Генотипическая гетерогенность спирохет Borrelia afzelii - одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов [Электронный ресурс] Фадеева Ирина Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Общая характеристика иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) 10

1.1. История изучения возбудителя и заболевания ИКБ 10

1.2. Общая характеристика возбудителя 11

1.2.1.Морфология боррелий 11

1.2.2.Биологические свойства боррелий 13

1.3. Таксономия и видовое разнообразие боррелий, связанных с иксодовыми клещами 14

1.4. Эпидемиология ИКБ 17

1.5. Патогенез 20

1.6. Клиника 22

1.7. Лабораторная диагностика 24

ГЛАВА 2. Структура генома боррелий и его отличия у разных геновидов 27

2.1. Особенности строения генома 27

2.2. rRNA - гены 29

2.3. Гены, контролирующие основные поверхностные белки, и их экспрессия 30

2.4. Ген, кодирующий белок Р66, его структура и вариабельность 33

2.5. Важнейшие поверхностные белки боррелий 34

2.5.1 Osp-семейство 34

2.5.2 VlsE белок 36

2.5.3 Интегральный поверхностный белок Р66 39

2.5.4 Топологические и функциональные взаимоотношения между белками поверхностной

мембраны 41

2.6. Внутрипопуляционная генотипическая гетерогенность боррелий. 43

ГЛАВА 3. Материалы и методы 46

3.1. Изоляты и бактериальные термолизаты 46

3.2. Амплификация вариабельного спейсерного региона 5S-23S 51

3.3. Амплификация участка гена, кодирующего белок Р66 52

3.4. Дополнительная идентификация изолятов методом ПЦР -ПДРФ 53

3.5. Секвенирование ампликонов спейсерного региона 5S-23S 54

3.6. Секвенирование участка гена, кодирующего белок Р66 54

3.7. Материалы и методы эпидемиологического анализа 56

ГЛАВА 4. Генетические варианты borrelia afzelii, выявленные на основании секвенирования спейсера 5S-23S 58

ГЛАВА 5. Аллельные варианты borrelia afzelii, выявленные на основании секвестрования хромосомного гена РББ 68

ГЛАВА 6. Гетерогенность боррелий, циркулирующих в природном очаге среднего урала (пермский край) 75

6.1 Краткая характеристика природного очага 75

6.2 Гетерогенность Borrelia afzelii 11

ГЛАВА 7. Клинико-эпидемиологическая характеристика иксодовых клещевых боррелиозов в пермском крае 84

7.1. Доля Иксодовых клещевых боррелиозов в структуре официально регистрируемой инфекционной заболеваемости 84

7.2. Проявления эпидемического процесса иксодовых клещевых боррелиозов 86

7.3. Оценка основных факторов риска заражения иксодовыми клещевыми боррелиозами 90

7.4. Разнообразие клинических проявлений ИКБ 93

Заключение 95

Выводы 97

Список литературы 99

• Таксономия и видовое разнообразие боррелий, связанных с иксодовыми клещами
• Гены, контролирующие основные поверхностные белки, и их экспрессия
• Секвенирование участка гена, кодирующего белок Р66
• Аллельные варианты borrelia afzelii, выявленные на основании секвестрования хромосомного гена РББ

Введение к работе

Актуальность проблемы

Заболевания, вызванные Borrelia burgdorferi sensu lato впервые серологически верифицированы в России в 1985 году [31]. Вскоре было показано, что природные очаги инфекций этой группы широко распространены в лесной зоне страны от Прибалтики на западе до Южного Сахалина - на востоке. Стало ясно, что в пределах России находится значительная или даже большая часть мирового ареала боррелий, связанных с иксодовыми клещами [34, 170, 180], а их разнообразие на этой обширной и экологически очень разнородной территории должно быть значительным.

В России и на сопредельных территориях основное эпидемическое значение имеют B.afzelii и В. garinii, которым свойствен обширный ареал в пределах лесной зоны [184]. Таким образом, В. afzelii - один из двух важнейших возбудителей ИКБ в умеренном климатическом поясе.

