Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis Видяева, Надежда Андреевна

Введение к работе

Актуальность пппгілвим. Чумной микроб (.Yersinia' pest is) является возбудителем одного из самых опаа-ых инфекционных заболеваний человека и яивотных с природной очаговостью. Другие представители рода Yersinia - Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica, вызывают хронические кишечные инфекции, получившие в настоящее вредя кирокое распространение. Совершенствование пер диагностики, профилактики и борьбы с этими заболеваниями тесно связано с изучением молекулярных . основ вирулентности их возбудителей.

Известно, что ведущая роль в вирулентности иерсний, вызывающих различные по тяжести заболевания, принадлежит продггктам плазмид кальцийзависимости - 45-47 Щ (Gemski et al., 1980; Gemski. Lazere. Casey, 1980; Zaik et al., 1S80; Ferber, Brubaker. 1981; Portnoy. Falkow. 1681; Portnoy. et al., 1983). Эти плазмиды кодируют свойство зависимости роста при 37С от присутствия в среде ионов кальция, синтез V и -И антигенов, а также ряда 'белков внешней мембраны (БВМ или Уорз - Yersinia Cuter membrane p.roteins). Последние є репрессируются при 37С культивирования бактерий в отсутствие в среде иоьов кальция о (Portnoy, Moseley, Falkow, 1961; Bolln, Portnoy, Woif-Watz, 1Є85; Perry et al., 1G85; Straley, Bowmer, 1087).- У возбудителя чумы, выращенного in vitro, Yops во внесшей мембране не обнаруживаются (Straley, Brubaker, 1081; Sample, Brubake", 1987) в результате их быстрой посттрансляционной деградации протеолитическим ферментом - фибринолизином, кодируемым уникальной для Y. pest is плазмидой пестицшюгенностк - б Щ (Sodiende, Goguen, 1988; Sodiende et al., 1988), Отсутствие экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых п.:азмидой кальцийзависимости (pCad), у возбудителя чуш in vitro затрудняет их изучение. Вместе с тем, исследование этих

полипептидов лввт важное значение) для установления их роли в вирулентности чумного микроба и возможного их использовазшя для создания диагностических и «рофилактических препаратов. Сравнительное изучениэ кодируемых плаэмчдами кальцийзавиоимости белков у трах близкородственных видов иерсиний может позволить установить причину различного течения заболеваний, вызьшаекых этими микроорганизмами.

Цаль работы. Целью работы явилось изучение экспрессии

бег-сов, кодируемых плазмидой кальцийзависиыости Y. pest is.

«

Ос.нпвкш аялачи исследования.

1. Создать модель для изучения продуктов, кодируемых
собственными плазмидаыи чумного микроба.

2. Определить оптимальные условия культивирования
возбудителя чумы invitro, обеспечивающие степресси» плазмиды
кальцийзависиыости.

1. Идентифицировать детерминируемые pCad полипептида в клетках чумного микроба.

2. Последовать дэградаци» БВМ в клетках Y.pestia и Y pseudotuberculosis под влиянием плазмиды пестищногешюсти (pPst) и определить ее свяяь о вирулентностью.

3. Получить в чистой виде препараты белков внваизй мембраны н V-антигена.

Научная новизна. В результате выполнения работы получены следующие новые данные:

- создана удобная модель для исследования экспрессии антигенов, кодируемых собственными плазмидаин чумного микроба, методом имиукоблоттинга, которая включает набор изогенных штаммов возбудителя чумы, состоящий из «оно- и биплазмидаых производных с различным сочетанием плаэмид; модель позволяет

идентифицировать продукты отдельных плазмид, определять их топологии в клетке и выявлять взаимное влияние плазмидных генов;

впервые установлено, что оптимальными условиями для экспрессии белко-з внеиней мембраны, кодируемых pCad, адекватными условиям in vivo, являются температура 37С и наличие с среде культивирования 20 Ш ионов магния баз ограничения ионов кальция; в этих условиях во внешней ме»"5рано обнаруживаются полипептиды с молекулярными массами 75, 46, 40, 32, 25 кД и ряд минорных белков, а в цитоплазме и кучьтуральной среде - V антиген;

показано, что реакция на температуру культивироватія и содержание ионов магшія в среде у ионоплазмидных производных (вирулентного, авирулентчого, вакцинного) Y.pest is имеет штаммовыэ различия;

выявлено, что деградация pCad-кодируемых белков "нешней мембраны Y.postis и У. pseudotuberculosis, обусловленная плазмидой пестицзшогенноста, не связана с их вирулентностью;

впервые показано, что белок внеиней мембраны возбудителя чумы 46 кД является антигеном, перекрестнореагирущим с клетками тканей человека.

'Практическая ценность. По результатам работы составлены методичесюїа рекомендации "Идентификация белков, кодируемых плазмидой Са*"¹"-зависимости возбудителя чумы, методом иммуноблота", которые одобреш Ученым Советом ВНШЧИ "Микроб" (протокол N 12 от 20 июня 1989 г.) и утверадены ^тректором ВНИПЧИ "Микроб" по учренэденческому уровню внедрения. Методические рекомендации "Выявление белков, кодируемых собственными плазмидаии чумного микроба, методом иммуноблоттинга* утверждены начальником главного эпидуправления Минздрава СССР от 25.7.00. по союзному уровню внедрения.

Разработанные метода лэские приє ы используются в работе лабораторий РНИПЧИ "Ыикроб" и НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалея РАМН СССР.

Выделены препараты белков внешней мембраны и V-антигена, которые могут быть «юпользованы для получеик.; моноспецифических антисывороток и моноклональных антител

Основные, положения, вшгссгош на ааяиту.

1. Разработан! модель для идентификации антигенов, кодируемых собственными плаэмидами возбудителя чумы, которая включает моно- и биплазмидные штаммы и антисыворотки к продуктам отдельных плазмид.

2. Наличие в питательной среде 20 мН конов магния без ограничения иоиов кальция при 37С обеспечивает оптимальные условия, а^чкватные условиям in vivo, для экспрессии белков внешней мембраны и V антигена.

3. Деградация белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависшости, происходит под влиянием плазмиды пестицикогенкости в клетках Y.pestle и У.pseudotuberculosis, но не обеспечиваем высокий уровень вирулентности.

4. Бе*"* внешней мембраны возбудителя чумы с молекулярной массой 46 кД кмает общие аіггагвшшо детерминанты с балками тканей человека.

\тюбмт* работц. Материалы диссертации доложены и представлены на Всесоюзном семинаре молодых ученых противочумных учреэдекиЙ "Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций" (Маркс, 1982); Всесоюзном рабочем совещании "Биохимия клеточной поверхности грамотріщательньч мш^рооргшяізмов (Саратов, 1934); Всесоюзных конференциях "Иврсиниозы* (Владивосток, JG89), "Регуляция микробного метаболизма* (Пущино-на-Оке,. 1989), *Плазмида-Х1Г

(Нальчик, 1900); V международном симпозиуме по иерсидлям (Токио, 1680); "Генетика и биохим, вирулентности возбудителей особо опасных инфекций* (Волгоград,1В92), ежегодных итоговых научных конференциях РНИПЧИ Микроб" (lG86-t902).

Пу&ликапии. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том чиста одни методические реконендацин изданы 'брошюрой.

Структура диссертации. Диссертация изложена на^^страницах
машинописи, состоит из оглавления, введенім, двух глав обзора
литературы, описания материалов я методоэ исследований, іілти
глав собственных исследовак А, заключения, выводов. С.іисок
литературы включает работы 210 авторов. Текст иллюстрирован 5
таблицами и 24 рисунками. '