Введение к работе
Актуальность проблемы. Жизнь на Земле во всём её многообразии зависит от кислорода. Есть основание полагать, что молекулярный кислород присутствовал в атмосфере Земли ещё до появления жизни. Следовательно, проблема взаимодействия клетки с кислородом стара как сама жизнь и самая первая клетка, возникшая на планете, должна была иметь защитные механизмы, которые бы служили основой сохранения и эволюции жизни. К таким механизмам детоксикации молекулярного кислорода, вероятно, следует отнести систему дыхания; эта первичная и древняя функция, по мнение академика З.П. Скулачева (1994), присуща и ныне существующим клеткам. Проблема защиты клетки от кислорода наиболее остро стоит у растений, которые не только поглощают кислород в процессе дыхания, но и продуцируют его в результате фотосинтеза.
Фотосинтез, который представляет собой комплекс последовательно протекающих процессов, обеспечивающих трансформацию солнечной энергии в химическую, является одной из актуальных и наиболее важных проблем современной биологии, а исследование энергопреобразующих систем занимает центральное место в решении этой проблемы и ведется на разных уровнях -на растениях, водорослях и бактериях, на изолированных мембранах, белковых комплексах и модельных пигмент-содержащих системах. Комплексный подход к решению проблемы позволяет глубже понять не только механизм преобразования световой энергии, но даёт возможность выяснить этапы становления фотосинтетического аппарата и общие закономерности протекания фотосинтеза.
В связи с этим особое внимание исследователей обращено на фотосинтезирующие микроорганизмы, среди которых важное место занимают пурпурные бактерии, внесшие существенный вклад в понимание механизмов трансформации световой энергии при фотосинтезе. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий, главной составной частью которого являются фотосинтетические реакционные центры, локализован в цитоплазматической мембране и внутриклеточных мембранных структурах - хроматофорах. Комплексы реакционных центров, являясь первичными преобразователями световой энергии, обеспечивают фотоиндуцированный пере-
- z-
нос электронов по циклической системе, функционирование которой приводит к генерации на сопрягающих мембранах электрохимического протонного градиента, и по нециклической системе, одним из проявлений которой является фотоиндуцированное поглощение кислорода - фотооксвдазная активность.
Фотооксвдазная активность, впервые обнаруженная Френчем ( Prench, 1940), вероятно, имеет большое физиологическое значение, смысл которого может заключаться в регуляции содержания кислорода в среде. В результате удаления Ор за счет фо-тооксидазной реакции в среде создаются анаэробные условия, необходимые для роста бактерий. В связи с этим, заслуживает особое внимание исследование не только механизма этого эффекта, но и его связи с фотосинтезом (Шувалов и др., 1968).
Цель работы. Поскольку механизм фотооксидазной реакции и её роль в бактериальном фотосинтезе оставались неизученными, то это и послужило целью исследований, которые проводились на клетках, изолированна мембранах, комплексах реакционных центров и пигментах пурпурных и зеленых бактерий. Работа базируется на исследовшиях, начатых на кафедре микробиологии ИГУ.
Конкретно задачи исследований сводились к изучению механизма фотооксидазной реакции и её роли в детоксикации молекулярного кислорода и в генерации мембранного потенциала.
Научная новизна работы. Установлено, что изолированные мембраны и интактные клетки пурпурных и зеленых бактерий, инкубируемые с донорами электронов, при освещении поглощают кислород, т.е. обладают фотооксидазной активностью. У разных бактерий компоненты,реагирующие с 09, имеют различную природу. Фотооксвдазная реакция у несерной пурпурной бактерии Юю-dospirillxaa гпЪгш протекает при участии компонентов фотосинтетического реакционного центра и, наиболее вероятно, обусловлена взаимодействием фотовосстановленного вторичного хино-на в непротонированной форме Щ^*) с кислородом. Поскольку скорость фотооксидазной реакции в хроматофорах R. rubrum снижается.при добавлении супероксиддисмутазн и каталазы, то продуктом реакции, вероятно, является анион супероксидного радикала. В интактных клетках компонентом, взаимодействующим
с QgT может бить не Op, а цитохром с или ее ( они в значительной степени теряются при выделении хроматофоров), которые в свою очередь окисляются кислородом с образованием HdO. Таким образом, фотооксидазная активность пурпурных бактерий выполняет защитную функцию, а бактериальные хроматофори подобно митохондриям, по-видимому, служат биологическими топками, сжигающими органическое вещество для снижения концентрации кислорода в клетке.
При обработке изолированных хроматофоров R. rubrum детергентами с кислородом взаимодействуют фотовосстановленные компоненты электрон-транспортной цепи, предшествующие On"*. В опытах с модельными системами показано, что такими компонентами могут быть бактериохлорофилл и бактериофеофитин, которые, будучи встроенными в мицеллы детергентов, или в леци-тиновне липосомн, при освещении взаимодействуют с кислородом. Фотооксидазной активностью обладают также липосомн, содержащие каротиноиды пурпурных бактерий.
Показано, что светозависимая циклическая редокс-цепь пурпурных бактерий может функционировать в двух режимах: как цепь с полным набором редокс-компонентов и как сокращенная цепь, функционирующая без участия цитохрома ь. Она находится в тесном взаимодействии с системой дыхания, что проявляется в наличии не только общих компонентов, но и в образовании общего продукта этих двух систем - трансмембранной разности электрохимических потенциалов. Впервне проведена реконструкция электрогенной функции мембранной РРн-азы пурпурной бактерии
R. rubrum.
Окисление компонентов циклической редокс-цепи в результате фотооксидазной реакции, как и чрезмерное их восстановление в анаэробных условиях вызывает ингибирование её электрогенной функции. Кислород оказывает регулирующее влияние на редокс-состояние компонентов циклической цепи фотоиндуциро-ванного переноса электронов.
В клетках пурпурной серобактерии Ectothiorhodospira balopMla и зеленой серобактерии Chlorobium limicola цито-хромоксидазной активности не обнаружено, что свидетельствует
06 отсутствии системы дыхания и особой роли фотооксидазной
реакции, физиологический смысл которой в микроаэрофильннх
условиях в сочетании с суперокеиддисиутазой и каталазой мо
жет заключаться в детоксикации молекулярного кислорода, а в
условиях аэрации среды она, вызывая окисление компонентов фо
тосинтетической редокс-цепи, приводит к энергетическому дефи
циту в клетке и её последующей гибели.
Высказана гипотеза о том, что молекулярный кислород мог быть движущим фактором эволюции фотосштетического аппарата как преобразователя световой энергии, важным этапом эволюции представляется формирование механизмов фотооксидазной реакции, что закладывает основу для нового подхода в изучении фотосинтеза.
Практическая значимость работы. Знание механизмов фотооксидазной реакции проясняет природу анаэробного образа жизни фототрофных бактерий и может быть использовано для оптимизации их промышленного культивирования с целью получения полезных продуктов метаболизма, а в будущем для создания искусственных систем преобразования и аккумуляции световой энергии по принципу действия фотосинтетического аппарата клетки.
Место проведения работы. Исследования были начаты на кафедре микробиологии биологического факультета Московского госуниверситета и продолжены на кафедре физиологии растений и микробиологии биологического факультета Пермского госуниверситета. Автор выражает искреннюю благодарность В.Д. Саму-илову за внимание, поддержку и помощь в организации исследований и написании работы.
Структура работы. Диссертационная работа написана в монографическом плане на 325 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 70 рисунков, и состоит из введения,