Переносчики боррелий - клещи рода Ixodes, что было показано путем выделения возбудителя [29, 230, 242, 243, 271]. На большей части лесной зоны Евразии основной эпидемически значимый переносчик В. afzelii, как и других патогенных боррелий В. burgdorferi sensu lato, - таежный клещ (Ixodes persulcatus Sch.). Клещ Ixodes ricinus L. - основной переносчик боррелий в большей части Европы. Дополнительным переносчиком, который во многих природных очагах принимает участие в циркуляции этих спирохет, может быть клещ I. trianguliceps Bir. Круг резервуарных хозяев представлен многими видами мелких млекопитающих. [184, 242]

К моменту начала нашей работы было известно, что геновид B.afzelii делится на две генетические группы:VS461 [229] и NT28 [203]. Недавно на основании секвенирования спейсерного участка генома 16S описано несколько генетических вариантов этого возбудителя [100].

Вместе с тем, исследования последних лет свидетельствуют о различиях в структуре хромосомного гена рбб у разных видов Borrelia burgdorferi sensu lato [87, 100, 103], которые отражаются, в частности, в возникновении специфических антител к соответствующему белку [101]. Упомянутые работы посвящены в основном видовым различиям, а внутривидовая гетерогенность по этому признаку практически не изучена. Кроме того, в последнее время появился ряд публикаций, свидетельствующих о том, что среди спирохет, отнесенных ранее к В. afzelii, обнаруживаются изоляты, которые по результатам секвенирования отдельных участков генома отличаются от классических В. afzelii и могут быть в дальнейшем отнесены к самостоятельным геновидам.[49, 201, 236, 272]. Более того, работы зарубежных коллег указывают, что реинфекция при иксодовом клещевом боррелиозе возникает при инфицировании различными штаммами возбудителя одного и того же геновида, что может свидетельствовать о высокой значимости изучения внутривидовой гетерогенности возбудителя [141].

Поскольку В. afzelii широко распространена, имеет разнообразный круг резервуарных хозяев и переносчиков и циркулирует в различных экосистемах, мы исходили из возможности его внутривидовой гетерогенности и вероятности существования различных геновариантов, которая, как и у других возбудителей ИКБ, слабо изучена, но может отражаться на степени патогенносте возбудителя и на клинической картине заболевания.

Цель исследования.

Изучить генотипическую гетерогенность и выявить внутривидовые варианты спирохет В. afzelii, циркулирующих в природных очагах России и сопредельных стран.

Задачи исследования.

1. На основании сравнения нуклеотидных последовательностей спейсера 5S-23S у изолятов В. afzelii выявить генотипическую гетерогенность этого возбудителя и изучить его внутривидовую таксономию.

2. Изучить возможную внутривидовую вариабельность гена, кодирующего белок Р66 у спирохет В. afzelii.

3. На примере В. afzelii изучить естественную генотипическую струїоуру популяции возбудителя ИКБ, циркулирующих в пределах одного природного очага.

4. На примере Пермского края изучить особенности эпидемического проявления природных очагов ИКБ, в которых циркулируют различные внутривидовые варианты возбудителей.

Научная новизна исследования.

Впервые выявлена значительная внутривидовая генотипическая гетерогенность боррелий В. afzelii, циркулирующих в пределах ареала этого возбудителя и обосновано существование новой внутривидовой таксономической категории боррелий - «геновариант». Показано, что каждая из двух известных генетических подгрупп В. afzelii, включает несколько геновариантов: VS461 - 7 геновариантов, NT28 - 3. Распространение большинства из них, по всей видимости, не связано с ареалом определённого вида переносчика или резервуарного хозяина.

Впервые установлены различия в структуре хромосомного гена рбб у изолятов одного геновида боррелий, и по этому признаку выделено 7 аллельных вариантов В.afzelii. При этом не обнаружено связи конкретного аллельного варианта с определенным видом переносчиков или резерву арных хозяев.

Впервые на примере B.afzelii изучена естественная структура популяции возбудителя ИКБ, что даёт новые представления об эпизоотологии и эпидемиологии инфекций этой группы.

Практическая значимость.

Выявленные аллельные варианты могут иметь значение в этиологии и патогенезе ИКБ.

Нуклеотидные последовательности спейсера 5S-23S 31-го изолята и участков гена рбб 23-х изолятов В. afzelii депонированы в GenBank. Полученные материалы используются в курсе лекций кафедры Тропических инфекций Российской Медицинской Академии последипломного образования Министерства здравоохранения и соцразвития РФ, и кафедры Инфекционных болезней Пермской Государственной Медицинской Академии.

І Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 12 работ.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», четырёх глав исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 62 отечественных и 226 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 13 рисунками.

Благодарности

Диссертация выполнялась при консультативном содействии специалистов отдела переносчиков инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Н.Б. Гореловой, Ю.В. Ковалевского, В.В. Нефёдовой) и

ООО «Омникс», Санкт-Петербург, (В.Н. Куликова, А.Л. Маркова, Ю.В. Андрейчука), которым я хочу выразить глубокую благодарность.

Отдельно благодарю рецензентов: А.П. Самсонову и В.Н. Башкирова. Особую благодарность выражаю моим научным руководителям профессору Э.И. Коренбергу и доктору медицинских наук И.А.Шагиняну

Таксономия и видовое разнообразие боррелий, связанных с иксодовыми клещами

В начале XX столетия бактерии рода Borrelia привлекли пристальное внимание исследователей, так как с ними связывали возникновение эпидемий так называемых возвратных тифов или рекуррентных лихорадок человека, которые теперь принято называть боррелиозами [25, 230].

Хотя ещё в конце 19 века были описаны некоторые кожные «заболевания», связанные с укусом клеща [225], основоположником изучения клинических проявлений клещевого боррелиоза можно считать Dr. A. Afzelius, который впервые описал мигрирующую эритему [65]. Позднее, в 1920-х гг были описаны неврологические симптомы этого заболевания [134]. Серьёзные эпидемиологические исследования были начаты в середине 70-х гг XX века из-за частых вспышек заболеваний неизвестной этиологии у детей городка Лайма, штат Коннектикут, протекавших по типу ювенального ревматоидного артрита в сочетании с кольцевидной мигрирующей эритемой, при этом этом уровень заболеваемости в 100 раз превышал официально регистрируемый показатель заболеваемости артритом [257 - 259]. Тогда же было установлено, что болезнь Лайма в США и хроническая мигрирующая эритема в Европе - это одно заболевание [219], впервые упомянутое как болезнь Лайма (БЛ) [257].

Несмотря на то, что клинические симптомы заболевания были известны с конца 19 века, только в 1982 году из клещей Ixodes dammini был выделен неизвестный ранее этиологический агент [105, 165], что стало практически сенсационным открытием, т.к. вплоть до этого времени существовали четко сформулированные представления, что иксодовые клещи не являются переносчиками патогенных для человека боррелий [26]. В дальнейшем этот же возбудитель был выделен из крови, биоптатов кожи, спинномозговой жидкости больных людей [90, 257]. Спирохета была идентифицирована, как новый вид боррелий и названа Borrelia burgdorferi sp.nov. в честь Willy Burgdorfer, её первооткрывателя [165].

В России клинические проявления заболевания были описаны ещё в начале XX века под разными названиями - идиопатическая приобретённая атрофия кожи, самостоятельная атрофия кожи и т.д. [50 - 52]. До начала 80-х годов это были самостоятельные нозологические единицы. Но целенаправленное изучение боррелиозов, передающихся иксодовыми клещами, началось в 1984 году, сразу после выделения боррелий у клеща Ixodes ricinus в Европе [104] и установления, что этиологический агент болезни Лайма (БЛ) - это новый вид боррелий Borrelia burgdorferi sp.nov. [165] Первые, серологически подтверждённые случаи, клещевых боррелиозов описаны в России в 1986 г. [31]. По мере улучшения диагностики показатели заболеваемости приближались к прогнозируемой российскими специалистами величине [180], и неуклонно обгоняли уровень заболеваемости клещевым энцефалитом. От клещей Ixodes ricinus и Ixodes persulcatus были получены и серотипированы первые российские изоляты Borrelia burgdorferi sensu lato [36, 38, 39]. Был создан музей боррелий лаборатории переносчиков инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва) [12], насчитывающему к настоящему времени более 1000 первичных изолятов. Многие из них были использованы зарубежными и отечественными исследователями для изучения генетической структуры, таксономии и филогении боррелий [76, 229].

Боррелий - микроорганизмы в форме завитка или волны, имеющие все ультраструктурные черты бактерий порядка Spirochaetales [84, 137, 138]. Длина боррелий достигает 30 мкм и зависит от многих факторов, в том числе от условий культивирования. Она увеличивается, например, во время стационарной фазы роста [84, 137, 157, 260].

Структурно боррелий состоят из тонкой внешней мембраны вокруг протоплазматического цилиндра, который включает слой пептидогликана, цитоплазматическую (внутреннюю) мембрану и периплазматическое пространство.

Для поверхностного аморфного мукоидного слоя (S-слой толщиной 2-10 нм) характерен высокий уровень нестабильности и лёгкость отделения от поверхностной мембраны [219], которая, в свою очередь, имеет трёхслойное строение, обычное для цитоплазматических мембран [64, 157, 158]. Высокая гибкость и текучесть - это характерная черта, отличающая мембрану боррелий от мембран других микроорганизмов [156]. Внутренняя мембрана покрывает протоплазматический цилиндр, состоящий из пептидогликан-цитоплазматического мембранного комплекса (нуклеоплазма, рибосомы, нуклеиновые кислоты) и органелл движения - эндофлагелл, придающих микроорганизму его извитую форму [219, 241]. Периплазматические эндофлагеллы расположены субтерминально и биполярно, их количество достигает 7-20 и зависит от геновида боррелий и условий культивирования [157, 260]. Отмечена корреляция между уменьшением числа флагелл и снижением инвазивности боррелий [84, 158, 247]. Так же, потеря флагелл приводит к изменению формы микроорганизма [210]. Подвижность боррелий обеспечивается сокращением флагеллиновых комплексов приводящим к ассиметричным круговым движениям пучков фибрилл, независимым от хемотаксиса [84]. Фибрилла структурно представлена флагеллиновой нитью, флагеллиновым крючком и базальным диском [275].

В цитоплазме боррелий так же наблюдаются большие отличия от других бактериальных клеток. Везикулы - «пузыри» и «почки» - представляют собой результат выпячивания внешней трёхслойной, наружной и протоплазматической мембран. Считается, что их роль заключается в обмене генетическим материалом, поддержании жизнеспособности и вирулентности клеток.

Боррелии - это микро-аэрофильные [174, 187], облигатные паразиты, медленно растущие на питательных средах. В противоположность анаэробным трепонемам, боррелии нечувствительны к метронидазолу [166], содержат супероксид-дисмутазу, и характеризуются отсутствием каталазы или пероксидазы [74]. Лучше они растут на жидких питательных средах [95] при 30-35 С; их концентрация доходит до 10-10 на мл. При росте на твёрдой питательной среде, боррелии дают заглублённые (подповерхностные) колонии без особых отличительных характеристик. Для роста Borrelia spp. в среде должны присутствовать насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, глюкоза и аминокислоты [95, 174, 261]. В среду таюке добавляются сывороточные белки, например, бычий или кроличий сывороточный альбумин, которые представляют собой источники жирных кислот [81, 186, 166, 200]. Боррелии не способны окислять или удлинять цепочку жирных кислот, но используют их для включения в состав клеточных липидов [200]. Холестерин также встраивается в клеточные липиды. Причем, конечный продукт -холестеролгликозид, синтезируется при участии глюкозы [200]. Углеводы, в частности глюкоза, служат источником энергии и конечного продукта метаболизма - молочной кислоты [164, 200, 228].

Гены, контролирующие основные поверхностные белки, и их экспрессия

Смена условий окружающей среды, предположительно, - один из важных факторов, способствующих изменению экспрессии генов. С началом кормления клеща возникают связанные с этим изменения его внутренней среды: скачок температуры, колебания рН, возникновение контакта с факторами хозяина. Все это изменяет регуляцию генов, таких как ospC, erps, mlp-семейство генов, rev, bba64 и других. Наиболее хорошо изучены такие факторы, как температура и рН. Гены, подверженные воздействию этих факторов относятся к группе, регулирующей перенос спирохет в слюнные железы и передачу их млекопитающему-хозяину, а также гены, кодирующие антигены, ответственные за начальный контакт с иммунной системой хозяина (в частности, за контакт с комплементом). Повышение выработки OspC при повышении температуры было хорошо изучено in vitro, а также в клещах в начале их кормления [69,140].

Экспрессия семейства генов, известного как erps, также подвержено воздействию таких факторов, как температура и рН. Так, уровень выработки белков, кодируемых этими генами, повышен во время кормления клещей, что, возможно, способствует подготовке спирохет к воздействию на них факторов иммунитета. Erps - белки участвуют в формировании инфекции у хозяина благодаря блокирования его системы комплемента. Спирохеты способны вырабатывать различные Eros на своей поверхности, и каждый из них обладает определённым потенциалом воздействия на иммунную систему хозяина. Таким образом, совокупность разнообразных Erps на мембране помогает спирохетам избежать воздействия системы комплемента, которая имеется у широкого круга хозяев [221]

Интересную группу представляют собой гены семейства, представленного р35 (ЬЬа64). Экспрессия некоторых представителей этого семейства увеличивается с увеличением рН, которое может быть связано с попаданием спирохет в организм млекопитающего [69]

Важным фактором, влияющим на экспрессию некоторых поверхностных белков, является гуморальный иммунный ответ против В.burgdorferi. Антитела, имеющиеся в сыворотке, вызывают снижение выработки некоторых поверхностных белков. К генам, кодирующим белки, которые являются целью антитело-зависимой системы комплимента, относятся bmpA, bmpB, bmpC, bmpD гены. Гены bmpA, bmpB, bmpC расположены на хромосоме. Более того, ЬтрА и ЬтрВ располагаются смежно друг с другом, а местоположение bmpC находится выше ЬтрА [245]. Внутри локуса эти четыре гена располагаются в следующем порядке: brapD - bmpC - bmpA - bmpB. Известно, что bmpD экспрессируется независимо, а транскрипция остальных трех остается неизученной. Гены группы bmps примерно одинаковы по размеру (за исключением bmpC), они достаточно похожи друг на друга по результатам секвенирования, и имеют одинаковую, хромосомальную, локализацию. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что bmp-гены представляют собой одно семейство. В отличие от генов таких поверхностных белков как OspA, OspB и OspC, которые демонстрируют значительные различия результатов секвенирования среди различных штаммов, последовательность bmp сильно не варьирует у разных штаммов боррелий [235].

Способность спирохет избегать воздействия антител характеризует потенциал патогенности возбудителя. Рекомбинация и снижение выработки поверхностных белков играют основную роль в выживании бактерий в организме резервуарного хозяина [69].

Экспрессия некоторых генов не подвержена регуляции факторами окружающей среды и воздействию иммунной системы, но в то же время, она несколько изменяется в процессе жизненного цикла спирохет. Очень мало известно о факторах, воздействующих на рекомбинацию vis локуса. Изменения температуры не влияют на изменения экспрессии этого гена, хотя in vivo они происходят на 4 день после начала заболевания, и не происходят in vitro. Это свидетельствует о том, что факторы, изменяющие экспрессию, связаны с хозяином [69]. Для обеспечения длительной персистенции в организме хозяина В.burgdorferi обладает способностью модулировать широкий спектр цитокинов, таких как TNF - альфа, IFN -гамма, EL-6, IL-12. IFN-гамма является медиатором, способствующим рекомбинации vls-локуса, которая приводит к формированию новой популяции спирохет, способной избежать воздействия иммунного ответа [221]. Другие белки, выработка которых не подвержена воздействию средовых факторов или подвержена частично, представлены OspC и ЕгрР21 [69].

Представляется очевидным, что геном В.burgdorferi уникален также из-за большого количества генов, кодирующих липопротеины. OspA и OspB-гомологичные белки, гены которых экспрессируются совместно в большом количестве. OspC, белок гомологичный Vsp протеинам боррелий, вызывающих АКБ, вырабатывается клещами после кормления и на начальных этапах инфекции у млекопитающих. OspC также экспрессируется в культуре спирохет, потерявших плазмиды, включая большую линейную плазмиду, несущую ospAB оперон. OspD -белок,вырабатывающийся в больших количествах, когда прекратилась или снизилась экспрессия OspA. Такие поверхностные белки как OspE и OspF экспрессируются в гораздо меньших количествах, чем другие протеины [97].

Ген рбб локализован на хромосоме боррелий [87]. Изучение нуклеотидных последовательностей гена рбб выявило наличие открытой рамки считывания из 1854, 1857 и 1863 нуклеотидов[103].

Исследованиями последних лет установлено, что у разных видов Borrelia burgdorferi sensu lato структура хромосомного гена рбб имеет ряд особенностей [87, 101, 213]. Сравнение участков гена рбб различных геновидов выявило только 92-94% сходства этих геновидов. Это определяет, в частности, качественные различия антител, возникающих у макроорганизма к соответствующему белку [103, см. также раздел 2.5.3], Данный феномен, возможно, будет в дальнейшем иметь некоторое клинико-диагностическое значение. Именно по этой причине внутривидовая вариабельность гена, кодирующего белок Р66, стала объектом наших исследований.

Секвенирование участка гена, кодирующего белок Р66

Тюменская область, Приморский край), есть основания полагать, что данный генетический вариант подгруппы VS461 В. afzelii может встречаться в природных очагах ИКБ по меньшей мере от Восточной Европы до Дальнего Востока.

Во второй геновариант генетической подгруппы VS461 вошли 38 изолятов, выделенные в разных регионах Евразии (от Южной Моравии на западе до Южного Сахалина на востоке). Их хозяевами (в отличие от описанного выше изолятов) оказались оба основных переносчика боррелий - клещи 7. persulcatus и I. ricinus, паразит мелких лесных млекопитающих - клещ I. trianguliceps, а также сами зверьки трех видов (Cl.glareolus, Cl.rutilus, A.uralensis) - широко распространенные резервуарные хозяева спирохет. Последовательности нуклеотидов 8 изолятов этого геноварианта (от разных видов клещей и грызунов) депонированы нами в GenBank (рис. 1, № 2). На основании выравнивания многочисленных нуклеотидных последовательностей, ампликон D-3 (AF497982, Чехия) отнесен к данному геноварианту. Данный геновариант генетической подгруппы VS461, по всей видимости, имеет наиболее широкое географическое распространение и характерен для большинства природных очагов ИКБ, в которых циркулирует В. afzelii.

Следующий генетический вариант представлен в нашем материале всего тремя изолятами от клещей I. ricinus из Калининградской и Ленинградской областей, а также из Белоруссии (рис.1, № 3). По информации EMBL/GenBank/DDBJ изоляты с аналогичными последовательностями нуклеотидов межгенного спейсера обнаружены значительно восточнее, причем не только в Европе (АВ178342, АВ178343), но и в Азии (АВ013913, АВ03914): в Московской области (выделены от клещей /. ricinus и /. persulcatus) и в Корее (выделены от клещей /. granulatus и /. nipponensis). Это дает основание полагать, что данный геновариант, видимо, таюке широко распространен в пределах ареала подгруппы VS461 В. afzelii, хотя встречается в природных очагах реже, чем предыдущий.

Несколько изолятов четвертого генетического варианта этой подгруппы (рис.1, № 4), выделенные от клещей /. ricinus, обнаружены пока только на юго-западе России (Ставропольский и Краснодарский края). В базах данных EMBL/GenBank/DDBJ отсутствуют сведения об изолятах с аналогичной (сходство более 99,6%) нуклеотидной последовательностью рассматриваемого участка генома. Не оказалось их и в нашем довольно обширном материале из других регионов. Не исключено, что данный генетического вариант в основном приурочен к южной части ареала подгруппы VS461.

Все 15 изолятов пятого геноварианта выделены в западной части ареала возбудителя от клещей /. ricinus. Три представителя с аналогичными последовательностями нуклеотидов из EMBL/GenBank/DDBJ были также выделены от этого переносчика в Центральном регионе России (Москва) и в Турции (рис.1, № 5). Кроме того, к этому же геноварианту мы отнесли изолят Ir-335, имеющий 100% сходство с изолятом из GenBank , выделенным в Московской области от клеща /. ricinus.

Шестой геновариант боррелий подгруппы VS461 представлен в нашем материале только 1 изолятом из 139 исследованных. Это хорошо известный 1р-21 выделенный от таежного клеща в Ленинградской области [39], который, в частности, был использован при первоописании геновида В. afzelii [76] и уже многие годы служит в России продуцентом стандартного корпускулярного антигена для непрямой реакции иммунофлуоресценции. EMBL/GenBank/DDBJ содержит информацию о последовательности нуклеотидов секвенированного нами спейсера (AY573192). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей спейсера этого изолята с последовательностями, депонированными в GenBank свидетельствует, что этот геновариант распространен как в западной, так и в восточной частях ареала В. afzelii (рис.1, № 6) и имеет разнообразный набор переносчиков и резервуарных хозяев.

Не менее широкое географическое распространение среди различных хозяев имеет еще один генетический вариант боррелий подгруппы VS461, изоляты которого по результатам их секвенирования образуют на дендрограмме четко выраженный отдельный кластер (рис. 1, № 7). Эти изоляты были выделены от клещей /. persulcatus и I. ricinus, а также от полёвки-экономки (М oeconomus) и обыкновенной бурозубки (S. araneus).

