Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Генетическая характеристика патогенных стрептококков групп А и В Суворов, Александр Николаевич

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Суворов, Александр Николаевич. Генетическая характеристика патогенных стрептококков групп А и В : автореферат дис. ... доктора медицинских наук : 03.00.07 / НИИ эксперимент. мед..- Санкт-Петербург, 1997.- 30 с.: ил. РГБ ОД, 9 98-6/1556-7

Введение к работе

Заболевания стрептококковой этиологии занимают ведущее место среди инфекционных заболеваний бактериальной природы. Стрептококки группы А (СГА) вызывают широкий спектр разнообразных болезней человека, таких как тонзиллит, фарингит, скарлатина, рожистое воспаление и стрептодермия, которые в целом ряде случаев осложняются острым гломерулонефритом, ревмокардитом, стрептококковым сепсисом и гнойными процессами в фасциях и мышцах. Стрептококки группы В (СГВ) занимают видное место в патологии беременности и вызывают тяжелые, подчас летальные, заболевания новорожденных ( сепсис, менингит).

Стрептококковые заболевания человека известны достаточно давно. В литературе описаны неоднократные эпидемии скарлатины в Европе, в Азии и в Америке, уносившие тысячи жизней. После открытия антибиотиков, в первую очередь, пенициллинового ряда, к которым стрептококки оказались высоко чувствительными, проблема стрептококковой патологии, казалось, отошла на второй план. Однако, в последнее десятилетие частота возникновения заболеваний, вызванных стрептококками вновь резко возросла. Из заболеваний, вызываемых стрептококками (главным образом, вызванных стрептококками группы А) по тяжести на первое место выходят такие, как сепсис, токсический шок и некротический фасцит или миозит, приводящие к смерти больного за считанные часы даже на фоне интенсивной антибиотикотерашш (Stevens D. et al. 1996). 70% тяжелых осложнений, вызванных стрептококковыми заболеваниями, связаны со стрептококками группы А двух серотипов - Ml и МЗ, удельный вес которых в стрептококковой патологаи до начала семидесятых годов был невысок. Наиболее вероятно, что повышенное количество тяжелых стрептококковых заболеваний, вызванных штаммами этих М серотипов, связано со снижением уровня специфической иммунной защиты населения против серотипов, которые длительное время не циркулировали в человеческой популяции (Тотолян с соавт. 1994). Однако, нельзя исключить, что изменения в эпидемиологии стрептококковых заболеваний связаны с появлением новых высоко вирулентных стрептококковых штаммов с повышенным уровнем вирулентности .

В последнее время изменилась и клиническая картина заболеваний, вызванных стрептококками группы В. Теперь они вызывают не только тяжелые заболевания новорожденных такие как сепсис или менингит, но и ранее несвойственные им

воспалительные поражения глаз и легких. При этом заболевания взрослых, в том числе септического характера, возникают столь же часто, что и заболевания новорожденных (Facklam R. et al. 1991). Накопились данные о способности СГВ вызывать серьезные инвазивные поражения с летальными исходами (Schwartz В. et al. 1991), в том числе токсические состояния и некротические фасциты (Schlievert P. et al. 1993).

Повышение тяжести протекания стрептококковых заболеваний часто влечет за собой их переход в хронические формы: хронический гломерулонефрит, пиелонефрит, различные формы пороков сердца. Многие из таких пациентов переходят на инвалидность, что усиливает социально-экономическое значение стрептококковых заболеваний. Очевидно, что для выявления и своевременной локализации эпидемических вспышек стрептококковых заболеваний необходим адекватный уровень эпидемиологического надзора, основанный на современной лабораторной базе.

Существующая в настоящее время лабораторная идентификация и классификация стрептококков, базируется исключительно на серологических методах исследования и не позволяет осуществлять детальный клинико-эпидемиологический анализ стрептококковой заболеваемости, а тем более изучать пути формирования эпидемически актуальных штаммов. Типирование стрептококков группы А, например, осуществляется на основании антигенных различий их М белков, которых существует более 80 различных типов. Однако, полного набора анти-М сывороток нет ни в одной лаборатории мира, а имеющиеся сыворотки не позволяют осуществлять точную эпидемиологическую идентификацию штаммов. На основе генетического анализа показано, что штаммы, принадлежащие к одному и тому же М серотипу, могут существенно отличаться друг от друга. Молекулярно-генетическая идентификация эпидемических штаммов стрептококков практически не разработана, и исследования в этом направлении носят эпизодический характер. Исследования последних лет, проводимые с использованием генно- инженерной технологии, позволили накопить данные о структурной организации некоторых генов стрептококков групп А и В, кодирующих потенциальные факторы вирулентности. Так были проклонированы и изучены гены стрептококковых М белков различных серотипов, гены рецепторов иммуноглобулинов А и G, гены ряда стрептококковых токсинов, цитолизинов, поверхностно локализованных ферментов таких как стрептокиназа, ДНКазы, С5а пептидаза и др.. Однако, исследования, направленные на изучение отдельных стрептококковых генов, кодирующих белки, участвующие в формировании вирулентности, носят фрагментарный характер. Неизвестно взаимное расположение

генов вирулентности на генетической карте стрептококков. Практически не изучены механизмы регуляции экспрессии этих стрептококковых генов.

Все вышесказанное повышает социально-экономическое и общемедицинское значение исследований стрептококков, как в плане необходимости улучшения диагностики стрептококковых заболеваний, так и с точки зрения исследования молекулярных механизмов их возникновения. Оіедовательно, изучение биологии и патогенетических свойств стрептококков групп А и В актуально как с научной, так и с экономической и социальной точек зрения.

Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А и В коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности клеточной стенки ряд белков, а также полисахаридную капсулу, однако роль всех стрептококковых белков в патогенезе, не исключая такие хорошо известные белки, как М белок стрептококков группы А, до сих пор недостаточно изучена. Более того, знания о стрептококках и механизмах, повышающих вирулентность этих микроорганизмов, которые казались очевидными 10 лет назад, сейчас подвергаются сомнению и пересмотру. В полной мере это относится и к состоянию научных знаний о стрептококках группы В. Все вышесказанное определило цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является осуществление генетического анализа стрептококков групп А и В посредством исследования хромосомной организации стрептококковых генов, а также структуры отдельных генов, участвующих в реализации вирулентного фенотипа. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Для осуществления молекулярно-генетического анализа стрептококков
адаптировать такие методы как трансформация посредством электропорации,
электрофорез в пульсирующем электрическом поле и экспресс - полимеразная цепная
реакция.

2. Осуществить анализ хромосомной ДНК стрептококков группы А для:

- построения физической и генетической карты хромосомы стрептококка группы А

- проведения сравнительного анализа локализации генетических маркеров на
хромосомах стрептококков группы А различных серотипов.

3. Осуществить молекулярно - генетический анализ ряда стрептококковых генов, потенциально принимающих участие в реализации вирулентного фенотипа ( С5а пептидаза, глутаминсинтетаза, RecA ):

клонирование генов,

определение их нуклеотиддай последовательности,

компьютерный анализ иуклеотидных последовательностей,

получение рекомбинантных белков в системе E.coli,

- создание интегративных векторов и получение изогенных мутантов стрептококков
по исследуемым генам.

4. Провести молекулярно-эпидемиологичесхое исследование на предмет изучения распространенности ряда генов вирулентности в штаммах стрептококков групп А и В различных серотипов (стрептолизина О, эритрогенного токсина А, С5а пептидазы, альфа и бета антигена, глутаминсинтетазы ).

Научная новизна исследования

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые для целей молекулярно-генетического анализа стрептококков осуществлены трансформация посредством электропорации, электрофорез в пульсирующем электрическом поле и экспресс - полимеразная цепная реакция. 2. Впервые показано, что гены С5а пептидазы и глутаминсинтетазы представлены в хромосомной ДНК всех исследованных штаммов стрептококков группы В в отличие от генов бета антигена, представленного у 50% штаммов серотипов I и II и практически отсутствующего у штаммов серотипа Ш.

3. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов С5а пептидазы и гена
глутаминсинтетазы стрептококков группы В, а также гена RecA стрептококков группы
А.

4. Впервые проклонированы полноразмерные гены С5а пептидазы и
глутаминсинтетазы СГВ в гетерологичной системе E.coli, в результате чего получены и
проанализированы рекомбинантные белки С5а пептидазы и глутаминсинтетазы
стрептококков группы В.

5. Впервые сконструированы изогенные мутанты стрептококков группы В с
нарушенной экспрессией гена С5а пептидазы и гена глутаминсинтетазы, что позволит
в дальнейшем использовать их для получения приоритетных данных о вкладе этих
белков в формирование вирулентного фенотипа СПВ.

  1. Впервые построены рестрикционная и генетическая карты хромосомы стрептококка группы А серотипа Ml.

  2. Впервые показано, что хромосомные ДНК различных штаммов стрептококков группы А характеризуются высокой степенью полиморфизма рестрикционных фрагментов и в то же время консервативностью порядка расположения генов на хромосоме.

Теоретическое значение исследования.

