Введение к работе
Актуальность темы. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii - фототрофный эукариотический микроорганизм .является модельным объектом для изучения физиологических, генетических, биохимических процессов в эу-кариотической клетке. Прежде всего, это обусловлено простотой приемов работы с С.reinhardtii, относитетельно коротким клеточным циклом, использованием для культивирования простых синтетических сред , хорошей генетической изученностью и наличием разнообразных мутантов по ядерным, хлоропласт-ным,митохондриальньи генам (Hariss,1989). Для современного этапа развития биотехнологий С.reinhardtii представляет большой интерес не только как модельная эукариотическая система , но и как перспективная трансгекная одноклеточная фотосинтезирующая эукариотическая клетка - продуцент белков растительного происхождения или носитель целевых систем би-одеградации сцепленных с фотосинтезом.
Разработка эффективной системы генетической трансформации С.reinhardtii по ядерному ( Kindle,1990), хлоропласт-ному (Boynton et. al.,1988) и митохондриальному геномам (Randolph-Anderson et al.,1993) позволила расширить исследования внутриклеточных процессов на молекулярном уровне. Показано, что при интеграции донорной ДНК в ядерный геном С.reinhardtii преобладает механизм негомологичной рекомбинации ( Sodeinde and Kindle, 1993), интеграция донорной ДНК в хлоропластный геном идет по механизму гомологичной рекомбинации (Blowers et al.,1989). Исследуются механизмы регуляции и экспрессии генов (Davies et al.,1992; Blankenshlp and Kindle, 1992) . Предложена методология инсерционного мутагенеза (Kindle et al.,1991; Nelson et al.,1994).До настоящего времени не разработана система стабильной экспрессии гетерологичных генов в ядре С. reinhardtii ( Hall et al., 1993; Blankenshlp and Kindle, 1992).
В настоящее время для трансформации С.reinhardtii используются интегративные плазмидные векторы, полученные на основе бактериальных плазмид и гомологичных генов , комп-лементирующих мутации ауксотрофности или фототрофности в реципиентных штаммах. Дальнейшее развитие методологии моле-
- г -
куляркого клонирования в хламидомонаде нуждается в создании многокопийных репликативных векторных ДНК и поиске новых селективных маркерных гомо- и гетерологичных генов.
Цель к задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы были поиск и изучение новых векторных конструкций для трансформации Chlamydomonas reinhardtii .содержащих гетерологичные маркерные гены: аргининсукцинатлиазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (arg4), аминоглико-зид-3'-фосфотрансфераз (арЮ из Тп5 и Streptomyces rimosus.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи. 1. Изучить возможность создания репликативных векторных плазмид на основе гибридных бактериальных плазмид, несущих селектируемые в хламидомонаде гетерологичные маркеры (arg4, aph из Тп5 под регуляторними элементами вируса SV40) и фрагменты ядерной ДНК С.reinhardtii . Для этого создать клонотеку хромосомной ДНК С.reinhardtii в плазмидах pBR325arg4, pBR327arg4, psv2neo и провести скрининг автономных плазмид в трансформантах водоросли. Провести анализ свойств фрагмента ядерной ДНК - предполагаемого репликатора автономных плазмид в составе плазмиды с гомологичным маркерным геном аргининсукцинатлиазы (arg7). 2. Изучить трансформацию С. reinhardtii плазмидой pSU937. содержащей ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из S.rimosus и на ее примере, разработать подход к созданию системы стабильной экс-пресии гетерологичных генов в С.reinhardtii.
Научная новизна работы.
Получены автономно поддерживающиеся в С.reinhardtii плазмиды, содержащие ядерные фрагменты ДНК хламидомонады. Обнаружено, что в процессе культивирования трансформантов водоросли в селективных по плазмидному маркеру условиях, плазмидная ДНК подвергается разнообразным структурным изменениям, причем последние могут иметь специфический характер. Показана возможность использования плазмиды pSU937, содержащей ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из S.rimosus в качестве йнтегративного вектора для хламидомонады.Впервые получены трансформанты С.reinhardtii .способные к стабильной экспрессии гетерологичного гена при выращивании в селективных и неселективных условиях по плазмидному маркеру.
Получена коллекция из 12 независимых трансформантов С. rein-hardtll и осуществлено тестирование активности аминоглико-зид-З'-фосфотрансферазы в грубых бесклеточных экстрактах трансформантов.
Практическое значение работа.
В дальнейшем ген аминогликозид-З'-фосфотрансферазы из S.rimosus предполагается использовать в качестве репортер-ного гена при изучении регуляторних элементов хламидомонады.
Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на семинарах кафедры микробиологии Санкт-Петербургского университета, на Международной конференции по фотосинтезу и фотобиотехнологии в Пущино, на 6-ой Международной конференции по клеточной и молекулярной биологии хламидомонады в США, на 9-ом Международном симпозиуме по биологии актиноми-цетов в Москве.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включая рисунков 27 . Работа состоит из введения ,обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы.