробактера на лизогенность удобным оказалось использование штампа-репликатора. В результате испытания 37 культур с его применением были выявлены лизогенные культуры № 8 и 31 и выделены фаги из этих культур (рис. I). Фаги были изолированы из 4 лизогенных культур. Индикаторными для этих фагов оказались 3 штамма C.freundii (таблица 5), В результате пассажей на индикаторных штаммах выделены 4 фага Oitrobacter : 40/1, 8/5, 31/37 и 38/37. Как известно, спонтанное освобождение фага лизогенными штаммами может быть охарактеризовано отношением числа инфекционных центров фага в культуре к числу жизнеспоообных микробных клеток ( P.Jacob, 1954; G.Bertani, 1958; М.Адамс, 1961; И.М.Габрилович, 1970). Исходя из этого, мы определяли эти показатели у выявленных лизогенных штаммов № 8, 31, 38, 40« Определение проводилось следующим путем: 18-20 часовые бульонные культуры лизогенного штамма высевались на чашках Петри с питательным агаром для подсчета числа жизнеспособных бактерий (В), одновременно производилось титрование культу-ральной жидкости после 15-минутного центрифугирования при 5000 s двухслойным методом на соответствующей индикаторной культуре и определялись инфекционные центры фага (р) в I мл культуры. Расчитывалось соотношение р: В. Результаты 3-5 повторов подвергались статистической обработке (таблица б). Таким образом, лизогенные культуры цитробактера характеризуются умеренным спонтанным фоном освобождения фага. Ти р 5 / тры фагов в таких культурах составляли 10 - 10 /мл. Наиболее низкими были титры фага в лизогенном штамме № 31 ( 1-2 10 /мл). Соотношение р/В в изученных культурах было различным. Так, штаммы № 38 и 8 имели близкие величины
Физико-химические свойства фагов citrobacter
Выделение ДНК из фагов проводили по методике j.Mandell и A.Hershey (I960), путем депротеинизации фенолом. Подвергнутые концентрации и очистке препараты фага, содержавшие в 1 мл Ю12-Ю13 частиц, обрабатывались равным объемом 75% водного раствора свежеперегнанного фенола. После 5-минутного 4-7 встряхивания при температуре 4-6 смесь центрифугировали при 7000-9000 g в течение 30 минут при температуре 4-6. Верхний слой отсасывали и для удаления остатков фенола обрабатывали 2 объемами эфира в течение 5 минут. Смесь разделяли в делительной воронке и удаляли слой эфира. Подобную обработку проводили 2-3 раза. Остатки эфира удаляли путем пропускания воздуха. ДНК осаждали 2-3 объемами охлажденного 96% этилового спирта, высушивали при температуре 100 в течение 30 минут. 3. Определение нуклеотидного состава ДНК фагов Для получения свободных оснований ДНК подвергали гидролизу хлорной кислотой. Для этого сухой препарат в количестве 2-3 мг помещали в стеклянную ампулу, добавляли 1-2 капли 72% хлорной кислоты, ампулу запаивали и препарат гидролизовали при температуре 100 в течение I часа, после чего ампулу вскрывали, к гидролизату добавляли 1-2 капли дистиллированной воды и содержимое наносили на хроматографическую бумагу. В работе использовали хроматографическую бумагу типа "медлен-ная" производства Ленинградской фабрики № 2# Бумага промывалась 2н. раствором уксусной кислоты и дистиллированной водой до рН 7,0,как рекомендовано Б.Ф.Ванюшиным (1964), а затем растворителем и дистиллированной водой. После каждого промывания бумага высушивалась на воздухе.
Разделение оснований проводилось в кислом растворителе ( K.Kirby, 1955), состоявшем из абсолютного метанола - концентрированной соляной кислоты - воды в соотношении 70: 20: 10. Разделение оснований проводили при комнатной температуре в течение 15-16 часов. Пятна оснований выявлялись на хроматограммах в ультрафиолетовом свете, для каждого образца ДНК определяли величину подвижности (R ) всех четырех оснований. Пятна элюировали в 5 мл 0,1 н. НСИ в течение 24 часов при температуре 37 и снимали спектры поглощения на спектрофотометре GS-26 против элю-атов из контрольных участков хроматограммы.
