Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди широкого круга молекулярно-ге-нетических методов, применяемых для решения фундаментальных и прикладных задач микробиологии, наиболее перспективным является полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на энзиматической амплификации фрагмента ДНК, ограниченного синтетическими олиго-нуклеотидами-праймерами /Mullls К., Faloona F., 1987/. Высокие показатели чувствительности и специфичности, быстрота получения результата придают данному методу значительные преимущества при обнаружении возбудителей инфекций, изоляция и культивирование которых слишком длительны и трудоемки, а различные варианты иммуно-химической диагностики не вполне надежны. ПЦР с универсальными (неспецифическими) праймерами (УП-ЩР, AP-PCR, RAPD-PCR) позволяет наиболее объективно дифференцировать биологические (генетические) виды на основании единства структурной организации генома, выражением которой служит сходство во взаиморасположении и нукле-отидном составе многих генетически уникальных фрагментов ПЦР-пат-тернов исследуемых штаммов /Булат С.А., Мироненко Н.В., 1980/, а также анализировать клональную структуру микробных популяций путем сравнения паттернов амшшфицируемой ДНК - эффективного средства эпидемиологического маркирования изолятов.
Возбудитель псевдотуберкулеза (yersinia pseudotuberculosis) является микроорганизмом, таксономическое положение которого остается дискуссионным ввиду противоречия между данными ДНК-ДНК гибридизации, свидетельствующими о тесном генетическом родстве бактерий чумы и псевдотуберкулеза, и их принадлежностью к разным таксономическим видал согласно традиционной схеме классификации, что побуждает к поиску новых методов, вскрывающих родственные связи микроба.
Методы обнаружения и эпидемиологического маркирования Y.pseudotuberculosis также нуждаются в дальнейшем совершенствовании. Вьщеление чистой культуры возбудителя длительно (2-3 недели) и малоэффективно, поскольку позволяет подтвердить диагноз лишь у 25-70% больных при групповых заболеваниях и у 10-15% при спорадических случаях /Сомов Г.П. и др., 1990/. Серотипирование штаммов Y.pseudotuberculosis не способствует достоверному определению путей передачи инфекции в связи с низкой разрешающей способностью метода, маскирующей полигональную структуру популяций возбудите-
ля со сходной антигенной структурой в большинстве очагов. Наличие общих антигенных детерминант белковой и липополисахаридной природы является причиной перекрестных реакций антисывороток, особенно к сероварам 1, 2, 5 /ЦеневаГ.Я., 1987; Щербаков А.А., 1991/. Отсутствие в стране производства узкоспецифичных агглютинирующих псевдотуберкулезных сьгеороток приводит к применению изготовленных в различных лабораториях нестандартизированных препаратов, что не позволяет сравнивать получаемые результаты. Серодиагностика псевдотуберкулеза, используемая в настоящее время, является ретроспективной. Обнаружение псэвдотуберкулезных антигенов экспрессными иммунологическими методами - иммуноферментным анализом (ИФА), непрямым методом флюоресцирующих антител (МФА), реакциями агглютинации латекса (РАЛ), коагглютинации (РКоА), непрямой гемагглю-тинации (РИГА) - характеризуется недостаточной чувствительностью и специфичностью.
Вышеуказанные причины побудили к выбору У.pseudotuberculosis в качестве объекта для разработки и применения методов идентификации и генотипирования патогенных микроорганизмов на основе изучения их генома (ДНК).
Таким образом, тема исследования имеет ДЕа аспекта, классификационный и клинико-микробиологический. Первый относится к решению спорных вопросов таксономии и систематики микроорганизмов с дискуссионным таксономическим рангом, в частности бактерий псевдотуберкулеза. Второй заключается в совершенствовании микробиологической диагностики псевдотуберкулеза и методов эпидемиологического тшгарования изолятов Y. pseudotuberculosis с учетом индивидуальных особенностей строения их генома.
Цель работы. Разработка и применение молекулярно-генетических методов идентификации и индикации У. pseudotuberculosis на основе амплификации фрагментов геномной ДНК методом ЩР.
Задачи исследования. 1. Видоидентифицировать бактерии псевдотуберкулеза методом УП-ПЦР и сопоставить полученные результаты с данными риботипирования возбудителей чумы и псевдотуберкулеза.
