Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
I. Сериновые протеиназы микрорганизмов 12
Принципы классификации протеолитических ферментов 12
Общая характеристика сериновых протеиназ 14
Химотрипсиноподобные протеолитические ферменты бактерий 16
II. Глутамилэндопептидазы-особое семейство химотрипсинов 18
1. Физико-химические свойства глутамилэндопептидаз 18
микроорганизмов
Эволюционное биоразнообразие микробных глутамилэндопептидаз 21
Структурные особенности глутамилэндопептидаз бактерий 23
Механизм катализа глутамилэндопептидаз 26
Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз 30
Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидаз микроорганизмов 34
Практическое применение глутамилэндопептидаз 42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 50
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
Штаммы и плазмиды 50
Выделение плазмидной ДНК 50
Электрофорез ДНК в агарозном геле 51
Трансформация клеток В. subtilis плазмидной ДНК 51
Питательные среды 53
Культивирование бактерий 55
Определение белка 5б
Определение протеолитической активности фермента 57
Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма 59
Электрофорез в ПААГ 59
Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF) 61
Иммуноферментный анализ 61
Определение субстратной специфичности 61
Влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидазы 62
Физико-химические свойства и кинетические характеристики 63 глутамилэндопептидазы
Энзиматические свойства глутамилэндопептидазы 63
Математическая обработка результатов 64 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 66
1. Динамика роста и накопления глутамилэндопептидазы в 66
культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis
2. Подбор питательной среды для эффективной продукции 69
глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой
рекомбинантным штаммом В. subtilis
Очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой 74 рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных фазах роста и молекулярная масса белка
Иммунологический анализ препаратов глутамилэндопептидазы 79 В. intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis
на разных фазах роста
Масс-спектрометрический анализ препаратов 80
Электрофорез препаратов глутамилэндопептидазы В. intermedins 82 в нативных условиях
7. Влияние ингибиторов на активность препаратов 83
глутамилэндопептидазы В. intermedins
Субстратная специфичность фермента 84
Кинетические параметры глутамилэндопептидазы разных фаз 86 роста
10. рН-оптимум и рН-стабильность фермента 87
11. Температурный оптимум и температурная стабильность 87
фермента разных фаз роста
Влияние ионов двухвалентных металлов на активность 92 глутамилэндопептидазы разных стадий роста
Влияние дитиоэритритола на активность 92 глутамилэндопептидазы разных фаз роста
Влияние парахлормеркурибензоата и солей ртути на активность 94 глутамилэндопептидазы разных фаз роста
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 99
ВЫВОДЫ 114
ЛИТЕРАТУРА 115
Алании
Аргинин
Аспарагин
Аспарагиновая
кислота
Аспарагиновая кислота
или аспарагин
Валин
Гистидин
Глицин
Глутамин
Глутаминовая
кислота
Глутаминовая кислота
или глутамин
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ala А Изолейцин
Arg R Лейцин
Asn N Лизин
Asp D Метионин
V H G
Пролин
Val His Gly Gin
Цистеин
Glx
Pro
ДЭАЭ-целлюлоза
КМ-целлюлоза
о-фенантролин
ПААГ
Трис
ЭДТА
ВЭЖХ (FPLC)
п-ХМБ
PMSF
DS-Na
Диэтиламиноэтилцеллюлоза
О-карбоксиметилцеллюлоза
1,1 О-фенантролин
Полиакриламидный гель
2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол
Неорганический фосфат
Этилендиаминтетраацетат
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Парахлормеркурибензоат
Дитиоэритритол
Диизопропилфторфосфат
Фенил метилсульфонилфторид
Додецилсульфат натрия
gseBi Ген глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius
kb Килобазы
pNA Пара-нитроанилид
Rf Элекрофоретическая подвижность
Z Бензилоксикарбонил
Km Константа Михаэлиса
&cat Каталитическая константа
кДа Килодальтон
р/ Изоэлектрическая точка
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к микробным ферментам и, в частности, к протеиназам бацилл, объясняется недостаточной способностью протеолитических белков животного и растительного происхождения удовлетворять спрос на жизненные потребности населения планеты. Микроорганизмы являются источником всех типов гидролаз благодаря широкому разнообразию, простоте культивирования, безопасности в работе, способности к генетическим преобразованиям. Использование ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими веществами. Протеолитические белки микроорганизмов высокоактивны, доступны и легко биодеградируются. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологического производства бактериальных ферментов, область применения которых — промышленность, медицина, научные исследования.
Одной из наиболее интересных групп класса протеолитических
ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. Эти белки участвуют в
адаптационных процессах в условиях стресса, спорообразовании и
прорастании спор. Неослабевающий интерес к этим ферментам обусловлен
широтой их практического применения. Выход целевого продукта у бацилл
может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на
условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции,
либо модификацией гена. На основе протеиназ бацилл конструируются
каталитические антитела с протеолитической активностью. Выделены
протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и
тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа заболеваний, связанных с тромбообразованием, актуальным является поиск новых ферментов с высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндопептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Поэтому они являются
высокоточными "инструментами" для фрагментации белковых молекул при исследовании первичной структуры.
Поскольку бациллы секретируют различные протеиназы, выделение индивидуальных белков контаминирует с белковыми примесями, которые создают аналитические ошибки при исследовании фермента. Генно-инженерные методы позволяют создавать рекомбинантные штаммы, содержащие на плазмиде ген индивидуального фермента, что перспективно для разработки способов получения гомогенных протеиназ.
Целью работы явилось выделение, очистка и сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы В. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом на разных фазах роста.
В работе решались следующие задачи:
1. Подбор условий культивирования для выделения
глутамилэндопептидазы В. intermedius из рекомбинантного штамма В. subtilis
на разных стадиях роста.
2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы В. intermedius из
культуральной жидкости рекомбинантного штамма на разных стадиях роста.
3. MALDI-TOF анализ аминокислотных последовательностей
глутамилэндопептидазы, соответствующей разным фазам роста.
4. Сравнительное исследование свойств глутамилэндопептидазы,
соответствующей разным стадиям роста.
5. Выяснение роли дисульфидной связи в образовании конформеров
глутамилэндопептидазы.
Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована глутамилэндопептидаза В. intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных стадиях роста. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств ранней и поздней глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные о различии каталитических характеристик (Кт и kcat) ранней и поздней протеиназы. Установлено, что оба препарата идентичны по первичной структуре, их N- и
С-концевые аминокислотные остатки совпадают. Впервые получены данные, указывающие, что поздний фермент содержит восстановленную дисульфидную связь в отличие от ранней глутамилэндопептидазы. Сравнительные исследования позволили заключить, что наличие дисульфидной связи может определять велечину молекулярной активности глутамилэндопептидазы разных фаз роста.
Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции глутамилэндопептидазы В. intermedins на разных стадиях роста для проведения эффективной очистки фермента. Полученный в работе рекомбинантный штамм В. subtilis может быть использован как эффективный продуцент глутамилэндопептидазы. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств раннего и позднего фермента рекомбинантного штамма В. subtilis позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, об особой подгруппе ферментов - глутамилэндопептидазах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования . поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной. Программы РНП 2.11.1005. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Республики Татарстан (2007 г) и были удостоены именной стипендии президента Республики Татарстан.
Положения, выносимые на защиту:
1. Разработаны условия культивирования и получена
глутамилэндопептидаза В. intermedius, соответствующая разным фазам роста
рекомбинантного штамма.
2. Глутамилэндопептидаза, разных фаз роста характеризуется
идентичной аминокислотной последовательностью, но отличается по
каталитическим характеристикам и энзиматическим свойствам.
3. Дестабилизация глутамилэндопептидазы стадии позднего стационара
по сравнению с соответствующим ферментом фазы замедления роста связана
со статусом дисульфидной связи в белковой глобуле.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Материалах докладов съезда с международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008), Материалах XLVI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 21 научных работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела
экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 100 наименований российских и зарубежных авторов.
Благодарности: Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. М.Р. Шариповой за внимательное отношение к работе; д.х.н., проф. Г.Н. Руденской за возможность проведения экспериментов на базе лаборатории кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ; к.б.н., с.н.с. Н.П. Балабан, к.б.н., доц. A.M. Мардановой и к.б.н., доц. В.И. Вершининой за постоянную помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов; проф. СВ. Кострову (ИМГ РАН), к.б.н., с.н.с. И.В. Демидюку (ИМГ РАН) за предоставление плазмиды А58.21 и антисыворотки к глутамилэндопептидазе; проф. Е. Феррари (Genencor Int. Inc., USA) за предоставление протеазо-дефицитного штамма В. subtilis. Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского университета проф. О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и теплую рабочую атмосферу.
