Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Существующая в настоящее время опасность возникновения вспышек чумы в эпидемически неблагополучных районах, усугубляющаяся отсутствием надежных средств специфической профилактики этого особо опасного инфекционного заболевания, не вызывает сомнения в актуальности проблемы поиска потенциальных компонентов противочумных препаратов нового поколения.
Основу полиантигенной вакцины должна составлять смесь охарактеризованных высокоишуногенных и безвредных для человека антигенов. Одним из перспективных компонентов такой вакцины явля-. ется ЛГІС, обладающий вырааенным ишуномодулирующим действием (Бахрах Е. Э.. Вейнблат В. И.. Тараненко Т. М. и др., 1976. Тараненко Т.М.. І988, Дальвадянц С.М.. Земцова И. Н., Белобородое Р.А. и , др., 1980). Однако значительная эндотоксическая активность ЛПС служит препятствием его использованию в составе профилактических препаратов, обусловливая необходимость его детоксикации или модификаций, направленных на ослабление патогенных и усиление им-муногенных свойств (Назарова Л.С., Тараненко Т. М., Исупов И. В., 1994, Станиславский Е. С., 1975, Тараненко Т. М.. Ермакова Г. В., Андреева И.П. и др.. 1990, Brade Н., Brade L., Rietschel Б., 1988. Munford R., 1988).
Известно, что токсичность ЛПС определяется наличием в составе его липида А глюкозаминсвого дисахарида, несущего две фосфатные группировки, 5-6 жирных кислот и имеющего хотя бы одну ацилоксиацильную связь (Книрель Ю.А., Кочетков Н.К., 1993, Brade Н., Brade L.. Rietschel Е.. 1988. Munford R.. 1988 ).
В связи с этим, уменьшения или отмены токсичности ЛПС можно достигнуть как путей дезацилирования (Munford R., 1988), так и-дефосфорилирования его молекул (Kotani S., Takada Н., Tsujlmo-to М. et al. 1984). При изучении свойств детоксицированных разными способами ЛПС энтеробактерий установлено, что снижение токсичности ЛПС возможно без угнетения иммуностимулирующей активности этого важного компонента наружной мембраны грамотрицатель-ных бактерий (Brade Н., Brade L., Rietschel Е., 1988, Cliedid L., Audibert F., Bona С. et al. 1975, Munford R., Hall С,1986).
В последние годы показана возможность получения модифицированных форм ЛПС чумного микроба со сниженной токсичностью (Ерма-
нова Г. Б., Тараненко Т.М., Наумов А. Б. и др.. 19Э2. Гусева Н. П., Ермакова Г. Е., Наумов А. В. и др., і591. Федорова Б. А., Ермакова Г.В.. Тараненко Т.М. и др., 1994).
Однако до настоящего времени отсутствуют сведения о влиянии различных методов химической детоксикаиии ЛПС чумного микроба на его химический состав и иммунобиологические свойства. Не ясно -значение отдельных структурных компонентов молекулы ЛПС в реализации ее биологической активности. Вместе с тем, получение химически детоксицированных производных ЛПС чумного микроба представляет большой интерес, так как открывает перспективу включения этого антигена в состав профилактических препаратов нового поколения. Это, в свою очередь, требует проведения физико-химического анализа и сравнительного исследования биологических свойств исходного и детоксицированных препаратов ЛПС: токсичности, цито-токсичности, протективности, адъювантности, влияния на ишуно-компетентные клетки, способности индуцировать синтез цитокинов и вызывать гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Изучение этих вопросов позволит сделать вывод о целесообразности использования детоксицированных производных ЛПС при конструировании полиантигенных противочушых вакцин.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: получение и сравнительное изучение физико-химических и биологических свойств детоксицированных производных ЛПС чумного микроба для обоснования целесообразности их включения в состав профилактических препаратов, а также разработка клеточных моделей оценки степени детоксикации препаратов ЛПС.
1.Получить очищенные препараты дезацилированного (ДЛПС) и дефосфорилированного (ЛПСР") производных ЛПС чумного микроба; изучить структурные изменения и физико-химические свойства полученных препаратов в сравнении с исходным ЛПС.
2.Провести сравнительную оценку токсичности модифицированных препаратов ЛПС и их цитотоксичности в отношении перитонеаль-ных макрофагов (ПМ) ингактнмх экспериментальных животных.
-
Охарактеризовать протективную и адъшантную активности исходного и модифицированных препаратов ЛПС.
-
Изучить взаимодействие ЛПС и его модифицированных производных с клетками системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ).
5.Оценить митогенную активность исходного и модифицированных препаратов ЛПС.
6.Исследовать способность препаратов ЛПС индуцировать продукции моно- и лиыфокинов (ИЛ-1. ФНО, факторов, активирующих нейтрофилы, ИЛ-2), а также-нейтрофилокинов, влияющих на функциональную активность макрофагов.
7.Изучить способность препаратов ЛПС индуцировать формиро
вание ГЗТ. '
9. Разработать клеточные модели оценки степени детоксикации препаратов ЛПС чумного микроба.
- Впервые показано, что мягкая щелочная обработка ЛПС чумно
го микроба наряду с дезацилированием обеспечивает элиминирование
фосфорсодержащих групп, соответствующих сигналам -2,0 и +2,7ррт.
