Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1.1 Общие сведения о возбудителях бруцеллеза сельскохозяйственных животных 8
1.2 Антигенная структура бруцелл 15
1.3 Химио и антибиотикотерапия бруцеллеза 19
1.4 Специфическая профилактика бруцеллеза крупного рогатого скота 22
1.5 Иммуномодуляторы при специфической профилактике бруцеллеза 30
Результаты собственных исследований 36
2.1 Материалы и методы исследований 36
2.2 Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. abortus 82-Rr 48
2.3 Разработка методики дифференциации культур бруцелл штамма 82-Rr от культур полевых штаммов и вакцинного штамма 82 53
2.4 Остаточная вирулентность, антигенные свойства, длительность приживаемости и контагиозность штамма В. abortus 82-Rr 55
2.5 Стабильность свойств штамма 82-Rr при пассажах через организм морских свинок и питательные среды 60
2.6 Иммуногенная активность штамма В. abortus 82-Rr при вакцинации и ревакцинации морских свинок и влияние иммуномодулятора на этот показатель 65
2.7 Абортогенные свойства штамма В. abortus 82-Rr 85
2.8 Спектр белков бруцелл 90
Обсуждение результатов исследований 108
Выводы 115
Практические предложения 117
7 список использованной литературы 118
8 приложения 146
- Общие сведения о возбудителях бруцеллеза сельскохозяйственных животных
- Специфическая профилактика бруцеллеза крупного рогатого скота
- Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. abortus 82-Rr
- Стабильность свойств штамма 82-Rr при пассажах через организм морских свинок и питательные среды
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бруцеллез сельскохозяйственных животных - широко распространенная в недавнем прошлом инфекция, однако продолжающая оставаться актуальной проблемой ветеринарной науки и практики по сей день. Несмотря на то, что в последние десятилетия в стране была проведена большая работа по искоренению данного заболевания, в отдельных регионах все еще сохраняется неблагополучие по бруцеллезу крупного рогатого скота.
Исследователи едины во мнении о том, что наиболее эффективным методом проведения противобруцеллезных мероприятий является метод полной, одномоментной ликвидации эпизоотических очагов бруцеллеза путем замены всего поголовья и санации окружающей природной среды. Вторым по значимости и более широко используемым при оздоровлении от бруцеллеза животных является метод систематических исследований поголовья неблагополучных по бруцеллезу стад с последующей изоляцией и убоем реагирующих животных. В ряде регионов этот метод сочетается с иммунизацией крупного рогатого скота противобруцеллезными вакцинами.
Тем не менее, следует отметить, что после применения существующих средств специфической профилактики иммунитет к заболеванию вырабатывается в течение 2-х недель. Также известно, что ни одна из имеющихся на сегодняшний день вакцин не создает 100%-ного защитного эффекта (B.C. Бронников и др., 1991). Все это не удовлетворяет требованиям экстренности, что на фоне сложившейся в мире ситуации, когда вероятность использования возбудителей инфекционных заболеваний, в т.ч. и бруцеллеза, как опасного зооантропоноза при террористических актах остается актуальной. При этом не следует забывать, что в отдельных случаях применение специальных противобруцеллезных мероприятий недопустимо, в особенности в тех случаях когда речь идет об особо ценных представителях пород сельскохозяйственных животных.
Поэтому, при наличие угрозы возникновения бруцеллеза у животных может возникнуть необходимость экстренного проведения одновременно двух мероприятий, а именно, антибиотикотерапии и специфической вакцинации поголовья животных, находящихся в очаге заражения. Однако, при сочетанном введении антибиотиков с вакциной первые губительно действуют не только на вирулентную, но и на живую вакцинную культуру бруцелл. Отсюда возникает необходимость получения вакцинного штамма, который был бы резистентен к антибиотику, применяемому для защиты животного, и сохранил бы при этом иммуногенные свойства.
Исследования по получению такого штамма были проведены в ФГНУ Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (ВЫЯВИ) путем пассирования исходного штамма В. abortus 82 на средах, содержащих рифампицин в увеличивающейся концентрации. В результате был получен рифампицинустойчивый мутант вакцинного штамма В. abortus 82-82Rr. Была изучена его стабильность по сохранению устойчивости к антибиотику при пассаже на искусственных питательных средах без содержания рифампицина. Однако другие свойства штамма 82-Rr и его пригодность в качестве вакцины для применения при экстренной защите животных от бруцеллеза требуют своего изучения.
Все вышесказанное определило направление наших исследований. Цель и задачи исследований - изучить свойства рифампицинрезистентного штамма B.abortus 82-Rr и установить их соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам бруцелл. Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить иммунобиологические свойства штамма B.abortus 82-Rr.
Выявить абортогенные свойства штамма В. abortus 82-Rr на крупном рогатом скоте в производственных условиях.
Исследовать белковые спектры ряда штаммов бруцелл методами электрофореза и иммуноблотинга.
Научная новизна. Впервые в лабораторных условиях изучены:
иммунобиологические свойства штамма В. abortus 82-Rr. Установлено, что культуры бруцелл этого штамма являются слабоагглютиногенными по S-антигену; приживается в течение 4-х месяцев в организме морских свинок; стабилен, безвреден, иммуногенен;
стимулирующее влияние тиосульфата натрия на иммуногенные свойства вакцины из штамма 82-Rr;
абортогенные свойства штамма на крупном рогатом скоте;
белковые спектры штаммов 82-Rr и 82, они имеют аналогичные наборы белковых и серопозитивных фракций; антиген-экстракты этих штаммов проявляют одинаковую антигенную активность в реакциях ТФ-ИФА; наибольшей антигенной активностью у штаммов бруцелл 82 и 82-Rr обладает белковая фракция с молекулярной массой 15 кД; фракции с молекулярными массами в 24, 11 и 5,8 кД являются специфическими антигенами штамма R-1096.
Практическая значимость. Всестороннее и детальное изучение штамма В.abortus 82-Rr позволило с уверенностью считать его вакцинным.
Полученные данные по изучению иммунобиологических свойств нового антибиотикорезистентного штамма В. abortus 82-Rr будут служить основой при разработке способа экстренной сочетанной защиты животных от бруцеллеза.
Основные положения, выносимые на защиту:
Штамм В.abortus 82-Rr соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам бруцелл.
Вакцина из штамма 82-Rr не абортогенна.
Отработаны практические приемы, позволяющие выявлять антигенные структуры, специфичные для разных форм бруцелл.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИВИ в виде ежегодных отчетов о НИР (2002-2004); международной научно-практической конференции (Покров, ВНИИВВиМ, 2002); научно-производственной конференции,
7 посвященной 100-летию профессора Н,Г. Кондюрина (Омск, 2004); ^ международной научной конференции, посвященной 100 летию Баева (Казань, КГУ, 2004 г.); опубликованы в ученых записках Казанской Государственной академии ветеринарной медицины (Казань, 2004) и журнале «Ветеринарный врач» (2004)
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, доложены, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещание сотрудников ВНИВИ (Казань, 2004).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения.
Работа иллюстрирована 20 таблицами и 14 фотографиями. Список литературы включает 268 источников, в том числе 77 иностранных. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты основных этапов работ.
*
Общие сведения о возбудителях бруцеллеза сельскохозяйственных животных
Возбудителями хронической инфекции людей и животных -бруцеллеза, служат представители генетически обособленного рода Brucella. Бруцеллы относятся к классу Schizomycetes, порядку Eubacteriales, семейству Brucellaceae.
Отнесение бруцелл к самостоятельному роду принимается всеми исследователями и не подвергается сомнению. Наряду с этим, вопросы, связанные с внутривидовой классификацией представителей рода Brucella, обсуждаются с момента открытия возбудителя бруцеллезной инфекции в 1886 году (П.А. Вершилова и др., 1972). В настоящее время по краткому определителю бактерий Берги (2001) и подкомитета экспертов ФАО ВОЗ по таксономии бруцелл, согласно последней классификации бруцелл (1986), среди трех их основных видов выделяются биовары: вид В. melitensis имеет три биовара; В. abortus — девять (восьмой биовар исключен); B.suis - пять биоваров; В. neotome, В. ovis и В. canis - по одному биовару. При определении видов и биоваров наряду с использовавшимися ранее тестами (потребность в СОг, продукция H2S, чувствительность к краскам) стали применять и другие критерии: способность бруцелл к агглютинации моноспецифическими сыворотками А и М, а также R-сывороткой, чувствительность к бруцеллезным S- и R- фагам и результаты окислительно-метаболических тестов в отношении аминокислот и углеводов. По нуклеотидному составу и степени подобия нуклеотидных последовательностей ДНК все виды бруцелл составляют компактную группу, близкородственную на уровне вида (В.И. Мельниченко и др., 1987; A.M. Алимов, 1993).
