Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии Волчек, Наталья Александровна

Введение к работе

Заболевания, вызванные стрептококками различных серологических групп, продолжают оставаться одними из самых распространенных в современном здравоохранении. В последнее время участились случаи заболеваний, вызванные условно - патогенными стрептококками и патогенами животных, к ним относятся и стрептококки серологических групп С и G. Ежегодно десятки миллионов людей, преимущественно детей и лиц репродуктивного возраста, страдают от стрептококковых заболеваний, которые часто переходят в хроническую форму. Совершенствование подходов для их диагностики, профилактики и терапии становится возможным только на основе современных знаний о природе возбудителя, механизмов его воздействия на организм человека, а также при наличии новых высоко чувствительных и специфичных средств диагностики, в том числе и экспрессных. Особая роль в решении вышеупомянутых задач отводится генно - инженерным и биотехнологическим методам исследования.

Патогенез стрептококковых инфекций обусловлен взаимодействием биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секретируе-мые микробной клеткой.

Большинство штаммов стрептококков групп С и G экспрессируют на своей поверхности Fc рецепторний белок, так называемый белок G. Он связывает все подклассы человеческого иммуноглобулина G (IgG), IgG многих видов млекопитающих, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и а2-макроглобулин (а2М). Изучение G белка выявило в нем наличие повторяющихся как альбумин, так и IgG связывающих доменов. Количество доменов обоих типов варьируется от штамма к штамму. Каждый штамм стрептококков групп С и G экспрессирует только какую - либо одну форму молекулы G белка. Способность G белка связывать с высокой аффинностью ЧСА и IgG может обеспечить бактериям дополнительную защиту в организме хозяина и, в частности, защиту от воздействий иммунной системы.

Существующая классификация стрептококков основана исключительно на их антигенных различиях, в частности, на свойствах груп-поспецифического полисахаридного антигена или типоспецифическо-го поверхностного белка. Генетический же анализ может явиться дополнением к идентификации штаммов групп С и G по наличию и типу

гена G белка. Кроме того, не исключено, что для оценки вклада G белка в патогенность этих стрептококков, следует определять не только форму белка, но и уровень его экспрессии.

Интересным с точки зрения формирования вирулентного фенотипа стрептококков групп С и G, является тот факт, что G белок связывает сс2М, основной ингибитор протеиназ, в том числе и экзогенных. Однако область связывания а2М белком G не определена. Имея в руках рекомбинантные белки G с различной структурой, можно определить область связывания а2М. В дальнейшем, можно будет получить ре-комбинантный рецептор к самому <х2М в чистом виде. Применение такого рецептора в качестве лиганда в аффинной хроматографии, в свою очередь, создаст условия для получения чистого препарата а2М из донорской плазмы.

Роль G белка в патогенезе стрептококковых инфекций еще не ясна, однако благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, он имеет большое прикладное значение. Высокая аффинность IgG связывающей части G белка позволяет использовать его в качестве лиганда в аффинной хроматографии для получения чистых препаратов IgG из плазмы донора. С этой целью используются новейшие хромато-графические технологии, которые сочетают в себе методы высокоэффективной жидкостной лиганд - обменной хроматографии с новыми полимерными мембранными носителями. Высокая специфичность G белка позволяет использовать его для определения IgG в биологических жидкостях в диагностических тест - системах при замене антител на хорошо стандартизируемый рецепторный белок, а также для повышения чувствительности существующих тест — систем на основе антител и Fc рецепторного стафилококкового белка А.

Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретного гена G белка, изучения его роли в патогенности стрептококков групп С и G, большую роль приобретает получение, кодируемого данным геном, активного белка, который является высоко актуальным для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.

Все выше сказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы явилось определение области связывания G белка с а2- макроглобулином, характеристика G белка и кодирующего его гена в различных изолятах человеческого происхождения

стрептококков групп С и G, а также практическое использование IgG связывающего фрагмента G белка в мембранной биотехнологии. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Выявить область связывания молекулы G белка с а2-макроглобулином;

2. Определить распространенность гена G белка среди штаммов стрептококков групп С и G;

3. Провести сравнительный генетический анализ клинических изолятов стрептококков фупп С и G по маркеру гена G белка;

4. Получить рекомбинантные белки с одним, двумя и тремя IgG - связывающими доменами клонированием IgG - связывающих фрагментов гена G белка из различных изолятов стрептококков групп С и G;

5. Использовать рекомбинантный монорецепторный IgG - связывающий G белок в качестве лиганда в высокоэффективнойной мембранной хроматографии для выделения чистого препарата IgG;

Научная новизна работы состоит в том, что:

6. Впервые установлена локализация области связывания G белка с а2-макроглобулином;

7. Впервые показана возможность идентификации по маркеру гена G белка не

только групповой С и G принадлежности штаммов, но и видовой ( для штаммов группы С) принадлежности стрептококков;

4. Впервые показана возможность определения молекулярно
- генетическими

методами количества IgG - и альбумин - связывающих доменов в молекуле G белка;

5. Впервые получен высокоочищенный препарат IgG из сы
воротки крови с использованием IgG - связывающего фрагмента G
белка в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хро
матографии.

Теоретическая ценность работы. Работа носит преимущественно

теоретический характер. Показано, что генетический анализ позволяет

идентифицировать штаммы стрептококков групп С и G, выделенные

от людей, по наличию гена G белка, а также определять их групповую

и видовую принадлежность на основании типа присутствующего гена

G белка. Для оценки потенциальной роли различных форм G белка в

формировании вирулентного фенотипа стрептококков групп С и G

* і

следует определять не только ту или иную форму G белка, но и уровень его экспрессии.

Практическая ценность. Отработаны условия получения вы-сокоочищенного препарата IgG методом высокоэффективной мембранной хроматографии, где впервые в качестве лиганда был использован рекомбинантный IgG - связывающий фрагмент G белка.

Основные положения, выносимые на защиту:

8. Область связывания G белка с а2-макроглобулином локализована перед альбумин - связывающими доменами молекулы, вероятно в области Е;

9. Для штаммов стрептококков групп С и G характерна различная организация структуры гена G белка. Благодаря этим различиям можно определять групповую и видовую принадлежность по маркеру гена G белка;

10. Альбумин и IgG связывающие активности рекомбинантных G белков стрептококков групп С и G различных видов зависят от количества альбумин - и IgG - связывающих доменов в их структуре;

11. Использование рекомбинантного монорецепторного IgG - связывающего белка в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хроматофафии позволяет получать чистый препарат IgG из донорской плазмы за минимальное время хроматофафического процесса.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование ДНК, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 18 работ. Результаты диссертационного исследования были представлены и доложены на различных симпозиумах и конференциях: "Первая ме-дико - биологическая конференция молодых ученых С. - Петербурга" (1997г.), "Всероссийская конференция молодых ученых" (Москва, 1998г.), "Международный симпозиум по новым методам в микробиологии" (Словакия, 1996г.), "Международный конгресс по клинической химии и лабораторной медицине" (Флоренция, 1999), "XIV Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям" (Новая Зеландия, 1999), а также на научных конференциях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 128 страницах, включающих введение, литературный обзор, материалы и методы, собственные исследования и их обсуждение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 123 источника, в том числе, 13 на русском языке.