Доказано, что обработка ЛПС чумного микроба плавиковой кислотой не сопровождается изменением жирнокислотного состава молекул, а характеризуется отщеплением фосфорсодержащих групп, дающих сигналы -2,0 и +4,5 ррю.
Показано, что дезацилирование ЛПС снижает токсичность и ци-готоксичность исходного препарата, обеспечивая сохранение его серологической и адъювантной активности и усиление протективных свойств.
Выявлено, что детоксицированные препараты ЛПС, особенно ЇЛПС, усиливают киллерную активность ПМ экспериментальных живот-uix в опытах in vivo и in vitro в отношении вакцинного штамма іумного микроба; активнее, чем исходный препарат, стимулируют йкрофагальную трансформацию моноцитов периферической крови и іерераспределение субпопуляций в суммарном пуле ПМ эксперимен-"альных животных.
Установлено, что детоксикация ЛПС сохраняет его способность іьшвать формирование ГЗТ.
- Выявлено, что детоксикация ЛПС, особенно методом дезацили-
ования, усиливает митогенную активность препарата.
- Показано, что модифицированные производные ЛПС чумного
- & -
микроба являются активными индукторами цитокинов, осуществляют инициацию и регуляцию иммунного ответа макроорганизма.
- Обосновано преимущество детоксикации ЛПС чумного микро методом дезацилирования перед методом дефосфорилирования. -ДЛП по сравнению с ЛПСР". менее токсичен и обладает более выраженн иммуностимулирующей активностью. Это подтверждает существовал взаимосвязи структурных изменений с биологической актиеност ЛПС.
Сравнительное изучение физико-химических и биологическ свойств исходного и модифицированных препаратов ЛПС чумного ми роба показало-преимущества метода дезацилирования по сравнению дефосфорилированием, что позволяет рекомендовать ДЛПС в качест: одного из потенциальных компонентов профилактических противочуі них препаратов нового поколения.
Полученные препараты исходного и модифицированных произво, них ЛПС чумного микроба используются при изучении пато- и ими; ногенеза чумы.
В Ростовском-на-Дону'противочумном институте (РПЧИ) получі набор МКА к антигенным детерминантам,ЛПС чумного микроба, защи' ные свойства которых продемонстрированы на модели пассивной и мунизации экспериментальных животных. -
Предложен способ оценки степени детоксикации препаратов Ш с помощью определения их цитотоксичности в отношении ПМ экспер) ментальных животных.
По материалам диссертации оформлены и утверждены Ученым С< ветом РПЧИ два нормативно-технических документа:
-
Инструкция по изготовлению и контролю очищенного ЛИПОП( лисахарида чумного микроба;
-
Инструкция по изготовлению и контролю дезацилированної липополисахарида чумного микроба.
І. Дезацилирование ЛПС чумного микроба путем мягкой щело1 ной обработки сопровождается отщеплением ряда жирных кислот элиминированием фосфорсодержащих групп, соответствующих сигнал* -2,0. и +2, 7 ррт.
2..Дефосфорилирование ЛПС чумного микроба путем обрабоп плавиковой кислотой не сопровождается изиенением кирнокислотног
- о -
coctasa молекул, а характеризуется отщеплением фосфатных групп, соответствующих сигналам -2,0 и +4,5. ррю. '
3. Детоксикация ЛПС чумного, микроба, особенно методи.! деза-цилирования, сохраняет его серологические и адъюзактные свойства и повышает протективную активность препарата.
-
Детоксицированные препараты ЛПС более интенсивно, по сравнению с исходным, активируют ишунокомпетентные клетки.
-
Модифицированные производные ЛПС чумного микроба являются активными индукторами цитокинов, осуществляющих инициации и регуляцию иммунного ответа ыакроорганизма.
-
Детексикация ЛПС сохраняет его способность вызывать формирование ГЗТ.
-
Преимущества детоксннации ЛПС чумного микроба, методо;.! дезацилирования в сравнении с дефосфорилированиеи, связанные с резким снижением токсичности и цитотоксичности ДЛПС при сохранении и дахе усилении иммуностимулирующей активности исходного препарата.
Материалы, изложенные в диссертации, обсуждены на: . -.Международной конференции "Иммунодиагностика, ишунофер-ментный анализ и иммунотерапия" (Витебск, 19S5).
Межгосударственной научной- конференции "Профилактика и мера борьбы с чумой" (Алматы, 19S4).
Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопроса профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1394).
Российской научной конференции "Генетика и биохимия.вирулентности возбудителей ООН" (Волгоград, 1992).
Российской научной конференции "Иммунология и специфичес-чая профилактика СЮИ" (Саратов, 1993).
Российской научной конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики 00И" (Омск, 1993)..
IY Путинском Совещании "Культивирование клеток животных и іедрвена" (Пущино,1993).
Всероссийской конференции "Биосинтез и деградация микробных биополимеров: Фундаментальные' и.прикладные аспекты" (Пущино, 1995).
12-ой Республиканской конференции "Факторы гуморального клеточного иммунитета при различных физиологических и.патолог ческих состояниях (Челябинск, 1S95).
Первой конференции Северо-Кавказского региона "Совреме ные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1S95).
VIII Международном конгрессе по иммунологии слизист (Сан-Диего, США. 1995).
Общеинститутских научных конференций РПЧИ (Ростов-на-Д ну, 1993. 1994).
Диссертация обсуждена и одобрена на общеинститутской конфі ренции РПЧИ.
Основные положения диссертации отражены в 19 опубликованш работах.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: