Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum Кирюхин, Михаил Юрьевич

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кирюхин, Михаил Юрьевич. Изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.00.07 / ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.- Москва, 1993.- 23 с.: ил. РГБ ОД, 9 92-5/1358-X

Введение к работе

Актуальность темы. Микроорганизмы, способные использовать восстановленные одноуглеродные (С1) соединения в качестве единственного источника углерода и энергии, давно привлекают внимание ученых. Это обьясняется как научным, так и практическим интересом. Представляющие собой таксономически неоднородную группу, эти микроорганизмы обладают рядом преимуществ по сравнению с гетеротрофа-ми. Главным образом это - непатогенность, способность расти на простых средах, используя относительно дешевые субстраты ( метан, метанол), прекрасные ростовые характеристики и качество биомассы. Другой важный аспект применения метилотрофов в промышленности связан с их способностью осуществлять биотрансформации. Наконец, ме-тилотрофы могут служить основой для создания генноинженерных штаммов-продуцентов аминокислот, витаминов, а также гетерологичных белков.

Регуляция синтеза ферментов, участвующих в ассимиляции аммония ранее была изучена у многих бактерий как в стационарных условиях роста, так и при хемостатном культивировании. Среди них есть и работы, посвященные факультативным метилотрофам Hyphomicrobium ZV620 [58], Hyphomicrobium X [47], а так же метилотрофным дрожжам Hansenula polymorpha [48]. Однако до настоящего времени отсутствуют сведения о регуляции ассимиляции аммония у облигатных метилотрофов в условиях хемостатного культивирования. Отсутствует также информация о динамике экспрессии ферментов в переходных условиях роста, которые гораздо чаще встречаются как в природных условиях, так и в периодических и накопительных культурах. Использование переходных условий роста в хемостатной культуре может дать ценную информацию о регуляции ключевых ферментов при изменении внешних условий. К настоящему времени имеются данные по очистке и изучению свойств глутаматдегидрогеназ (GDH) из облигатного метилотрофа Methylophilus methanolovorus [9] и двух факультативных метилотрофов Methylobacterium extorquens AMI [18] и Hyphomicrobium X [46]. Отсутствие достаточной информации о свойствах GDH для метилотрофов, реализующих гексулозофосфатный путь ассимиляции С1 -соединений является существенным пробелом.

Ферменты цикла трикарбоновых кислот у метилотрофов также изучены недостаточно. К настоящему времени показана определенная корреляция между путями ассимиляции С1-соединений и уровнями активности ферментов ЦТК [35. 36, 83, 114].

- г -

Сведения об очистке и изучении свойств цитратсинтазы (CS) и НАД и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (ICDH) отсутствуют в литературе. Некоторые данные по регуляции этих ферментов получены при использовании бесклеточных экстрактов или частично очищенных препаратов ферментов [15, 37, 96, 97]. Для облигатных метилотрофов до сих пор отсутствует сведения о регуляции НАД и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (за исключением Pseudomonas W6), не было сделано попытки установить, принадлежат ли активности с двумя кофакторами разным изоферментам, либо это свойство фермента с двойной специфичностью. Эти данные были бы очень полезны для понимания механизмов регуляции ассимиляции аммония, поскольку в случае облигатных метилотрофов ЦТК разомкнут на уровне оксоглутаратдегидроге-назы и выполняет исключительно биосинтетическую функцию, обеспечивая 2-оксоглутаратом глутаматдегидрогеназную реакцию.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи:

изучение регуляции ассимиляции аммония в условиях непрерывного культивирования в условиях хемостата;

изучение регуляции ассимиляции аммония в переходных условиях культивирования;

выделение, очистку и изучение свойств НАДФ-зависимой глутаматде-гидрогеназы из М. flagellatum;

выделение, очистку и изучение свойств НАД(Ф)-зависимой изоцит-ратдегидрогеназы из М. flagellatum;

выделение, очистку и изучение свойств цитратсинтазы из М. flagellatum.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые у обли-гатного метилотрофа изучена физиология ассимиляции аммония в условиях непрерывного культивирования в хемостате, а также в переходных условиях культивирования. Показано, что у M.flagellatum имеются две системы утилизации аммония. Ключевым ферментом ассимиляции аммония у M.flagellatum является НАДФ-зависимая глутаматдегид-рогеназа. Утилизация аммония путем прямого восстановительного ами-нирования 2-оксоглутарата с помощью глутама'тдегидрогеназы происхо-

дит как при избытке аммония, так и при его лимитировании. Ферменты глутаматного цикла (глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза) имеют наибольшие значения активностей и принимают участие в утилизации аммония при медленной скорости роста культуры в условиях лимитирования по азоту. НАД(Ф)-зависимая изоцитратдегидрогеназа регулируется аммонием координирование с глутаматдегидрогеназой.

Выделен и охарактеризован ключевой фермент ассимиляции аммония -НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется на метаболическом уровне.

Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована НАД(Ф)-за-висимая изоцитратдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется промежуточными метаболитами и только НАДФ-зависимая активность ингибируется АТФ.

Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована цитратсинта-за. Показано, что фермент не регулируется по типу отрицательной обратной связи и ингибируется АТФ.

Полученные в настоящей работе результаты позволили предложить схему, предполагающую, что скорость ассимиляции аммония определяется на начальных этапах окисления метанола и распределения потоков формальдегида на ассимиляцию и прямое окисление.

Полученные результаты по регуляции ассимиляции аммония у обли-гатного метилотрофа М. flaellatum имеют важное значение для получения штаммов-продуцентов биологически-активных веществ (например аминокислот) с улучшенными технологическими параметрами.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разд лов: введение, материалы и методы, результаты и обсуждение (10 глав), выводы, список литературы (116 наименований); и содержит 30 рисунков и 8 таблиц. Обьем работы - 103 с.