Данная работа носит теоретический характер. Построение первой генетической карты стрептококка группы А позволило установить взаимное расположение различных генов, в частности генов, относящихся к реализации вирулентного фенотипа. В ходе картирования установлен размер стрептококкового генома, количество рибосомальных оперонов и их относительная локализация. Построение первой генетической карты стрептококка группы А представляет ценность для всех специалистов, занимающихся исследованиями отдельных стрептококковых генов и вопросами регуляции их функций. Выяснено, что стрептококки, одного и того же серотипа характеризуются высокой степенью полиморфизма ресгрикционных фрагментов, определяющих различия в их рестрикционных картах. Это демонстрирует ограниченные возможности современной серологической диагностики. Установлено, что несмотря на наличие рестрикционного полиморфизма у стрептококков различных серотшюв, общая последовательность взаимного расположения генов остается неизменной. Молекулярно- эпидемиологический анализ коллекции штаммов СГА м СГВ различных серотипов позволил установить высокую степень консервативности стрептококковых генов С5а пептидазы и глутаминсинтетазы. Было показано, что ген С5а пептидазы консервативен по структуре как среди штаммов стрептококков группы В, так и группы А, что может указывать на важность С5а пептидазы для выживания и колонизации тканей хозяина стрептококками этих групп. Все это также указывает на эволюционную общность происхождения стрептококков групп А и В или на возможность генетического обмена между стрептококками разных видов.

Обнаружение свойств стрептококковой глутаминсинтетазы, подобных

свойствам поверхностных белков стрептококков, а также выявление способности связывать иммуноглобулины класса А, позволили создать концепцию многофункциональности некоторых белков, паразитирующих микроорганизмов.

Разработка метода генетической трансформации стрептококков посредством злектропорации послужило началом появления ноюго направления анализа функции стрептококковых генов, заключающегося в создании изогенных мутантов с использованием интегративных векторов.

Практическое значение исследования.

Разработанный метод экспресс ПЦР может быть использован для анализа клинических изолятов стрептококков групп А и В как на наличие отдельных генов, так и для эпидемиологического анализа штаммов с использованием метода

случайной затравки. Метод оказался пригодным и для анализа штаммов патогенных
сальмонелл и туберкулезной палочки. Проведенные исследования по клонированию и
экспрессии генов стрептококков в системе кишечной палочки могут быть
использованы в дальнейшем для создания вакцинных препаратов с целью
предупреждения стрептококковых заболеваний. Заложены основы для введения

в практику единого, унифицированного способа молекулярно-эпидемиологического анализа патогенных стрептококков групп А и В. Положения, выносимые на защиту:

1. Стрептококки группы А характеризуются высокой степенью полиморфизма
рестрикционных фрагментов ДНК даже в штаммах, принадлежащих к одному
серотипу поэтому, действующая в настоящее время серологическая классификация
стрептококков может быть существенно дополнена и уточнена
молекулярно-генетическими методами исследования. Одной из причин полиморфизма
являются генетические перестройки, обусловленные интеграцией в геном
стрептококков умеренных бактериофагов.

  1. Общий порядок локализации генов стрептококков группы А на генетических картах хромосом различных штаммов является единым и не зависит от серотипа.

  2. Гены С5а пептидазы и глутаминсинтетазы стрептококков группы В гомологичны генам стрептококков группы А, что является указанием на общность происхождения этих генов.

4. Использованный в работе молекулярно-генетический подход, основанный на
выключении функции отдельно взятого гена стрептококка, за счет интеграции в
структуру этого гена маркера антибиотикорезистентности, является эффективным
способом получения изогенных мутантов для выяснения роли стрептококковых генов
в вирулентности.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1. Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов
исследования (полимеразная цепная реакция, электрофорез в пульсирующем
электрическом поле, секвенирование ДНК, ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и
т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

2. Электрофорез фрагментов ДНК осуществлялся в присутствии адекватных по размеру
ДНК маркеров, а расчет молекулярных весов, образующихся в результате гидролиза
хромосомных ДНК стрептококков различными эндонуклеазами, осуществлялся с
использованием компьютерных программ типа Seqaid.

3. Применением наиболее современных способов компьютерного анализа данных секвенирования микробной ДНК с привлечением таких банков данных как GENBANK, ЕМВО и т.д.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 49 научных статьях, многократно доложены на международных симпозиумах и конференциях ("Генетика и молекулярная биология стрептококков, энтерококков и лактоюкков", Миннеапололис, США, 1991, "Новые направления биотехнологии", Пущино на Оке, 1992, "XII международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям", Санкт-Петербург, Россия, 1993, "Генетика стрептококков энтерококков и лактококков", Сайта Фе, США, 1994, " Биотехнология Санкт-Петербург-94" Санкт-Петербург, 1994, " Новые методы в микробиологии" Кошице, Словакия, "ХШ международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям", Париж, Франция , 1996, на конференции Отделов микробиологии и педиатрии Университета Миннесоты (США), 1996, на заседании Отдела микробиологии и молекулярной биологии института им. Пастера, Париж, (Франция) 1996. Данные работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологаи НИИЭМ РАМН, 1994-1997, и на заседании Ученого Совета НИИЭМ РАМН, 1996.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 210 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 25 рисунками, указатель литературы содержит 284 источника в том числе 12 отечественных и 272 иностранных.