Введение к работе
Актуальность исследования. В эпидемиологии и инфекционной патологии особое место принадлежит экспресс-индикации и идентификации возбудителей или их специфических продуктов (антигенов, последовательностей ДНК, состава жирных кислот и др.)- Наибольший удельный вес среди острых кишечных инфекций в последнее десятилетие занимают сальмонеллезы, возбудители которых насчитывают более 2200 различных сероваров. Проблема сальмонеллезов тесно связана с высоким уровнем заболеваемости сельскохозяйственных животных, контаминацией сальмонеллами пищевых мясо-молочных продуктов, тушек птиц, готовых изделий и т.д. Актуальной в настоящее время является и проблема внутрибольничных сальмонеллезов, наиболее часто обуславливаемых Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium (Акимкин, Беляков, 1996). Следует отметить, что рост инфекционных заболеваний, связанных с неудовлетворительным микробиологическим качеством продовольственного сырья, пищевых продуктов, питьевой воды непрерывно растет во всем мире, в тон числе и Российской Федерации (РФ).
Анализ эффективности и своевременности применяемых на практике методов бактериологического и серологического выявления сальмонелл и других эпидемиологически значимых патогенных бактерий свидетельствует о том, что в ряде случаев низкая чувствительность методов не всегда позволяет обнаружить возбудителя (Воробьев, Бондаренко, 1997).
В России эпидемиологическая обстановка по кишечным инфекциям неизбежно будет ухудшаться вследствие снижения экономического и социального уровня жизни основной массы населения, а также обвального вытеснения отечественного рынка продуктов на международный (Дмитриева, 1997; Онищенко, 1997).
Обращает на себя внимание факт несоответствия случаев кишечных заболеваний с качеством пищевых продуктов в РФ и за рубежом. Только в Великобритании, в соответствии с Докладом об инфекционных заболеваниях группы PHLS, за июль, август и сентябрь 1996 года отмечено 12642 случая инфицирования продуктов питания сальмонеллами, тогда как за весь 1996 год таких случаев в РФ отмечено всего насколько десятков. При этом число заболеваний сальмонеллезными инфекциями в РФ за последние 5 лет превысило десять тысяч в год.
За рубежом растущее беспокойство по поводу бактериального загрязнения продуктов питания привело к созданию новых технологий, определяющих качественно новый уровень тестирования продуктов питания на наличие патогенных бактерий и в первую очередь сальмонелл (Beumer et al, 1991; Di Falco et al, 1993; Bulte, Jakob, 1995). Начиная с 1978 года в Великобритании, Голландии, Австрии, Франции ведутся методические и
приборные исследования по созданию новых высокопроизводительных ИІ трументальных методов контроля контаминации пищи на зараженность мі роорганизмами. В связи с ростом инфекционных заболеваний, обусловл< ных инфицированной пищей, традиционные методы обнаружения и выделе! патогенных агентов вследствие их трудоемкости и продолжительности і чинают не справляться со все возрастающим объемом необходимых иссле) ваний. Стремление микробиологов заменить традиционные методы инсті ментальными технологиями, которые могли бы сократить время mhkpo6hoj гического тестирования, не уступая при этом точности определені чувствительности и воспроизводимости, привело к появлению на зарубі ном приборном рынке новых технических средств, отвечающих этим услої
ЯМ. 1^
Одним из подходов, направленных на быстрое обнаружение патоген) бактерий в тестируемом материале, является детекция возбудителей профилю жирных кислот, устанавливаемого с помощью метода газовой xj матографии (Mitruka, 1974; Помазанов, 1975; Васюренко, 1981; Мещеряі ва, 1984; Бондаренко, 1986). Показано, что контроль химических па] метров и особенностей их изменения в процессе роста микробов гора: легче автоматизировать путем использования техники измерения элект] ческой проводимости среды культивирования бактерий, принцип которі состоит в том, что при постоянной температуре конечные продукты бак' риального метаболизма изменяют ионную концентрацию среды роста и, п< кольку ионы являются носителями заряда, это приводит к изменению П] водимости. Изменения проводимости свидетельствуют о метаболичесі процессах, обусловленных ростом микробных клеток.
Для профилактики кишечных инфекций у человека, вызываемых бак' риями различных таксономических групп, в том числе и сальмонелла! важными являются эпидемиологический надзор и осуществление санит; но-гигиенических мер и мероприятий, определяющую роль при которых 1 рают методы своевременной индикации и идентификации возбудителя.
Цель работы
Целью настоящего исследования явилась отработка критериев идеи' фикации бактерий по профилю жирных кислот и разработка комплексной і томатизированной хемотаксономической (хромато-электрохимической) сі темы для обнаружения сальмонелл и других патогенных бактерий, возбу; телей острых кишечных инфекций.
Задачи исследования
-
Изучить профиль жирных кислот эталонных штаммов энтеробактерий различных таксономических групп с отбором дифференцирующих признаков в отношении сальмонелл.
-
Осуществить аналитический контроль химических соединений, характеризующих таксономическую принадлежность эпидемиологически значимых бактерий, учет которых легко автоматизируется и стабилен в отношении качественной и количественной оценки результатов исследования и их интерпретации.
-
Определить возможность электрохимического метода обнаружения сальмонелл и других патогенных бактерий с использованием селективной среды.
-
Разработать комплексный экспресс метод обнаружения и идентификации сальмонелл путем культивирования бактерий на селективной питательной среде с последующим гаэохроматографическим анализом состава их жирных кислот.
-
Осуществить апробацию нового метода экспресс-диагностики сальмонелл по результатам хемотаксономического и импедансного анализов на практике.
Научная новизна. Разработан системный подход в организации крупномасштабных микробиологических исследований качества пищевых продуктов с использованием различных физико-химических методов анализа и их сочетания в масштабах отдельно взятого региона. При этом впервые получены следующие аналитические и экспериментальные данные:
получены качественные и количественные данные по составу жирных кислот представителей родов Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Haf-nia, Serratia, Citrobacter, Campylobacter, Escherichia, Listeria, Yersinia, Staphylococcus и Francisella и определен хемотаксономический критерий их индикации по профилю насыщенных и ненасыщенных жирных кислот;
определены качественные и количественные вариации жирнокислотного состава бактерий в зависимости от качества питательной среды и температуры культивирования;
отработан системный анализ прохождения пробы, подращивания микроорганизмов на селективных и неселективных средах с одновременным электрохимическим контролем процесса роста по изменению проводимости среды;
разработана хроматографическая методика и прибор с программа обеспечением для идентификации бактерий по составу их жирных кислої химически сложных средах, в том числе для диагностики анаэробных не лостридиальных инфекций;
предложен новый метод с техническим обеспечением обнаружение идентификации бактерий с помощью электрохимического и хроматографиче кого методов анализа.
Практическая значимость работы. Разработанные методы, программь технические средства использованы для организации тестирования больи го числа проб пищевых продуктов на наличие патогенных и условно-паї генных бактерий с целью сведения к минимуму возможности пищевых отрг лений:
отработаны методики отбора и прохождения проб к электрохимическс и хроматографическому анализу и тестирования пищевых продуктов с г мощью электрохимических анализаторов;
разработаные методики идентификации бактерий по профилю их жирі кислот, программа и способ экспресс-обнаружения микробов с использої ниєм сочетания кондуктометрической и хроматографической техники по* зали эффективность их использования на практике.
Внедрение в практику. Методические указания, программы и прибс внедрены в практику работы центра санэпиднадзора Юго-Восточного окр> г.Москвы и используется в системе крупномасштабного тестирования щ дуктов питания на наличие сальмонелл и других патогенных бактерий.
Основные положення, выносимые на защиту:
критерии хемотаксономической индикации сальмонелл и других пат генных бактерий по спектру их жирных кислот;
методика и программа обнаружения сальмонелл электрохимическим ^ тодом;
идентификация сальмонелл, совмещающая кондуктометрическую и хро* тографическую технику анализа их метаболитов в продуктах питания и t ологических образцах и объектах окружающей среды.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях Госкомсанэпиднадзора России (Москва, июнь 1993 г., июль 1994 г., декабрь 1995 г.), VIII съезде гигиенистов и санитарных врачей (Москва, декабрь 1996 г.), итоговой конференции Научного Совета по хроматографии РАН (Москва, апрель 1997 г.), 5 Международном симпозиуме "Экология человека. Пищевые продукты и технологии на пороге XXI века" (Пятигорск, сентябрь 1997 г.), 2 Съезде хроматографистов Украины (Киев, сентябрь 1997 г.), 3 Международной конференции "Проблемы управления качеством окружающей среды" (Москва, октябрь 1997 г.). Научно-практической конференции "Приборное обеспечение науки, промышленного и сельскохозяйственного производства, природопользования, жилищно-коммунального хозяйства" (Москва, ноябрь 1997 г.).
Диссертация апробирована на конференции лаборатории генетики вирулентности бактерий, лаборатории легионеллезов, лаборатории туляремии НИИЭМ ии.Н.Ф.Гамалеи РАМН и отдела новых методов анализа МИЦКоордина-ции.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Разработка защищена патентом России N 97108375 (1997).
Структура и объем. Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из Введения, Обзора литературы, 2 Глав собственных исследований, Выводов, Списка литературы (190 наименований). Содержит 21 рисунок и 16 таблиц.
- б -