Расчет количества каждого из оснований проводился по А.С.Спирину и А.Н.Белозерскому (1956): гуанин 0,714 х & 250 аденин 0,399 х & 260 цитозин 0,94 х Д 276 тимин 0,743 х А 260, где /! - разница между оптической плотностью при указанной длине волны и при А « 290 мм. Цуклеотидный состав ДНК выражали в молярных процентах, приходящихся на каждое основание. По результатам 3-5 определений вычисляли средние арифметические ( S ) и средние ошибки среднего арифметического (m). Результаты 1« Морфология фагов Citrobacter . При электронномикроскопическом исследовании все изученные фаги имели близкую морфологию вирионов. Фаги представлены головкой, имевшей в проекции гексагональную форму. Диаметр головки составлял 50+2 нм, длина грани - 25-30 нм. Отросток фага прямой, имеет в длину П2 152нм и сокращающийся чехол диаметром 11,5-12,5 нм. Толщина стержня отростка составляет 5+0,6 нм. В сокращенном состоянии чехол имеет в длину 52-65 нм и в диаметре 15-16,5 нм. На дис 49 тальном конце отростка обнаруживается базальная пластинка диаметром 12-15 нм, от которой отходят короткие отростки. Схематически строение фага Citrobactee представлено на рис.2. Фаг 38/37 (рис.3) . В препаратах встречается много частиц фага с запустевшими головками. В большинстве случаев чехол отростка сокращен (рис. 4) . У фага 31/37 отмечен несколько более короткий отросток ( 130 + 8 нм ) , чем у фага 38/37 (рис. 5 ) . Фаг 8/5 отличается еще более коротким отростком ( рис. 6 ) . В препаратах много запустевших головок ( рис. 7 ) . . Частицы фага 40/1 мало отличались от фага 38/37 ( рис. 8, 9 ) . Размеры изученных фагов Citrobacter представлены в таблице 8. Как видно из таблицы 8, существенных различий между рассмотренными фагами Oitrobacter по величине фаговых головок не отмечается. По величине отростка изученные фаги могут быть распределены в две группы - у фагов 31/37 и 8/5 имеется несколько более короткий отросток, чем у фагов 38/37 и 40/1. Все изученные фаги могут быть отнесены к морфологическому типу А по D.Bradley ( 1965) или к морфологической группе У по А.С.Тихоненко ( 1968 ). По систематике H.-W.Ackermaim И A.Eisenstarlc ( 1974 ) , D.Tteamiey и H.-W.Ackermarm. ( 1982 ) эти фаги принадлежат к группе AI.
. Основные биологические сюйства фагов czcrobacter .
Обработка негативных колоний фагов Oitrobacter путем наслаивания хлороформа на 10 минут с последующей инкубацией (Д.М.Гольдфарб и В.А.Зуев, 1963) не выявила изменений в морфологии этих колоний. Следовательно изученные фаги не имеют связанного с вирусной частицей литического фермента (В.А.Зуев, 1969). Таким образом, по характеру негативных колоний фаги 31/37 и 8/5 близки между собой, фаги 38/37 и 40/1 являются самостоятельными. 2. Антигенные свойства фагов Антигенные свойства фагов являются важным критерием для их разграничения. Методика исследований Антигенные свойства фагов изучали в реакции нейтрализации антифаговыми сыворотками, которые получали в результате иммунизации кроликов. Для этого животных весом в 2,5-3 кг иммунизировали подкожно 5 мл суспензии фага, содержащей в I мл I - 5»10у и.ц, фага. Иммунизацию проводили 2 курсами по 3 инъекции в каждом курсе. Интервал между инъекциями составлял 3 дня, между курсами - 7 дней. После пробного взятия крови из краевой вены уха и испытания сыворотки производился забор крови из сердца кролика. Нейтрализацию фагов антифаговыми сыворотками проводили в бульонной среде при температуре 37. Для этого фаг в коли-честве 0,1 мл с титром I - 3 10 и.ц./мл вносили в .0,9 мл сыворотки, разведенной до титра в той же бульонной среде. Смесь инкубировалась в ультратермостате, после чего делались соответствующие разведения и производилось титрование методом агаровых слоев. Отмечался процент нейтрализации фага, вы /tt числялись константы скорости нейтрализации (К) по следующей формуле: где 2,3-lg Р0/Р D К = "4 Р0 и Р - титры фага до и после воздействия антифаговой сыворотки, D - разведение сыворотки, t - время инкубации (М.