Современная классификация бруцелл в наиболее полной мере соответствует накопленным данным о возбудителе бруцеллеза как биологическом объекте, имеющем ряд специфических особенностей, одни из которых обусловлены его родовой, другие - видовой принадлежностью. Вместе с тем, нет основания считать, что она отражает многообразие форм бруцеллеза с исчерпывающей ее полнотой, на что указывают многие исследователи. Так, подчеркивая своеобразие оленьих бруцелл, А.Ф. Пинигин и О.С. Петухова (1960, 1962) предложили выделить их в самостоятельный вид Br. rangiferi. Аналогичной точки зрения придерживается и ряд авторов (Н.Н. Давыдов, 1961; J. Parnas,1964; И.Ф, Таран, НЛ. Козлов, 1972).
Бруцеллы представляют собой микроорганизмы очень малых размеров шаровой, овоидной и палочковидной формы. Они отличаются большим полиморфизмом и в одном и том же препарате бруцелл можно встретить все три формы. Размеры бруцелл, по данным отдельных авторов, в среднем равны: длина — 0,б-1,5мкм, ширина-0,3-0,6 мкм (И.А. Косилов, 1992).
Бруцеллы жгутиков не имеют, следовательно, они не способны к активному движению. В капле жидкости наблюдается только пассивное броуновское движение клеток. Способностью к спорообразованию и капсулообразованию бруцеллы не обладают. В окрашенном препарате они располагаются беспорядочно по одной или парно, реже короткими цепочками или маленькими гроздьями. Под электронным микроскопом имеют сложное строение. Оболочка клетки состоит из ряда внешних и внутренних мембран, цитоплазма представлена нуклеоидом очень большой величины и множеством рибосом.
Бруцеллы относятся к гетеротрофным микроорганизмам. Они способны расти на многих питательных средах, применяемых для культивирования бактерий. В нашей стране хорошо зарекомендовали себя печеночно-пептонный агар и бульон с добавлением глицерина и глюкозы, а также можно использовать агар Альбими, эритрит-агар и другие питательные среды. Бруцеллы характеризуются замедленным ростом на питательных средах, в особенности первые генерации культуры, оптимальными условиями для роста является температура 37С, рН 6,8-7,2.
Музейные культуры развиваются быстрее полевых штаммов, но и у них лагфаза значительно длиннее, чем у многих других бактерий, в среднем равна 18-30 часам. Величина лагфазы находится в прямой зависимости от количества материала и состава питательной среды.
Бруцеллы относятся к патогенным микроорганизмам. Однако разные виды и разные штаммы одного и того же вида бруцелл обладают разной вирулентностью.
Признак вирулентности, как известно, слагается из ряда свойств возбудителей: его агрессивности (способность преодолевать защитные приспособления организма), способности к токсинообразованию и наличие эндотоксина, инфекционности (способность вызывать инфекционный процесс в естественных условиях), ферментативной активности и др.. В лабораторной практике чаще всего используют показатель инфекционности, который выражается в минимальных инфицирующих дозах - количество микробных клеток, способных вызвать заражение всех или большинства животных.
Бруцеллы обладают высокой агрессивностью и могут проникать даже через неповрежденные слизистые покровы и кожу. Они относятся к внутриклеточным паразитам. Возбудители живут и размножаются внутри клеток ретикуло-эндотелиальной системы, но могут также находится и внеклеточно.
При развитии инфекционного процесса вирулентные штаммы бруцелл обладают способностью вызывать тяжелые деструктивные изменения в тканях с образованием очагов некроза, образованием характерных для бруцеллеза гранулем из эпителиоидных и гигантских клеток. В лимфатических узлах и внутренних органах возникают резко выраженные воспалительные реакции. Селезенка и печень значительно увеличены в размере, кровенаполнены, на поверхности и разрезе встречаются множественные мелкие сероватого цвета очажки (П.А. Вершилова и соавт., 1974; И.А. Косилов, 1992).
В сложном процессе взаимодействия микроб-хозяин важное место принадлежит поверхностным структурам клеток. В связи с этим, структура клеточной оболочки бруцелл и ее отдельные антигенные компоненты играют определенную роль в механизме реализации патогенности и иммуногенности этих бактерий.
Бруцеллы по строению клеточной оболочки относятся к типичным грамотрицательньш бактериям.
Клеточная оболочка, окружающая цитоплазматическую часть клетки, состоит из внутренней (цитоплазматической) мембраны и клеточной стенки, разделенных периплазматическим пространством. Основанием клеточной стенки служит слой пептидогликана, прочно связанный с наружной мембраной через молекулы липопротеина. Поверхность наружной мембраны покрывает слой липополисахарида.
Специфическая профилактика бруцеллеза крупного рогатого скота
Одно из важнейших мест при борьбе с бруцеллезом отводят созданию невосприимчивости к заражению бруцеллами как животных, так и людей, путем их активной иммунизации.
Так как, иммунитет при бруцеллезе носит относительный характер, исследования по изысканию надежных средств специфической профилактики этой болезни проводятся во многих странах мира и в настоящее время. С этой целью, как в нашей стране, так и за рубежом использовалось большое количество штаммов бруцелл, но лишь немногие из них оказались пригодными для изготовления противобруцеллезных вакцин (Н.П. Иванов и др., 1994).
В настоящее время в ветеринарной практике широко используются вакцины из живых культур аттенуированных бруцелл, корпускулярные инактивированные вакцины, разработаны и испытываются химические (искусственные) вакцины на основе использования протективных антигенов бруцелл (В.В. Якимов и др., 1993).
Наиболее изученной во многих странах является живая противобруцеллезная вакцина из штамма В.abortus 19 (Р.Г. Ягудин и др., 1995; Б.Ч. Куттуков и др., 1995; G. Mcklown 1976). Этот штамм впервые был выделен в 1923 году из молока абортировавшей коровы. Полученная из этого штамма вакцина является стабильной, иммуногенной и у крупного рогатого скота вызывает невосприимчивость к бруцеллезу в течение одного года при однократном введении (Л.А. Вершилова, 1972).
Об эффективности применения вакцины из штамма 19 в производственных условиях нет единого мнения. Так, одни (В.Б. Бельченко, 1966; А.Т. Жунушов, В.И. Ким, 1991) утверждают, что применение штамма 19 в комплексе противобруцеллезных мероприятий на крупном рогатом скоте в регионе со сложной эпизоотической обстановкой обеспечивало снижение заболеваемости животных и оказывало благоприятное влияние на эпидемиологическую обстановку, способствовало локализации бруцеллезной инфекции в хозяйстве и сокращению затрат на проведение мероприятий.
Ряд исследователей (П.С. Лазарев, 1973; Ф.И. Усманова, 1973; S. Herr et al., 1985), отмечая высокую иммуногенность вакцины из штамма 19, установили ряд ее недостатков — длительную серопозитивность у вакцинированных животных, бруцеллоносительство, а также относительно высокую остаточную вирулентность. Аналогичного мнения придерживаются и другие авторы (А.П. Красиков, 1985; К.Н. Минжасов и др., 1996).
По данным ряда исследователей (К.Н. Минжасов, 1984, 1994; А.А. Высоцкий и др., 1997), в регионах применения этой вакцины на крупном рогатом скоте в числе выявленных положительно реагирующих на бруцеллез животных значительная часть оказалась с поствакцинальными реакциями. Однако надежных методов дифференциации спонтанного бруцеллеза и поствакцинальных последствий к тому времени не было. По данной причине в ряде стран, в том числе и в России, пришлось отказаться от применения этой вакцины на коровах (И.А. Косилов и др., 1986).
В настоящее время вакцина из штамма В.abortus 19 применяется только в исключительных случаях и только с разрешения Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ.
Начиная с 1974 года, в стране применяется живая противобруцеллезная вакцина из слабоагглютиногенного штамма В.abortus 82, предложенная К.М. Салмаковым (1977, 1978). Большинство исследователей высказывают мнение о высокой иммуногенности, сравнительно невысокой сенсибилизирующей и серопозитивной активности данной вакцины (Ф.И. Локтева и др., 1976, 1977); Л.А. Малышева и др., 1996; И.А. Косилов и др., 1986; И.П. Никифоров и др., 1981, 1980; А.И. Климанов и др., 1983; К.М. Салмаков и др., 1978; B.C. Степин и др., 1985). С 1975 года данная вакцина находит более широкое применение в системе противобруцеллезных мероприятий во многих регионах РФ для иммунизации крупного рогатого скота различных половозрастных групп. Первоначально она применялась на телочках 4-5-месячного возраста и телках перед случкой, а в последующем для вакцинации и ревакцинации коров.
В настоящее время рядом исследователей установлена высокая противоэпизоотическая эффективность применения данной вакцины в системе противобруцеллезных мероприятий, за этот период на территории России удалось практически остановить дальнейшее распространение бруцеллеза крупного рогатого скота, значительно сократить количество неблагополучных по бруцеллезу пунктов.
Система мероприятий по профилактике бруцеллеза с применением слабоагглютиногенной вакцины из штамма 82, по мнению ряда исследователей, имеет ряд существенных недостатков: абортогенность штамма, способность его мигрировать от привитых животных к интактным, длительное переживание штамма в организме коров, нестабильность его иммуногенных свойств (B.C. Рягузов и др., 1978). Все это значительно усложняет диагностику бруцеллеза животных от поствакцинальных последствий, а, следовательно, затрудняет объективную оценку эпизоотического состояния оздоравливаемых от бруцеллеза хозяйств. Т.А. Перегудов и соавт. (1987) для снижения абортогенных свойств живой вакцины из штамма 82 рекомендуют применять ее в инактивированной форме. Для предотвращения абортогенности В.С- Степин и соавт., (1981), В.В. Черкасов и соавт. (1980), А.П. Ростов (1980) предложили двухэтапный способ вакцинации штаммом 82; суть метода заключается в последовательном введении 1/100 дозы, затем, через 30-45 дней, полной дозы, что профилактирует поствакцинальные аборты, выявляет животных с латентным течением болезни и создает более напряженный противобруцеллезный иммунитет.
Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. abortus 82-Rr
Изучение свойств вакцинного штамма В. abortus 82-Rr проводили по общепринятой схеме ФАО/ВОЗ. В качестве контролей при этом использовали вакцинные штаммы В. abortus 19, 82, 82-ПЧ, R-1096 и референтные вирулентные штаммы В. abortus 544, В. suis 1330 и B.melitensis 16 М.
При микроскопии мазков, окрашенных по Козловскому, бруцеллы представляли собой короткие палочки красного цвета.
Культура бруцелл штамма 82-Rr в пробирке на скошенном агаре при посеве в первые сутки образовывала колонии прозрачного цвета, которые затем начинали мутнеть. При посеве в бульон наблюдалось просветление бульона, а на дне образовывался осадок.
Культура вакцинного штамма 19 при росте на ППГГА в первые сутки образовывала выпуклые, бесцветные, прозрачные колонии, которые оставались такими же и в течение последующих 3-х суток, а при посеве в бульон наблюдалось его равномерное помутнение.
Штаммы 82, 82-ПЧ и R-1096 при росте на ППГГА образовывали гладкие колонии прозрачного цвета, а при росте на ППГГБ отмечалось легкое помутнение у штамма 82 и R-1096, а у штамма 82-ПЧ бульон оставался прозрачным, на дне образовывался осадок в виде хлопьев.
Референтные штаммы В. abortus 544, В. suis 1330, B.melitensis 16М при росте на скошенном агаре в первые сутки образовывали бесцветные, прозрачные колонии, а при росте на бульоне В. abortus 544 вызывал помутнение его, B.melitensis 16М -легкое помутнение ППГГБ.
Результаты изучения культурально-морфологических свойств вакцинных и референтных штаммов бруцелл представлены в таблице 2.1. Так культуры бруцелл вакцинных и референтных штаммов проявляли одинаковое отношение к повышенному содержанию в среде С02. Все они не нуждались в повышенном содержании углекислого газа. Ряд штаммов бруцелл при росте на питательных средах в процессе метаболизма выделяли сероводород и интенсивность его выделения у бруцелл разных видов была выражена в разной степени. У вакцинного штамма 82-Rr выделение H2S не наблюдалось. Штаммы 19, 82, 82-ПЧ и R-1096 выделяли сероводород, но интенсивность его выделения была невысокая. Наиболее интенсивную и продолжительную (3-4 дня) продукцию H2S наблюдали у штамма В.suis 1330, несколько меньшую у культур В. abortus 544. Культура В melitensis 16М не выделяла сероводород.
В результате изучения способности культур бруцелл к лизису фагом "Тб" применили две концентрации фага: рабочую дозу (RTD) и разведенную дозу (1 мл фага + 9 мл ППГГБ). Штамм 82-Rr лизировался фагом "Тб" в обоих разведениях. Штаммы 19 и 82 также лизировались в двух концентрациях фага, культуры штаммов 82-ПЧ и R-1096 не лизировались фагом "Тб".
Из вирулентных штаммов лизировался В. abortus 544 как в рабочей дозе, так и в разведенной дозе фага. В melitensis 16 М и В suis 1330 не лизировались ни с одной из этих доз.
Культура штамма 82-Rr росла во всех разведениях анилиновых красок. Штамм 19 рос на агаре с фуксином и не рос на средах, содержащих тионин. Штаммы 82, 82-ПЧ и R-1096 росли во всех разведениях фуксина и тионина.
Из референтных штаммов В. abortus 544 рос на среде с фуксином и рост не отмечался на среде с тионином, а В suis 1330, наоборот, рос на среде с тионином и не рос на среде, содержащей фуксин. В. melitensis 16 М рос во всех разведениях тионина и фуксина.
Окраску колоний по Уайт-Вилсону (кристалвиолетом в разведении 1:2000 в течение 30 с) проводили на 5-е сутки роста. После окраски колонии были просмотрены визуально. Было установленно, что колонии штамма 82-Rr окрашивались в фиолетовый цвет с радиально отходящими от центра желтыми полосами, т.е. по окраске находились в SR-форме. Колонии штамма 19 по окраске находились в S-форме, имели желтый цвет по центру и фиолетовый ободок по краю. Штаммы R-1096 и 82-ГТЧ окрашивались в фиолетовый цвет. У штамма 82 колонии окрасились в желтый цвет с отдельными фиолетовыми вкраплениями. Колонии референтных штаммов не окрашивались кристалл виол етом.
Вакцинный штамм 82-Rr давал сплошной рост на среде, содержащий 50мкг/мл рифампицина, тогда как ни один из вакцинных и референтных штаммов на среде, содержащей антибиотик роста не давал.
Штамм 82-Rr в пластинчатой РА на стекле реагировал положительно с S-, R, и монорецепторнои "А" сывороткой. Культура штамма 19 агглютинировалась с S- сывороткой и "А"- монорецепторнои сывороткой, а с R-сывороткой и "М"-монорецепторной сывороткой давала результат отрицательный. Штаммы В. abortus 82, 82-ГТЧ в РА на стекле показывали положительный результат с S- и R- сыворотками и "А"- монорецепторнои сывороткой и отрицательный результат с "М" - монорецепторнои сывороткой, штамм R-1096 реагировал только с R сывороткой.
Референтные штаммы В. abortus 544 и В. suis 1330 агглютинировались в S- и "А"- сыворотках и реагировали отрицательно с R- и "М"- сыворотками.В. melitensis 16 М давал положительный результат с "М"- монорецепторнои сывороткой и S -сывороткой, а с R- и "А"- результат отрицательный.
Все штаммы, кроме штамма R-1096, в пробе термоагглютинации показывали отрицательный результат.
В пробе с трипафлавином (акрифлавином) штамм 82-Rr давал положительную реакцию агглютинации на стекле, образуя хлопья, которые склеивались в комочки. Штаммы 82, 82-ГТЧ и R-1096 также агглютинировали с трипафлавином, а штамм 19 и референтные штаммы давали отрицательную реакцию.
Таким образом, из проведенных исследований видно, что вакцинный штамм 82-Rr хорошо растет на печеночных средах в аэробных условиях, не образуя при этом H2S. Отмечался его рост на средах во всех разведениях тионина и фуксина, колонии окрашивались по Уайт-Вилсону в фиолетовый цвет с радиально отходящими от центра желтыми полосами, он рос на среде, содержащей рифампицин. При постановке РА на стекле давал положительный результат с S-, R- и монорецепторнои "А" -сыворотками, лизировался фагом "Тб" во всех разведениях и показывал положительные пробы на диссоциацию.
