Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гетерогенные биокатализаторы трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот .21
1.1. Метаболизм нитрилов у микроорганизмов 27
1.2. Биокаталитическое получение амидов и карбоновых кислот из нитрилов 40
1.3. Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий для целей биокатализа и биодеградации .45
1.4. Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов 60
1.5. Физиология иммобилизованных микроорганизмов 75
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Бактериальные штаммы и среды культивирования 86
2.2. Условия культивирования бактерий в жидких питательных средах и определение ростовых характеристик .87
2.3. Культивирование бактерий в присутствии носителей 87
2.4. Носители для иммобилизации бактериальных клеток и ферментов 88
2.5. Определение гидрофобности поверхности носителей и бактериальных клеток 94
2.6. Реактивы 94
2.7. Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы .95
2.8. Определение массы адгезированных бактериальных клеток 96
2.9. Определение операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов 97
2.10. Получение белкового препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов 97
2.11. Иммобилизация ферментов 99
2.12. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых свободными и иммобилизованными ферментами .100
2.13. Определение констант термоинактивации свободных и иммобилизованных ферментов .101
2.14. Определение рН- и температурного оптимумов активности свободных и иммобилизованных ферментов 102
2.15. Определение концентрации АТФ в бактериальных клетках биолюминесцентным методом .103
2.16. Оценка биопленкообразования .105
2.17. Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография 106
2.18. Микроскопия .110
2.19. Статистическая обработка .112
ГЛАВА 3. Биокатализ нитрилов и амидов карбоновых кислот адгезированными бактериальными клетками 113
3.1. Адгезия бактериальных клеток на носителях 113
3.1.1. Взаимодействие бактериальных клеток с многослойными углеродными нанотрубками 124
3.2. Свойства углеродсодержащих носителей 127
3.2.1. Адсорбция нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях 133
3.3. Трансформация алифатических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий 135
3.3.1. Влияние адгезии клеток нитрилгидролизующих бактерий на их ферментативную активность .136
3.3.2. Операционная стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий 146
3.4. Трансформация ароматических нитрилов и амидов
адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий 158
3.5. Гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе бактериальных клеток, агрегированных с нанотрубками .168
3.6. Стереоселективная трансформация нитрилов и амидов
адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий 171
ГЛАВА 4. Биокатализ нитрилов и амидов карбоновых кислот биопленками нитрилгидролизующих бактерий .179
4.1. Визуализация биопленок нитрилгидролизующих бактерий 179
4.2. Динамика роста биопленок нитрилгидролизующих бактерий 182
4.3. Влияние адгезии нитрилгидролизующих бактерий на содержание внутриклеточного АТФ 185
4.4. Трансформация алифатических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий 190
4.5. Трансформация ароматических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий 192
4.6. Влияние токсичных субстратов и продуктов реакции гидролиза нитрилов на концентрацию внутриклеточного АТФ и жизнеспособность клеток биопленок R. ruber gt1 и P. fluorescens С2. 194
4.7. Смешанные биопленки нитрилутилизирующих бактерий 200
ГЛАВА 5. Гетерогенные биокатализаторы трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе иммобилизованных бактериальных ферментов метаболизма нитрилов 207
5.1. Трансформация акрилонитрила иммобилизованными ферментами гидролиза нитрилов 207
5.1.1. Гидратация акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилгидратазу .207
5.1.2. Гидратация акрилонитрила нитрилгидратазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном .215
5.1.3. Гидролиз акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу 226
5.1.4. Гидролиз акрилонитрила ковалентно иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу 234
5.2. Гидролиз акриламида иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими амидазу 238
5.3. Стереоселективный гидролиз рацемического лактамида иммобилизованной амидазой 244
Заключение .252
Выводы 274
Списокпринятыхсокращений 277
Список литературы
- Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов
- Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы
- Адсорбция нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях
- Трансформация ароматических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий
Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов
Возникновение микробиологии как науки связано с выделением микроорганизмов в чистую культуру, что позволило идентифицировать и детально изучать физиологические, биохимические и генетические свойства представителей этого царства живой природы. При этом изучение основных физиологических параметров проводилось на суспензионных культурах в замкнутых резервуарах при периодическом культивировании с истощением субстратов роста, либо при непрерывном культивировании с постоянной подачей питательных веществ и оттоком культуральной жидкости. Подобное суспензионное состояние дает возможность изучить закономерности роста культур микроорганизмов в сопоставлении с биохимическими процессами, лежащими в их основе [17]. Но подобные условия являются лишь экспериментальными и не отражают реальных условий существования микроорганизмов в природе. Как практически невозможно встретить чистые культуры микроорганизмов в природных условиях, за исключением ограниченного числа экстремальных биотопов, так не существует и бактериальных суспензий в естественной среде обитания. В конце XX века сформировалось представление о прикрепленном способе существования микроорганизмов, а в микробиологии закрепился термин «биопленка», означающий формирующееся на поверхности раздела фаз сообщество микроорганизмов, в котором клетки заключены во внеклеточный полимерный матрикс [38, 209]. Огромное количество современных исследований, посвещенных биопленкам, говорит о качественно новом уровне в развитии микробиологии, когда в эксперименте делаются попытки воссоздать естественное, природное состояние микроорганизма
В биотехнологии в середине XX века также возрос интерес к использованию прикрепленных (иммобилизованных) клеток микроорганизмов. В производственном процессе иммобилизация клеток микроорганизмов была впервые применена более 150 лет назад. Однако бурное развитие методов иммобилизации живых клеток началось с 70-х гг ХХ века, что связано с потребностями фундаментальных исследований в области биохимии, молекулярной биологии, физиологии микроорганизмов, а также с разработкой современных биотехнологических производств. В России в начале 70-х годов Г.К. Скрябин и К.А. Кощеенко совместно с другими сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР провели первые эксперименты по иммобилизации интактных клеток микроорганизмов. В 1975 г. на Советско-американской конференции Г.К. Скрябин обосновал теоретические аспекты иммобилизации живых клеток микроорганизмов и возможности их практического использования, в том числе как биокатализаторов пролонгированного действия в синтезе стероидных гормонов [8]. В начале 70-х годов группа исследователей из Японии под руководством I. Chibata сообщила об успешном проведении биосинтеза L-аспартата иммобилизованными клетками, содержащими аспартазу [157], после чего значительное количество исследовательских групп начали разработку процессов трансформации органических веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов.
Различные направления биотехнологии связаны с использованием иммобилизованных и самоиммобилизованных клеток микроорганизмов – это, прежде всего, биологическая очистка сточных вод и загрязненных почв, биодеградация, биосинтез, ферментация и биокатализ. Биокатализ и биотрансформация являются процессами химического превращения одного или более веществ, протекающими под действием биологических катализаторов – ферментов или клеток с определенной ферментативной активностью. Гетерогенный биокатализ – это специфический, высокоэффективный процесс трансформации органических веществ, протекающий на поверхности раздела фаз. Катализатором этого процесса является биологическая составляющая (фермент, комплекс ферментов, органеллы, клетки), иммобилизованная на нерастворимом носителе. По определению Я. Халгаша, иммобилизация биокатализаторов – это фиксирование ферментов или клеток в некоторой фазе, чаще всего нерастворимой, отделенной от другой фазы (раствора), в которой находятся молекулы субстрата и (или) продукта, причем возможен межфазный перенос этих молекул [77]. На первой конференции по инженерной энзимологии (Henniker, NH, США, 1971) было определено, что иммобилизованные биокатализаторы – это ферменты или клетки, физически зафиксированные в определенной области, для того чтобы катализировать специфические реакции без потери каталитической активности и с возможностью повторного использования [201].
Известны различные способы иммобилизации биокатализаторов (Рисунок 1), подразделяющиеся на адсорбцию и ковалентное связывание (иммобилизация на поверхности материала носителя); включение в гели и инкапсуляцию (иммобилизация в структуру материала носителя). Отдельно можно выделить мембранные технологии и иммобилизацию без носителя (поперечная сшивка с образованием ковалентных связей) [31].
Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы
Скорость роста бактерий разных видов может возрастать, снижаться, либо не изменяться после иммобилизации, в зависимости от природы субстрата и возможности его сорбции на носителе. Так, скорость роста Klebsiella oxytoca, адсорбированного на частицах гранулярного активного угля, возрастает более чем в 10 раз при росте на глутамате, который адсорбируется на поверхности углей, и не изменяется при росте на глюкозе, не адсорбирующейся на носителе [177]. С другой стороны, исследования И.К. Курдиш и З.Т. Бега показали, что глинистые минералы в концентрации 0,2–1,0% существенно стимулируют рост фосфатмобилизующих бактерий Bacillus subtilis при их культивировании в среде, содержащей труднорастворимый фосфат кальция. Авторы предполагают, что одним из механизмов повышения интенсивности роста бацилл в этом случае является увеличение массопереноса кислорода, которое снижается при повышении концентрации глинистых материалов до 2%, приводя к ингибированию их роста. При этом способность глюкозы и ионов фосфата сорбироваться на монтмориллоните авторы рассматривают как отрицательный момент [34]. В более ранних работах И.К. Курдиш и Л.В. Титовой также было показано, что высокодисперсные материалы оказывали стимулирующий эффект на рост бактерий. В частности, высокодисперсный диоксид кремния и его модифицированные формы, а также глинистые природные материалы палыгорскит, монтмориллонит и каолин в концентрации 10 г/л повышали выживаемость и интенсивность роста азотфиксирующих бактерий Agrobacterium radiobacter в процессе гетерофазного культивирования. В данной работе авторы сделали заключение, что изменения физиологической активности микроорганизмов при их взаимодействии с высокодисперсными материалами невозможно объяснить одними только ионообменными процессами между питательной средой и твердыми материалами, т.к. компонентный состав питательных сред при взаимодействии с этими материалами практически не изменялся [35]. При изучении стимулирующего влияния диоксида титана на рост азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий Azobacter vinelandii и B. subtilis авторы установили, что этот эффект не является следствием сорбции сахарозы на поверхности твердых частиц, и выдвинули предположение, что контактное взаимодействие клеток бактерий с диоксидом титана обуславливает увеличение проницаемости клеточной стенки, что приводит к более полному потреблению субстрата [81]. Таким образом, в научной литературе не было выработано единого мнения о механизмах влияния высокодисперсных твердых материалов на физиологию растущих в их присутствии микроорганизмов.
Также была продемонстрирована возможность глубинного гетерогенного культивирования молочнокислых бактерий, и показано, что присутствие в среде твердой фазы в виде измельченного (0,5–1 мм) жома топинамбура способствует повышению стрессоустойчивости этих бактерий и увеличивает количество клеток, остающихся жизнеспособными после длительного хранения. Авторы предполагают, что основной причиной этого эффекта является адгезия клеток на твердых частицах жома, что увеличивает их устойчивость к стрессовым факторам [11].
Сведения об удельной скорости продукции или выходе различных вторичных метаболитов, таких как ферменты и антибиотики, при иммобилизации клеток также противоречивы. Ряд работ подтверждает возрастание выхода вторичных метаболитов у иммобилизованных клеток. Например, уровень изопропилтиогалактозид-индуцированной -галактозидазы был выше у иммобилизованных клеток E. coli, чем у суспендированных [92]. Иммобилизация в альгинате кальция стимулировала биосинтез супероксиддисмутазы клеток Aspergillus niger. Также иммобилизация изменяла спектр пектинолитических ферментов, экскретируемых A. niger: у иммобилизованных клеток наблюдалась сверхпродукция полиметилгалактуроназы и полигалактуроназы и снижение продукции пектинэстеразы и пектинлиазы [231]. В работе Т.М. Григорьевой с соавторами было отмечено, что, культивирование B. subtilis в виде биопленки дает увеличение продукции амилазы в 1,5–2,4 раза и глюканазы в 3 раза [12]. В то же время есть немало примеров снижения удельной продуктивности по отношению к свободным клеткам, что объясняется ограничениями массопереноса в системе иммобилизованных клеток [231].
Повышенная устойчивость биопленок микроорганизмов к ингибиторам, биоцидам и антибиотикам также общеизвестна, но нет единого мнения о механизмах этой устойчивости. Одним из наиболее распространенных объяснений является затруднение проникновения веществ-ингибиторов в структуру биопленки из-за диффузионных ограничений, обусловленных полимерным матриксом. Другая гипотеза связана с существованием «биопленочного фенотипа», т.е. различной экспрессией генов в планктонных и прикрепленных клетках [43, 209, 231]. Сравнение профилей экспрессии генов в клетках одних и тех же бактерий, существующих в составе биопленки и в планктонном состоянии, показало, что около 45 генов экспрессируются различно. Более того, обнаружено, что дифференцированная экспрессия генов наблюдается в разных местах биопленки, что может свидетельствовать о способности индивидуальных членов бактериального сообщества выполнять разные функции, повышая выживаемость всего сообщества [38].
Наибольшее распространение получило представление о существовании в биопленках особых «персистирующих» клеток, находящихся в покоящемся состоянии и поэтому более устойчивых к действию неблагоприятных факторов [43, 209].
Прикрепление клеток E. coli к абиотической поверхности вызывает важные изменения в составе внешних мембранных белков, из которых 17 показали возросшие уровни синтеза, а 15 – уменьшенные [23]. Изменения проницаемости мембраны клеток в ответ на иммобилизацию также могут объяснить возрастание устойчивости грамотрицательных биопленкообразующих бактерий к антимикробным агентам. SDS-PAGE анализ протеинов внешней мембраны свободных и включенных в структуру геля клеток E. coli, устойчивых к -лактамным антибиотикам, показал дефицит уровня неспецифического поринового белка OmpF, которому принадлежит основная роль в проникновении антибиотиков в клетку, у иммобилизованных клеток по сравнению со свободными [231].
Сигналы, приводящие к активации стресс-зависимых реакций, часто приводят к образованию биопленки, которая, в свою очередь, индуцирует механизмы стрессорных ответов. Регуляторные механизмы этих процессов включают двухкомпонентные регуляторные системы, в которых главные регуляторы, такие как ген rpoS и сигнальные молекулы, такие как циклический диГМФ, находятся в сложном взаимодействии [265]. Альтернативная S cубъединица РНК полимеразы, кодируемая геном rpoS, и поэтому также называемая белком RpoS, рассматривается как основной регулятор общего стрессорного ответа у E. coli [265, 71]. Когда бактерии растут в периодической культуре на полноценной среде, внутриклеточная концентрация белка RpoS резко повышается в стационарной фазе роста и S-ассоциированная форма РНК-полимеразы становится основной формой РНК-полимеразы, активной на этой стадии роста. Важность rpoS в регуляции факторов адгезии и адаптации к существованию в виде биопленки продемонстрирована тем, что 46% rpoS-зависимых генов различно экспрессируется в прикрепленных клетках, и что делеция rpoS отрицательно воздействует на способность E. coli формировать биопленки. Индукция регулона rpoS может быть согласована с аккумуляцией S фактора в клетках биопленки, в результате их более медленного роста в сравнении с планктонными клетками [265].
Адсорбция нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях
При этом адгезированные клетки проявляют при трансформации высоких концентраций субстрата ферментативную активность, превышающую на 20–40% ее максимальное значение у суспендированных клеток. Исключение составляют гетерогенные биокатализаторы, приготовленные путем адгезии клеток родококков на материалах Карбопон-В-актив (активность не превышает 81% исходной), керамзите с графитоподобным слоем углерода на поверхности (57% исходной) и шунгите (11%). Возможно, такое снижение активности связано со свойствами носителей. Активированное нетканное полотно "Карбопон-В-актив" представляет собой углеродный волокнистый сорбент, нетканная основа которого импрегнирована мелкодисперсным активированным углеродом [2]. В результате такой модификации материал Карбопон-В-актив обладает сильно гидрофобной поверхностью и высокой сорбционной емкостью, что приводит к частичной адсорбции продукта реакции. Также снижение активности может быть связано с возникновением диффузионных затруднений при полислойной адсорбции клеток, о которой можно судить по характеру кривых адсорбции (Рисунок 15). Падение нитрилгидратазной активности родококков при адгезии на шунгите может быть объяснено бактерицидной природой этого адсорбента [22], что также свидетельствует в пользу утверждения, что для проявления данной ферментативной активности необходимо поддержание жизнеспособности клетки.
Относительно гладкий графитоподобный слой углерода, синтезированный на поверхности керамзита, по-видимому, оказывает неблагоприятное воздействие на активность адгезированных на нем клеток, возможно, связанное с увеличением сайтов адгезии при взаимодействии с гладкой поверхностью, что может неблагоприятно сказаться на массообмене. Так, при сравнении микрофотографий, полученных в сканирующем электронном микроскопе, можно заметить отличие между характером адгезии клеток на гладком (керамзите с поверхностным слоем графитоподобного углерода) и шероховатом (керамзите со слоем КВУ) носителе (Рисунок 22). Можно предположить, что гладкая поверхность носителя менее благоприятна для проявления ферментативной активности иммобилизованного биокатализатора.
Пределом растворимости НАК является концентрация 1,1 М (7,35% при температуре 20С) [1]. Возможность использования более высоких концентраций для биотрансформации связана с тем, что клетки постепенно поглощают субстрат и трансформируют его в продукт (акриламид), удаляя НАК из реакционной среды, в результате чего происходит постепенное его растворение и конверсия. Повышение концентрации НАК в среде ограничено, по-видимому, его токсичностью для клеток и ферментативных систем.
Было отмечено, что нитрилазная активность штамма P. fluorescens С2, как и нитрилгидратазная R. ruber gt 1, возрастала у адгезированных клеток по сравнению с суспендированными. В зависимости от носителя активность возрастала: при адгезии клеток на углеродной ткани Урал ТМ-4 – в 7,4 раза (до 2,6 мкмоль/мг/мин), на Карбопон-В-актив – в 2 раза (до 0,7 мкмоль/мг/мин) при исходной активности суспендированных клеток 0,35 мкмоль/мг/мин. Такое увеличение ферментативной активности наблюдалось лишь при высоких концентрациях вносимого субстрата (9–10 об.%), значительно превышающих технологические концентрации (2%), разработанные для проведения синтеза карбоновых кислот и амидов суспендированной биомассой [3].
В то же время, активность адгезированных клеток P. fluorescens С2 зависела от концентрации клеток в реакционной среде. Так, на угле-сырце различной дисперсности (порошкообразном, дробленом с размером фракций 1–6 и 3–10 мм) масса адгезированных клеток возрастала с увеличением дисперсности, но при этом снижалась удельная нитрилазная активность по отношению к НАК (Рисунок 23).
Таким образом, на удельную нитрилазную активность клеток влияет их концентрация в реакционной среде, а в гетерогенном биокатализе ферментативная активность зависит от количества адгезированных клеток при прочих равных условиях и избытке субстрата.
