Введение к работе
Актуальность проблемы. В условиях рыночной экономики приобретает большое значение повышение качества коммерческой продукции и снижение ее себестоимости. Эти требования в полной мере относятся к производству профилактических препаратов, в том числе и к чумной живой вакцине ЕВ. Биотехнология ее довольно хорошо отработана. Однако, еще существуют резервы совершенствования различных этапов изготовления препарата. Прежде всего это касается вопроса увеличения выхода биомассы,которая является исходным сырьем, в значительной мере определяющим качество вакцины. А.М.Бондаренко с соавторами 11992) было показано, что на этапе замораживания-высушивания выявляются дефекты клеток, связанные с процессом культивирования.
Б производстве бактерийных препаратов необходимо иметь среда, обеспечивакщие максимальный выход рликробной массы, состоящей из популяции клеток, обладающих всеми типичными свойствами, присущими исходной культуре.
Для получения биомассы в процессе производства экспериментальных и коммерческих серий чумной вакцины были использованы различные питательные среды, изготовленные из мяса, рыбы, казеина, кровяных сгустков, кукурузного экстракта, сои, аминопептвда и т.д. (Е.И.Коробкова, 1956; Е.Э.Бахрах с соавт., 1960; И.В.До-марадский с-соавт», 1961; Н.Ф.Быстрый с соавт., 1961; И.И.Николаев с соавт., 1964, 1969; А.А.Канчух с соавт., 1964; А.И.Тинкер с соавт., 1966, 1985; Н.К.Муравьева, 1969; А.Ф.Филиппов с соавт., 1970, 1973; М.А.Красикова и А.А.Рогачева с соавт., 1974; В.Н.Милютин с соавт., 1975; Э.Г.Шпилевая с соавт., 1983; О.В.Шеремет, 1978, 1983; Т.Н.Фунтикова с соавт., 1985 и др.).
Однако, из числа указанных сред в промышленном выпуске чумной вакцины применялись только две среды, из гидролизатов мяса или казеина по Хотткнгеру. В процессе же изготовления препарата в Ставропольском институте в течение 35-летнего периода использованы только мясные среды и попытка замены их казеиновыми сопровождалась резким снижением жизнеспособности вакцины.
Разработка питательных сред для коммерческого выпуска чумной вакцины из других основ по разным причинам не была доведена до конца. Наиболее полно в этом отношении изучены среды, приготовленные на кукурузной основе, которые представляют интерес в связи с возможностью замены дорогостоящего сырья более дешевым непищевым.
Первые попытки использовать кукурузные среды с указанной целью были сделаны А.А.Канчух с соавторами (1961,1964). Они применяли кислотные гидролизаты кукурузного экстракта сгущенного. Качество чумпой вакцины, приготовленной на этой среде, соответствовало требованиям нормативно-технической документации, но промышленная технология культивирования биомассы на была соблюдена. Микробные клетки выращивали в матрацах.
3.А.Чернова с соавторами (1987) использовала сухую среду Майского-Куцемакиной, созданную ка основе кукурузного экстракта, в процессе производства чумной вакцины в АКМ-Ш. Ими был отмечен факт, имеющий решающее значение при выборе коммерческих серий питательной среда, заключающийся в том, что концентрация микробной взвеси вдвое, втрое уступала, а -биологическая, наоборот, вдвое превосходила рост на СМК по сравнению с агаром Хоттингера. Это авторы объясняли тем, что СМК - высокопитательный агар, но с низким содержанием аминного азота. Полученные результаты согласовывались с выводами Э.Г.Шпилевой (1983) о том, что несмотря на
доступность растительных субстратов, они не получили широкого распространения в производстве бакпрепаратов из-за невысокого показателя аминного азота.
Повысить его содержание в среде можно за счет комбинации переработанных продуктов растительного и животного происхождения, богатых белковыми субстратами. На это также указывали Э.А. Чернова с соавторами 11987).
Сказанное выше делает понятным необходимость изучения возможности конструирования комбинированных питательных сред на основе дешевих я недефицзганых веществ, которым является кукурузный экстракт, в сочетании с казеином, амшопептидом и т.д.
В то же время современные требования предусматривают использование наиболее стандартных сухих питательных сред. В процессе производства чумной вакцины ЕВ такие среды до сих пор не применяется, поэтому разработка их является решением еще одной необходимой задачи.
Учитывая, что питательные агары, полученные из кукурузного сырья, обеспечивают рост высокого процента колоний при низких посевных дозах, целесообразно использовать их для определения жизнеспособности клеток в суспензиях.
Следовательно, разработка унифицированной сухой питательной среды на кукурузной основе в сочетании с переварами из белковых непищевых веществ является актуальной проблемой как для накопления биомассы, так и определения жизнеспособности клеток в процессе производства чумной вакцины ЕВ.
Цель работы: конструирование комбинированных питательных сред на основе дешевых и недефицитных веществ, которым является кукурузный экстракт в сочетании с продуктами гидролиза белковой природы и использование их в производстве чум-
ной вакцины ЕВ.
Задачи исследования:
показать возможность замены агара Хоттингера из мясного гидролизата средой из непищевых основ в процессе производства чумной вакцины ЕВ;
провести сравнительное изучение продуктивности питательных сред, приготовленных из мяса, кукурузного экстракта, амино-пептида, казеина или их сочетаний;
приготовить сухую питательную среду для накопления биомассы чумного микроба из непищевых основ, сравнительно дешевую и соответствующую требованиям для производства профилактических препаратов;
изготовить экспериментально-производственные серки чумной вакцины ЕВ в промышленных условиях с использованием разработанной среды, определить их качество в соответствии с ігіГД и внедрить в практику результаты НИР;
изучить возможность использования оптимизированной сухой питательной среди для контроля жизнеспособности клеток в процессе производства чумной вакцины ЕВ и внести ее в РП на выпуск препарата.
Научная новизна. Впервые сконструирована стандартная сухаэ кукурузш-казеииовая среда, используемая для накопления биомассы в процессе производства чумной вакцины ЕВ и определения жизнеспособности ее на этапах изготовления и контроля готового препарата.
Впервые предложено для конструирования питательной среды в производстве чумной вакцины ЕВ сочетание основ кукурузного экстракта и казеина, обеспечивающих необходимую потребность в факторах роста бактерий вакцинного штамма, сравнительно дешевое и
исключающее дефицитное высокосортное мясо. Использование сухой среды позволит стандартизировать биотехнологию препарата за счет длительного применения одной серии со строго постоянными параметрами.
На основании комплексного изучения и апробации в условиях производственного отдела показано, что чумная вакцина ЕВ, приготовленная из биомассы, выращенной на кукурузно-казеиновой среде, по всем тестам (культурально-морфологические, биохимические свойства, внешний вид, остаточная влажность, хиїзнеспособность, безвредность, иммуногенность и т.д.) соответствовала требованиям ФС 326 ВС-92 и РП № 368-92.
Полученные результаты могут бить использованы и при производстве других профилактических препаратов.
Практическая ценность:
-
Сконструирована сухая кукурузяо-казеиновая питательная среда для производства чумной вакцины ЕВ.
-
Приготовленные экспериментально-производственные серии чумной вакцины ЕВ из биомасс, внращенных на кукурузно-казеиновогл агаре, получили положительное заключение ЛСК ІИСК им.Л.А.Тарасовича.
-
На основании результатов исследований включена_в_РП №368-92 на вакцину чумную сухая кукурузно-казеиновая питательная среда для:
- выращивания биомассы чумного вакцинного штамма ЕВ; ч- определения, выживаемости-микробов в биомассе на этапах приготовления препарата и\контроля готовой продукции.
4. По материалам исследований составлены и утверждены 14.
10.87 г на Ученом Совете НШІЧИ Кавказа и Закавказья "Методичес
кие рекомендации по использованию агара из кукурузного экстракта
и СЖ (среда В.Г.Майского и А.З.Куцемакиной) на различных этапах контроля при производстве чумной живой сухой вакцины и в ОБК".
5. Данные исследований и положительное заключение ЛСК ГИСК им. Л.А.Тарасевича на качество чумной вакцины ЕВ были использованы в виде дополнительного обоснования для составления изменений 1 2 к Ш В 37-86 на внедрение сухой посевной производственной культуры.
Материалы диссертации доложены на 6 краевой научной конференции, посвященной 70-летию Великой Октябрьской социалистической революции (г.Ставрополь, 1987), на итоговой научной конференции "Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики f їссоо опасных инфекций" С г. Ставрополь, 198Э), на областной научной конференции молодых ученых "Эпизоотология, микробио' логля к иммунология" (Ростов-на-Д1ону, 1989), на менлабораторной конференции Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 1994).
Публикации. Основное содержание отражено в 7 опуб линованных работах.
Положения, выносимые на защиту:
-
Необходимость конструирования сухой питательной среды из непищевого сырья для производства чумной вакцины ЕВ.
-
Оптимальный способ приготовления питательных основ для агаризованной среды.
-
Отработка условий получения сухой стандартной среды.
-
Материалы по изучению и внедрению чумной вакцины ЕВ, приготовленной с использованием сухой стандартной питательной среды из непищевого сырья.
-
Возможность использования разработанной питательной ср<
для определения живых микробных клеток в биомассе и ресуспензи-рованной чумной вакцине ЕВ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 45 таблицами и 1 рисунком, 2 фотографиями. Библиографический указатель содержит 242 литературных источника, в том числе 206 работ отечественных и 36 зарубежных авторов.