Стабильность свойств штамма 82-Rr при пассажах через организм морских свинок и питательные среды
У животных первой группы, ревакцинированных вакциной из штамма 82-Rr, % иммунных животных составил 75. Удалось выделить всего лишь одну культуру вирулентного штамма от одной морской свинки из регионарного правого пахового лимфатического узла (место заражения). У одного животного иммунитет был стерильным, а у 2-х морских свинок было выделено по одной культуре бруцелл штамма 82-Rr. ИИ составил 1,12±0,3%, при ИВС, равном 1,77±0,13. В серологических реакциях с S-антигеном в РСК положительно реагировала только одна морская свинка в титре 16,7, а в РСК с R-антигеном в среднем титры антител составили 23,3+8,8.
У животных второй группы, ревакцинированных вакциной из штамма R-1096, % иммунных животных составил 85,0. В этой группе удалось выделить одну культуру бруцелл вирулентного штамма. ИИ был равен 1,13±0,2 при ИВС - 1,63±0,17. Сыворотка крови с S-антигеном в РСК реагировала отрицательно, тогда как титры антител с R-антигеном в среднем равнялись 11,0±0,4.
У животных третьей группы, ревакцинированных вакциной из штамма 82-Пч, % иммунных животных составил 75,0. Так же, как и в первой группе, выделили одну культуру бруцелл вирулентного штамма из правого пахового лимфатического узла. ИИ был равен 1,57±0Д2 при ИВС - 1,58±0,11. Сыворотка крови с S-антигеном в РСК реагировала только у одной морской свинки в титре 1:5, а титры антител с R-антигеном в среднем равнялись 60,0±8,9.
Таким образом, ревакцинация морских свинок вакциной из штамма В. abortus 82-Rr через 3 месяца по фону вакцины из штамма 82, создает иммунитет у 75% животных. 2.7 Абортогенные свойства штамма В. abortus 82-Rr
Целью данного исследованя было установить наличие абортогенных свойств нового антибиотикорезистентного штамма бруцелл: В. abortus 82-Rr на беременных животных, не знакомых ранее с противобруцеллезными вакцинами, и изучить динамику антителообразования с применением S- и R-антигенов.
В опыте 8 перед введением вакцины всех животных проверили на беременность путем ректального исследования, а также взяли кровь для исследований на бруцеллез.
В результате проведенной работы установили, что перед введением вакцины все животные реагировали отрицательно в РА, РСК с единым бруцеллезным антигеном и в РСК с R-антигеном.
Изучение динамики антителообразования показало, что опытный штамм, как и исходный штамм 82, является слабоагглютиногенным по S-антигену. Так, у нетелей, привитых вакциной из штамма 82-Rr, при исследовании через 15 дней после введения биопрепарата РА была положительной лишь у одного животного в титре 100МЕ, у двух других результаты реакции были отрицательными. РСК в эти сроки исследований была отрицательной. Тогда как в РСК с R-антигеном животные реагировали в высоких титрах антител от 1:20 до 1:1280, в среднем 647,0±364,0.
В последующие сроки исследований РА и РСК показывали отрицательный результат, а показатели РСК с R-антигеном были положительными до конца опыта. Количество антител также колебалось в различные сроки исследований. Их титр падал от 35,0±22,9 через 1 месяц после прививки до 15,0±5,0 через 3 месяца, а через 4 месяца вновь титр поднялся до 43,3±20,3. В конце опыта, через 5 месяцев, животные реагировали в титре 21,7±10,1. Ни одно животное, при наблюдении за ними в течение 5 месяцев после прививки, не абортировало, когда как в контрольной группе нетелей, привитых вакциной из исходного штамма 82, одно животное абортировало через 3,5 месяца после вакцинации. Поствакцинальный характер аборта был подтвержден серологическим исследованием с применением S- и R- антигенов. Таким образом, на беременных нетелях и коровах было показано отсутствие абортогенных свойств у антибиотикорезистентного варианта штамма В. abortus 82 - 82-Rr.