Адгезия клеток P. fluorescens С2 на каолине приводила к достоверному увеличению нитрилазной активности иммобилизованных клеток при концентрации НАК от 0,59 до 1,3 М (p0,05), причем средняя величина активности адгезированных клеток при концентрации субстрата 1,3 М превышала таковую свободных клеток в 2 раза (Рисунок 24). Всплеск активности при данной концентрации субстрата может быть связан с тем, что эта концентрация НАК является оптимальной для иммобилизованных клеток – несмотря на то, что она находится за пределами растворимости (1,1 М при 20С), присутствие адсорбента влияет на равномерное потребление субстрата с постепенным его растворением.
Удельная нитрилазная активность клеток P. fluorescens С2, адгезированных на каолине, при гидролизе 1,3 М раствора НАК была сопоставима с активностью высокопродуктивных продуцентов нитрилазы Alcaligenes denitrificans C-32 и A. denitrificans ВКПМ В-9582 (2,4 и 3,6 мкмоль/мг/мин при выращивании на мясо-пептонном агаре и 2,8 и 4,0 мкмоль/мг/мин при выращивании на минеральной среде с ацетатом аммония и кукурузным экстрактом в колбах) [69]. В то же время, при малой концентрации адгезированных клеток активность P. fluorescens С2 достигала 12 мкмоль/мг/мин, что говорит о перспективности использования малых количеств адгезированных клеток или сильно разбавленных суспензий микроорганизмов для увеличения нитрилазной активности.
Чтобы оценить влияние адгезии клеток R. erythropolis 11-2 на амидазную активность, проводили трансформацию различных концентраций акриламида свободными и иммобилизованными на БАУ клетками. Определено, что удельная амидазная активность находилась в обратной зависимости от концентрации клеток при конверсии амидов как интактными клетками, так и адгезированными на носителе (Рисунок 25). Показана сильная обратная связь между концентрацией клеток в суспензии и их активностью (R = –0,821; p = 0,02). Подобная зависимость была обнаружена для амидазной и нитрилазной активности, что, вероятно, связано с невысокой скоростью конверсии субстрата. В этом случае удельная активность составляла единицы мкмоль продукта, образуемого в минуту 1 мг сухих клеток, тогда как в случае нитрилгидратазной активности – сотни мкмоль. В связи с этим может быть выдвинута гипотеза, по которой при изначальной относительно низкой скорости ферментативной реакции определяющую роль играет диффузия субстрата, когда затруднения массообмена возникают как при высокой концентрации клеток в суспензии, так и при избыточной (полислойной) адсорбции клеток на носителе.
Трансформация ароматических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий
Отмечена положительная корреляционная зависимость при сравнении массивности биопленки в целом и жизнеспособности клеток биопленки, лежащих в основе двух методов оценки динамики роста биопленок. Так, при посуточном определении оптической плотности экстрагированного красителя кристаллического фиолетового и концентрации внутриклеточного АТФ у R. ruber gt1 отмечается умеренная корреляция при сравнении этих параметров (r=0,513; p=0,05). У P. fluorescens C2 при распределении величин, отличном от нормального, отмечается достоверно высокая корреляция между этими значениями (R=0,821; p=0,02). Следовательно, несмотря на то, что значения, полученные методом окраски кристаллическим фиолетовым, отражают массивность биопленки в целом, без учета жизнеспособных клеток и полимерного матрикса, завышающего показания, между величинами, определяющими биопленкообразование, и содержанием внутриклеточной АТФ наблюдается корреляция от умеренной до высокой, что дает возможность остановиться на одном из вышеперечисленных способов учета динамики роста биопленки в зависимости от поставленных задач.
