Введение к работе
Актуальность проблемы.
Как известно, вирулентность туляремийного микроба для животных и человека является основным критерием для разделения вида Francisella tularensis на три подвида - неарктический, среднеазиатский и голарктический (Олсуфьев Н.Г., 1975). Однако до настоящего времени не идентифицированы факторы, определяющие различный уровень патогенности таксонов возбудителя туляремии. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы может служить поиск и изучение биологических признаков микроба, отличающихся у разных подвидов, и выяснение их роли в реализации патогенных свойств. В частности, установлено, что штаммы F. tularensis неарктического и среднеазиатского подвида синтезируют фермент цитруллинуреидазу, а неарктические и голарктические штаммы - пенициллиназу, которые отсутствуют у клеток других подвидов (Родионова И.В., 1970; Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., 1992). Однако неоднократные попытки выявить прямую коррелятивную связь между наличием этих ферментов и вирулентностью возбудителя успеха не имели.
Перспективным, на наш взглядов этом отношении может быть изучение ферментов, играющих ключевую роль в метаболизме и регуляции жизнедеятельности бактериальной клетки. К таким энзимам можно отнести фосфатазы. Так, на модели многих микроорганизмов показана важная роль этой группы ферментов в обмене углеводов, нуклеотидов и фосфолшшдов (Диксон М., Уэбб Э., 1982). Установлена также значимость фосфатаз в регуляции активности других энзимов микробной клетки, важных для обеспечения механизмов ее саморегуляции (Диксон М., Уэбб Э., 1982; Могап А. et al., 1989). Кроме того, у некоторых патогенных бактерий эта ферментативная система участвует в реализации их вирулентных свойств (Barber М, Kupper S.W.A., 1951; Wolf P.L. et al., 1972;Chhatwal G.S. et al., 1997).
Приступая к настоящему исследованию мы не смогли обнаружить в литературе сведений о наличии и свойствах фосфатаз у различных представителей рода Francisella. Уже в процессе выполнения работы появились данные T.J. Reilly et al. (1996), посвященные характеристике кислой фосфатазы туляремийного мик-
роба. Авторами было убедительно показано, что в отличие от других микроорганизмов, у туляремийного микроба выявляется единственный белок, обладающий фосфатазной активностью. Этот фермент выполняет важную биологическую функцию, заключающуюся в его способности подавлять окислительный взрыв фагоцитов и обеспечивать внутриклеточное выживание бактерий. К сожалению, результаты исследования не дают возможности сделать заключение об общих закономерностях функционирования этой ферментативной системы у возбудителя туляремии. Так, не умаляя достоинств данной работы, необходимо отметить, что она выполнена на весьма ограниченном наборе штаммов - 2 штамма туляремийного микроба и 1 - F. novicida. При этом в работе отсутствует характеристика использованных авторами штаммов по основным биологическим свойствам, включая их вирулентность и подвидо-вую принадлежность, что, в свою очередь, затрудняет интерпретацию полученных результатов.
В литературе отсутствуют сведения по сравнительному изучению фосфатазной активности у широкого набора штаммов туляремийного микроба, включая культуры разной "подвидовой принадлежности и вирулентности. Кроме того, нет данных о наличии и функционировании этой ферментативной системы у новых представителей рода Francisella - F. novicida-like и F. philomiragia. Учитывая дискуссию о правомочности включения последних в род Francisella, изучение у них новых биохимических признаков позволит расширить знания о биологии и внутриродственных связях у представителей этого рода.
В этой связи актуальность изучения фосфатазной активности у возбудителя туляремии была продиктована как значимостью этого энзима в физиологии бактериальной клетки и его возможным участием в реализации патогенности F. tularensis, так и пробелами в наших знаниях по этим вопросам.
Вышеперечисленный круг проблем и определил цель настоящего исследования.
Цель исследования.
Характеристика фосфатазной активности у бактерий рода Francisella.
Задачи исследования:
1. Определение оптимальных параметров выявления и сравни
тельный анализ фосфатазной активности у различных видов
франциселл. Изучение особенностей проявления фосфатаз
ной активности у штаммов F. tularensis голарктического под
вида.
-
Поиск и изучение белков у бактерий рода Francisella, обладающих фосфатазной активностью с помощью изофермент-ного анализа.
-
Изучение возможной роли фосфатазной активности в экспрессии вирулентности туляремийного микроба.
-
Разработка дополнительных новых методов для идентификации F. tularensis in vitro по выявлению у них фосфатазной активности.
Научная новизна и теоретическая ценность работы.
Впервые получены сравнительные данные о фосфатазной активности у различных видов франциселл и определены оптимальные параметры ее выявления. Проведенный с помощью изофер-ментного анализа поиск белков у бактерий рода Francisella, обладающих способностью гидролизовать фосфорилированные соединения, показал, что все изученные штаммы продуцируют единственную каталически активную кислую фосфатазу с пшрокой субстратной специфичностью. При наличии общих свойств фермент у разных таксонов отличается по электрофоретической подвижности, чувствительности к детергентам и субстратной специфичности. Установлено, что, неарктические и среднеазиатские штаммы F. tularensis имеют мембрано-связанную и периплазматическую формы фермента. В то же время слабопатогенные штаммы голарктического подвида туляремийного микроба синтезируют только мем-брано-связанный энзим с минимальной ферментативной активностью.
Сравнительный анализ фосфатазной активности у изогенных вирулентных и авирулентных штаммов F. tularensis показал, что авирулентные культуры характеризуются достоверно большей активностью фермента.
Разработаны новые быстрые методы подвидовой дифференциации возбудителя туляремии, основанные на избирательной ин-гибиции фосфатазной активности голарктических штаммов доде-цилсульфатом натрия. Метод4определения подвидовой принадлежности F. tularensis в бактериальньк суспензиях защищен авторским свидетельством на изобретение (№ 1655989, БИ № 22, 1991 г.), оформлены и утверждены Ученым Советом РПЧИ методические рекомендации (протокол № 8 от 27.05.92 г.).
По усовершенствованному быстрому методу внутривидовой дифференциации туляремийного микроба с помощью дисков оформлены и утверждены Ученым Советом РПЧИ методические рекомендации (протокол № 6 от 16.06.98 г.).
Предложен новый быстрый метод оценки вирулентности туляремийного микроба in vitro, основанный на детекции высвобождающейся фосфатазы при культивировании бактерий разнЬй степени вирулентности в нормальной сыворотке человека. По последнему методу оформлены и утверждены Ученым Советом РПЧИ методические рекомендации (протокол № 6 от 16.07.97 г.).
Разработанные методы могут найти применение при идентификации возбудителя туляремии.
Выявлено, что приобретение бактериями голарктического подвида резистентности к индоксилфосфату - субстрату для фос-фатаз, сопровождается быстрой потерей вирулентного фенотипа, что может быть использовано экспериментаторами для получения коллекции изогенных авирулентных штаммов туляремийного микроба голарктического подвида.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Все представители рода Francisella синтезируют кислую фосфатазу с широкой субстратной специфичностью. При наличии общих свойств фермент у разных представителей
рода отличается по электрофоретической подвижности, чувствительности к детергентам и субстратной специфичности. %,. Штаммы голарктического подвида туляремийного микроба продуцируют мембрано-связанную форму фосфатазы с минимальной каталитической активностью, тогда как штаммы двух других подвидов - неарктического и среднеазиатского обладают мембрано-связанной и периплазматичсской формами фермента. %. Выявлена обратная корреляция между фосфатазной активностью бактерий и их вирулентностью. у, Фосфатазная активность является стабильным маркером, удобным для создания методов быстрой дифференциации подвидов туляремийного микроба и оценки его вирулентности in vitro. Апробация работы. ч
Материалы диссертации доложены на научных конференциях РПЧИ и конкурсах молодых ученых РПЧИ; а также представлены на 8 Международном конгрессе по микробиологии (Израиль, 1996) и 2-ой Международной конференции по туляремии (Чехия, 1997). Структура диссертации.
Работа изложена на 103 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения и выводов и списка литературы. Библиография включает 91 источник, в том числе 43 отечественных. Диссертация иллюстрирована 7 рисунками и 18 таблицами.