Введение к работе
Актуальность темы
Биолюминесценция - ферментативный процесс,
сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света
(Hastings, Nealson, 1977). У микроорганизмов центральным звеном
подобной реакции является люцифераза - флавинзависимая
монооксигеназа, катализирующая окисление ФМН-Н? и длинноцепочечного альдегида в присутствии кислорода до ФМН, Н20 и соответствующей жирной кислоты с испусканием кванта света в видимой сине-зеленой области спектра (Hastings et al., 1985).
Высокая степень сопряженности биолюминесценции с основными энергетическими потоками в бактериальной клетке (Meighen, 1991) явилась условием для использования светящихся микроорганизмов при тестировании различных природных сред, биотоксичиость которых может быть интегрально оценена через изменение интенсивности биолюминесценции (Kaiser, 1998).
Клонирование генов люминесценции в широком круге патогенных и условно-патогенных микроорганизмов создало условия для существенного расширения сферы биолюминесцентного анализа, в том числе в направлении исследования живых систем (Contag etal, 1995; Virta et al., 1998). При этом в подобных условиях интенсивность биолюминесценции рассматривается как отражение числа бактериальных клеток, сохранивших свою жизнеспособность после взаимодействия с бактерицидными системами человека или животных.
В частности, на данной основе базируется широкая группа методов «биолюминесцентного имеджинга» (Rice et al., 2001), позволяющего осуществлять фотонную детекцию патогенных микроорганизмов непосредственно в органах и тканях лабораторных животных приї экспериментальной инфекции. Другой подход ориентирован на оценку бактерицидных свойств гуморальных и клеточных факторов противоинфекционной резистентности при проведении исследований in vitro (Forde et al., 1998; Kampmann et al., 2000). При этом среди подобных методов достаточно перспективным представляется биолюминесцентная оценка фагоцитоза, основанная на использовании в качестве фагоцитируемых объектов светящихся микроорганизмов (Barak et al., 1983, 1984; Ширшев с соавт., 2007).
Однако до настоящего времени не определены многие условия для использования люминесцирующих бактерий в системе оценки фагоцитоза, отсутствуют данные о возможности совместного определения интегрально характеризующих фагоцитарную реакцию феноменов биолюминесценции и хемилюминесценции, а также не разработаны технические устройства, специализированные именно для биохемилюминесцентного исследования фагоцитарной системы.
Цель работы — разработка методических подходов к оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека с использованием рекомбинантных люминесцирующих бактерий.
Задачи исследования
Определение оптимальных условий для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза.
Разработка биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови человека.
Создание устройства для осуществления технологии оценки фагоцитоза с использованием люминесцирующих бактерий.
Научная новизна
Определены оптимальные условия для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза. Разработан оригинальный вариант опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий нормальным иммуноглобулином человека в конечной концентрации 10 мг/мл в течение 10 мин при 37 С, что исключает не связанные с фагоцитозом киллинговые эффекты и определяедюе этим подавление интенсивности биолюминесценции, одновременно обеспечивая достаточный уровень последующей активации фагоцитов. Показана предпочтительность использования в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих бактерий Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Pholobacterium leiognathi, демонстрирующих пропорциональность между остаточными значениями свечения и количесгвом сохранивших жизнеспособность бактериальных клеток-мишеней. Установлено опережающее по отношению к развитию бактерицидного эффекта подавление биолюминесценции, в качестве одной из причин которого определено воздействие на ферментную систему генерации свечения продуктов пероксидации бактериальных жирных кислот.
Установлены различия в спектрах бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов, определяющие возможность их раздельной регистрации на неперекрывающихся длинноволновом (> 540 нм) и коротковолновом (< 420 нм) участках спектра. На данной основе разработан биохемилюминесцентный метод оценки фагоцитоза, позволяющий проводить одновременную оценку активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов и выраженности обусловленного их действием киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней, приоритет которого подтвержден патентом на изобретение №2366953 «Биохемилюминесцентный способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов».
Для реализации данного способа разработан и создан опытный образец двухканального биохемилюминометра, позволяющего проводить
регистрацию анализируемых параметров в режиме реального времени (Патент РФ на полезную модель № 49998). Новизна этого устройства определяется наличием в его конструкции двух независимых регистраторов (фотоэлектронных умножителей) и двух сменных кгаветных отделений, использование которых позволяет проводить одновременное кинетическое измерение интенсивности свечения смесей «бактерии : фагоциты» в одной пробе в двух диапазонах длин волн, либо в двух параллельных пробах различного компонентного состава во всем спектральном диапазоне (Патент РФ на полезную модель № 64373).
Теоретическая и практическая значимость
Разработанный метод оценки фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов существенно сокращает длительность и трудоемкость исследований, а также позволяет в режиме реального времени получать комплексную информацию как об уровне активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов, так и об интенсивности обусловленного этим бактерицидного эффекта. Апробация разработанной биохемилюминесцентной технологии при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови у лиц, больных сахарным диабетом 2-го типа позволила констатировать сочетанное изменение регистрируемых показателей (Акт внедрения МСЧ ГОУОГУ от 10.06.2009 г.)
Техническая документация на двухканальный биохемилюминометр и комплект сменных кюветных отделений к нему передана Специальному конструкторскс-технологическому бюро «Наука» Красноярского научного центра Сибирского отделения Российской Академии наук, где реализована в серии устройств линии «БЛМ 8802 МК» (Акт внедрения от 29.11.2007 г.). При этом данное устройство, наряду с его прямым использованием при оценке фагоцитоза, может применяться и для совершенствования иных технологий люминесцентного анализа, оценивающих свободнорадикальные и ферментативные процессы в живых организмах (перекисное окисление липидов, биотестирование и др.).
Основные положения, выносимые на защиту
В качестве объекта для биолюминесцентной оценки фагоцитоза рекомендуется рекомбинантный люминесцирующий штамм Escherichia coli с клонированным /га-опероном Photobacterium leiognathi, опсонизированный нормальным иммуноглобулином человека.
Раздельная оценка бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции в фагоцитарной системе возможна на неперекрывающихся (> 540 нм и < 420 им) участках спектров их световой эмиссии.
Реализация биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза возможна с использованием двухканалыюго
биохемилгоминометра, снабженного располагаемыми между анализируемой пробой и фотоэлектронными умножителями светофильтрами.
Связь автора с научными программами и собственным вклад автора в исследования
Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200407020 «Использование природных и генно-инженерных люминесцирующих бактерий для тестирования абиотических сред и биологических жидкостей», а также при поддержке фанта РФФИ 06-04-9690б-р_офи «Разработка биохемилюмииесцентного метода оценки фагоцитоза в режиме реального времени и создание устройства для его осуществления».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы
Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008), Ш Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь - Н. Новгород, 2008), Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2009).
Разработка «Двухканальный биохемилюминометр и технологии его использования для оценки бактерицидных систем крови человека» награждена золотой медалью VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008).
Основные результаты проведенных исследований представлены в 11 печатных работах, в том числе 4 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований. По материалам исследований получен патент РФ на изобретение и 2 патента РФ на полезные модели.
Структура и объем диссертации.