Адгезия микробных клеток к абиотической или биотической поверхностям инициирует образование биопленки. Важным моментом в формировании биопленок являются изменения в метаболизме бактерий в процессе их перехода от планктонного образа жизни к прикрепленному [23]. Понимание этого вопроса связано с углубленным изучением физиологии мутантов бактерий, у которых нарушен процесс инициации и развития биопленок, микроскопическим наблюдением, анализом мРНК и протеомным анализом [209, 239]. Известно, что индикатором энергетического статуса клеток является их аденилатный пул. Однако работы, посвященные определению содержания АТФ в клетках биопленок, немногочисленны. В работе S.L. Kinniment и J.W.T. Wimpenny определено содержание АТФ, АДФ и АМФ в срезах биопленки Pseudomonas aeruginosa в двух временных точках – 55 и 105 ч роста, соответствующих «квазистационарной» фазе [244]. Вместе с тем, в научной литературе не было обнаружено сведений об исследовании влияния стадии инициации развития биопленки – необратимой адгезии клеток – на содержание внутриклеточной АТФ.
Методика определения количества клеток микроорганизмов по концентрации АТФ не является абсолютно точной, т.к. количество АТФ в жизнеспособной клетке варьирует в зависимости от физиологического состояния и фазы роста. Изменение концентрации АТФ в клетке, как возрастание в результате разобщения энергетического и конструктивного обмена, так и падение, свидетельствует о стрессовом состоянии микробной клетки [62, 72]. Поэтому данная методика может быть также применима к обратной задаче, а именно к определению энергетического состояния прикрепленной клетки при известном количестве клеток в образце.
Чтобы оценить влияние адгезии клеток на содержание в них АТФ, клетки R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 были выращены в суспензии до стационарной фазы и инкубированы с углеродсодержащими носителями. Показано, что концентрация АТФ в клетках после адгезии в подавляющем большинстве случаев снижается на порядок и более (Таблица 24).
Чтобы определить, отражает ли подобное снижение физиологическое состояние клеток изученных штаммов бактерий, или является результатом присутствия адсорбентов в образце, был проведен эксперимент по адсорбции АТФ на тех же углеродных материалах. Действительно, на носителях, взятых в том же количестве, как и в опытных образцах, из 1,95нМ раствора АТФ на Урал ТМ-4 адсорбировалось 5,5, на БАУ – 58,3, Сибуните – 20,5, «Сапропеле» – 32,0%. Данные, представленные в таблице, содержат поправку на адсорбцию АТФ.
Известно, что в адгезии клеток бактерий большую роль играют гидрофобные взаимодействия. Углеродсодержащие носители, использованные для адгезии, гидрофобны, и на них эффективнее адсорбируются клетки, клеточная стенка которых также обладает гидрофобностью. При старении клеток бактерий происходят значительные изменения физиолого-биохимического статуса, проявляющиеся в изменении свойств клеточной поверхности, в частности, ее гидрофильно-гидрофобных характеристик, причем мертвые и гипометаболические клетки имеют очень высокие показатели сорбции на гидрофобизированных носителях [68]. Можно предположить, что заметное снижение количества АТФ в расчете на клетку связано с тем, что сорбируются в первую очередь мертвые клетки за счет повышенной гидрофобности их клеточной стенки. Для того чтобы определить, жизнеспособны ли адгезированные клетки, образцы носителей с клетками переносили в свежую питательную среду и извлекали через 2, 24 и 48 ч. Показано, что содержание АТФ на клетку через 2 ч снижалось даже по сравнению с концентрацией АТФ в клетках сразу после адгезии (Рисунок 50). Но к 24 и 48 ч роста в свежей питательной среде этот показатель начинал возрастать, что говорит о возможном нарастании биомассы на носителях, подтверждающем жизнеспособность адгезированных клеток.
Определено, что клетки R. ruber gt1, находящиеся в логарифмической фазе роста, содержали 2,300±0,077, а P. fluorescens C2 – 3,950±0,452 нМ/мг АТФ. При адгезии клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, также наблюдается падение концентрации внутриклеточного АТФ. Так, при адгезии клеток P. fluorescens C2 на Сибуните, содержание АТФ снижалось до 0,025±0,002 нМ/мг. В фазе активного роста гипометаболические и мертвые клетки практически не содержатся, что также подтверждает предположение, что снижение концентрации АТФ не связано с адсорбцией нежизнеспособных клеток.