Дцамс, 1961). За титр антифаговой сыворотки принималось наибольшее разведение ее, которое давало нейтрализацию не менее 90 процентов гомологичного фага при минимальной экспозиции. В качестве контролей использовали антифаговую сыворотку колифага Т2, а также фаги E.coli Т2 и Klebsiella К1 Результаты Исследования проводились с сыворотками, полученными к фагам 38/37, 40/1 и 8/5. Эти сыворотки характеризовались невысокой нейтрализующей активностью (таблицаШ). Таблица 15 Характеристика антифаговых сывороток Сыворот-:Количе-:Количество ка :ство :введенного :курсов :фага :иммуни-: :зации : Экспо-!Процент зиция !нейтра-(мин.)Ілизован :ного :фага К т (мин" ) 38/37 2 2,5-1010 I : Ю 30 99,4 1,7 40/1 3 3,2-1010 I : 10 30 96,3 ІД 8/5 3 2,6-1010 І : 10 ЗО 98,5 1,4 Константы скорости нейтрализации гомологичных фагов бы т ли низкими - 1,1-1,7 мин . Это свидетельствует о слабой антигенности фагов Citrobacter. Результаты опытов нейтрализации фагов антифаговыми сы воротками приведены в таблицахЩ17 . Полученные антифаговые сыворотки являются специфичными., Фаги oitrobacter не нейтрализовались антисывороткой к ко % лифагу Т2. Фаги Т2 и Klj не нейтрализовались сыворотками к фагам Oitrobacter. Таким образом, фаги Oitrobacter являются самостоятельными в антигенном отношении. Фаги 38/37 и 40/1 обладают отдаленным антигенным родством между собой, фаг 31/37 близок к фагу 38/37, но отдален в отношении фага 40/1. Фаг 8/5 является самостоятельным в антигенном отношении. Температурная устойчивость , Чувствительность к воздействию температуры может быть использована для разграничения фагов. Кроме того, на различной чувствительности бактерий и фагов к этому воздействию основано приготовление суспензий некоторых фагов. Методика исследований Инактивацию фагов воздействием температуры изучали в питательном бульоне по общепринятой методике (М.Адаме, 1961; И.М.Габрилович, 1973). В пробирки вносили по 0,2 мл исследуемого фага, содержавшего 1-3»10 и.ц./мл, после инактивации в ультратермостате к фагу добавляли по 1,8 мл питательного бульона, готовили соответствующие разведения и фаг высевали методом агаровых слоев с индикаторной культурой Определяли процент выживаемости фага и вычисляли константу скорости инактивации (К) по формуле: 2,3 lg Р_/Р К я z—, где Р0 и Р - титры фага до и после инактивации, - время инактивации. Результаты 4-8 повторов обрабатывались статистически. Чувствительность бактерий к температуре определялась аналогично. Высев производился на агаровые чашки по 0,1 мл разведения с распределением бактерий по поверхности среды с w помощью стеклянного шпателя. Результаты Температурную чувствительность фагов Oitrobacter изучали при температурах 45, 50, 55, 60. Экспозиция составляла 30 минут. Результаты опытов представлены в таблице 18.. При температуре 45 инактивации фагов не происходило. При температуре 50 отмечена инактивация лишь фага 8/5, причем эта инактивация была значительной - за 30 минут инактиви-ровалось 80 процентов фага. При температуре 55 происходила инактивация фагов 31/37, 40/1 и 8/5. Фаг 38/37 был нечувствительным к воздействию этой температуры. При температуре 60 отмечена небольшая инактивация этого фага, резкая инактивация фага 8/5 (99,6%) и значительная инактивация фагов 31/37 и 40/1 (30,1-34,4%). Таким образом, исследованные фаги характеризуются различным отношением к воздействию температуры. Наиболее чувствительным оказался фаг 8/5, инактивация которого наступала уже при температуре 50, а при температуре 55 инактивирова-лось 98 процентов фага. Фаг 38/37 обладал относительной устойчивостью к воздействию температуры. Учитывая возможность использования температурного воз-действия для приготовления фаговых препаратов, проведено изучение чувствительности индикаторных бактерий к температуре (таблица 19.)