Спирохеты В. afzelii генетической подгруппы NT28 были изолированны в Калининградской, Ленинградской и Пермской областях, Краснодарском и Ставропольском краях России, в Эстонии, Молдове и Белоруссии. Боррелий, относящиеся к этой подгруппе в целом, скорее всего также распространены во многих природных очагах ИКБ. Изоляты от клеща /. ricinus по результатам анализа нуклеотидных последовательностей образуют на дендрограмме два хорошо выраженные отдельные кластера (рис.1, №№ 8 и 9). Сходство представителей этих генетических вариантов, которые по имеющимся данным выглядят более «западными», составляет с В.afzelii NT28 - от 98,8 до 99,6%, а с В. afzelii VS461 - только 97,1-98,0%. Однако, изоляты одного из этих вариантов (рис.1, № 9) имеют до 99,2 % сходства с изолятам 934U, выделенными в Корее [204], который, тем не менее, имеет ПДРФ - профиль, сходный с В. afzelii VS461. Поэтому не исключено, что дальнейшее накопление данных выявит его более широкое евразийское распространение. Третий генетический вариант подгруппы В. afzelii NT28 образовывали изоляты, полученные как в «рицинусных», так и в «персулькатусных» природных очагах ИКБ (рис.1, № 10). Их сходство по изучавшемуся генетическому признаку с типовыми В. afzelii NT28 составляло от 98,4 - 99,2%, а с VS461 всего 96,7 - 97,6%.

Выявленные нами генетические варианты боррелий показали, что в структуре спейсера 5S - 23S некоторых из них имеются отличия. Мы приняли во внимание, что в последнее время среди спирохет, отнесенных ранее к В. afzelii, обнаружены изоляты, которые по результатам секвенирования консервативных участков генома существенно отличаются от классических В. afzelii и, по мнению некоторых исследователей [119, 271, 273], могут быть отнесены к новым самостоятельным геновидам. Кроме того, секвенирование представляет собой достаточно трудоёмкий и дорогостоящий способ выявления внутривидовой гетерогенности боррелий. Поэтому мы решили проверить возможно ли идентифицировать различные геноварианты B.afzelii по характеру рестрикционного профиля различных изолятов этого возбудителя. С этой целью методом ПЦР-ПДРФ проведена повторная идентификация всех обнаруженных геновариантов. Были отобраны по одному изоляту каждого из них, и недавно описанный геновид В .spielmani [119, 271, 273], обнаруженный среди изолятов нашего музея [49]. Рестрикционный профиль этого геновида наиболее близок к профилю B.afzelii, и поэтому до недавнего времени его не выделяли как самостоятельный.

Аллельные варианты borrelia afzelii, выявленные на основании секвестрования хромосомного гена РББ

Несмотря на однообразие основных черт эпидемиологии ИКБ, вызванного различными геновидами В.burgdorferi s.l. в России, клинические проявления характеризуются выраженным полиморфизмом.

Заболевание характеризуется появлением на 9-16 день болезни основного патогномоничного признака - мигрирующей эритемы. У 18,9% больных наблюдается изолированная МЭ, а у 81,1% кожные поражения сопровождаются признаками общеинфекционного синдрома (лихорадка, озноб, слабость и недомогание, головная боль, миалгии, артралгии, тошнота, рвота) [8]. Так же встречаются безэритемные формы ИКБ.

Вследствие диссеминации инфекции на фоне кожных поражений, сопровождающихся токсико-инфекционными проявлениями, у пациентов установлены разнообразные нарушения со стороны внутренних органов: сердечно-сосудистой системы, печени, нервной системы. При этом не всегда кожные поражения имеют типичное течение в виде гомогенной или кольцевидной эритемы в месте присасывания клеща. У 4,6 % больных возникают атипичные формы: с появлением везикул, пустул и геморрагии в области эритемы. Поражение сердечно-сосудистой системы обычно проявляется возникновением кардиалгии, сердцебиений, артериальной гипертензии, поражение печени - развитием безжелтушного гепатита. Это наиболее типичное проявление иксодового клещевого боррелиоза на этой территории, частота проявлений которого составляет 65,1% Вовлечение в патологический процесс нервной системы может происходить на ранних стадиях заболевания. Наиболее характерно многоуровневое поражение, которое охватывает различные отделы как центральной, так и периферической нервной системы. В 3% случаев это выражается в развитии мягкотекущего [8] энцефалита с поражением полушарий и ствола головного мозга, а также различных мононевропатий с более частым поражением лицевого нерва. Выявлены случаи сочетанного поражения центральной и периферической нервной системы в виде энцефаломиелита с сегментарными радикуло-невритическими расстройствами и развитием серозного менингита. Такая разная частота клинических проявлений заболевания может быть связана с различными причинами: наличием разных геновидов возбудителя или их микстов, особенностями иммунной защиты макроорганизма, разной дозой возбудителя. Наряду со всем перечисленным, возможно, влияние на частоту клинических проявлений оказывает наличие на одной территории большого разнообразия генотипов одного вида возбудителя. Впервые в России на основании изучения обширного материала выявлена внутривидовая генотипическая гетерогенность В. afzelii. При этом в ходе работы изучено всего два участка генома возбудителя.

Мы ориентировались на исследование спейсерного участка гена rrf - rrl (5S - 23S) отобранных для работы изолятов В. afzelii. Это объясняется тем, что нуклеотидные последовательности rrf - rrl (5 S - 23 S) спейсера имеют таксономическое значение, и их изучение позволяет выявить внутри вида различные геновариаты (внутривидовые варианты).

Мы также исходили из того, что выделение и культивирование изученных музейных изолятов проводилось на жидкой среде BSK-II. Между тем, известно, что плазмиды, на которых находится значительная часть генов боррелий, кодирующих многие поверхностные белки, могут при пересеве утрачиваться. Поэтому мы ориентировались на исследование хромосомных генов, кодирующих белки. Среди них наиболее перспективным для изучения оказался ген, кодирующий белок Р66. Этот белок изменчив и у разных видов боррелий имеет отличия, локализованные, главным образом, в поверхностно расположенной концевой петле. Геновидовая изменчивость белка Р66 отражается в антительном ответе, и, следовательно, не исключено, что различные аллельные варианты возбудителя вызывают различные клинические проявления. Вместе с тем, вариабельность кодирующего гена, как одна из причин изменчивости белка Р66, практически не изучена.

Нами выявлены 10 различных внутривидовых вариантов Borrelia afzelii. Большинство из них не имеет четкой географической приуроченности. Показано, что в пределах одного природного очага, расположенного в Восточной Европе среди различных переносчиков и резервуарных хозяев одновременно циркулируют не менее 5 таких геновариантов. Выявлено 7 аллеловариантов по гену, кодирующему белок Р66, в пределах ареала Borrelia afzelii и 5 - в пределах одного природного очага. Один и тот же рбб-геновариант встречается у разных внутривидовых вариантов Borrelia afzelii, и, следовательно, не определяется ими.

Один и тот же вариант гена рбб, как в пределах всего ареала, так и в пределах одного природного очага, как и большинство геновариантов по спейсеру 5S-23S, встречается у различных видов переносчиков и резервуарных хозяев. С другой стороны, определенный вид переносчика или носителя может быть хозяином нескольких различных геновариантов Borrelia afzelii, как по спейсеру 5S-23S RNA, так и по гену, кодирующему белок Р66.

В целом не прослеживается чёткая связь между определенным переносчиком или резервуарным хозяином и тем или иным гено-/аллельным вариантом боррелий: разные виды клещей и мелких млекопитающих могут быть хозяевами нескольких внутривидовых вариантов спирохет.

Наши данные подтверждают свидетельства значительного генотипического разнообразия различных видов боррелий [118, 120, 213]. В его основе, по всей видимости, лежит клональная изменчивость боррелий [69, 123, 221] и последующая судьба клонов при их циркуляции в природном очаге. Экологический смысл этого явления заключается в том, что гетерогенность микроорганизмов обеспечивает устойчивость образованной ими паразитарной системы и, в частности, их выживание при взаимодействии с разнообразными резервуарными хозяевами и переносчиками [254].

Похожие диссертации на Генотипическая гетерогенность спирохет Borrelia afzelii - одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов [Электронный ресурс]

Изучение антигенной структуры поверхностного белка А (OspA) спирохеты Borrelia burgdorferi как основа для разработки новых иммунохимических методов диагностики болезни ЛаймаСадыкбекова Роза Куанышкалиевна

Эпидемиологическая и клинико-морфологическая характеристика гепатитов B и C и гетерогенность их возбудителей в Республике Саха (Якутия)Индеева Любовь Дмитриевна