-
Изучить генетическую изменчивость штаммов псевдогуберку-лезных бактерий из различных регионов страны. Геногипировать се-рОЕары и отдельные изоляты возбудителя методом УП-ЩР.
-
Разработать метод обнаружения У. pseudotuberculosis в различных биосубстратах на основе амплификации в ЩР фрагмента хро-
мссомксто гена инвазивности (Inv). Сопоставить метод ГЩР с серологическими метода/и индикации антигенов возбудителя (М<М, РАЛ, РИГА, ММ). Оценить пригодность ЩР в качестве альтернативного метода лабораторной диагностики псевдотуберкулезной инфекции.
Научная новизна. 1. Впервые методом УП-ІЩР на основе гомологии продуктов амплификации установлена принадлежность таксономических видов У.pseudotuberculosis и Y.pestis к одному генетическому виду.
2. Впервые методом риботипирования (рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента рДНК) показано тесное генетическое родстЕО бактерий чуш и псевдотуберкулеза бплоть до идентичности отдельных штаммов этих видов, что подтверждает результаты их УП-ПЦР Бидоидентификации.
3. Впервые разработан и экспериментально обоснован экспертный метод определения сероварОЕ Y. pseudotuberculosis на основе -анализа УП-ППР паттернов. С помощью данного метода получены новые эпидемиологические данные - показано, что большая часть (5Р7.) штаммов Y.pseudotuberculosis, выделенных от людей на территории России и Украины, принадлежат к пятому, а ке к первому серовару, как считалось ранее.
4. Впервые показана возможность дифференциации бактерий чумы н псевдстуберкулеза путем специфической амплификации в ЩР Фрагмента хромосомного гена инвазивности (Inv) Y.pseudotuberculosis и на ?той основе разработан метод индикации псевдотуберкулезного микроба в клинических образцах.
Практическая ценность. Предложенный метод экспресс-идентификации вида и сероваров Y. pseudotuberculosis (Уїї-ЩР) позволяет проводить экспортную оценку видовой и серологической принадлежности на основе индивидуальных особенностей генома выделенных штаммов псеЕдотуберкулезных бактерий. Разработанный метод обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза на основе амплификации в ЩР фрагмента хромосомного гена инвазивности (inv) позволяет проводить индикацию Y.pseudotuberculosis в различных биосубстратах с чувствительностью 2x10 J м.к./мл.
Данные методы могут быть использованы для диагностики псевдотуберкулеза, идентификации и эпидемиологического маркирования штаммов иерсиний, что является чрезвычайно актуальным при выборе соответствующих противоэпидемических, лечебных и профилактических
мероприятий. Опыт применения УП-ІЩР при псевдотуберкулеэе будет полезен для генотипироЕания и идентификации возбудителей других инфекционных заболеваний.
Положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Генотипирова-ние бактерий Y. pseudotuberculosis и Y.pestls методом УП-ЩР в сочетании с перекрестной гибридизацией амплифицированнои ДНК, а также результаты риботипирования этих микробов свидетельствуют о принадлежности Y.pseudotuberculosis и Y.pestls к одному генетическому виду.
2. Профили амплифицируемой в УП-ЩР ДНК коррелируют с серо-вариантной принадлежностью псевдотуберкулезных бактерий, что позволяет испольгоЕать данный метод для выявления серовароз и штам-моспецифических различий Y. pseudotuberculosis.
"Э. На основе геноспецифической ПНР с праймерами на хромосомный локус инЕазивкости (inv) Y.pseudotuberculosis разработан метод геноиндикации возбудителя псевдогуберкулеза в клинических биосубстратах, обладающий высокой чувствительностью (2х103 м.к./мл.) и специфичностью, позволяющей дифференцировать бактерии псевдотуберкулеза и чумы.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзной конференции "Профилактическая медицина. Состояние и перспективы" (1991), XII конференции молодых ученых Военно-медицинской аісадемии (1992), заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов (1994), пленарном заседании научной сессии отделения профилактической медицины РАМН по проблеме "Химия и здоровье. III. Экология и инфекционная заболеваемость" (.1995), международных симпозиумах "Эпидемиология и здоровье населения" (Вьетнам, 1995), "Этиология и патогенез инфекционных заболеваний (Сенегал, 1995).
Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обєора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Диссертация изложена на 274 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 16 таблицами. Указатель литературы включает 114 отечественных и 230 иностранных источников.