Введение к работе
Актуальность темы. Аварийные разливы нефти превращают почзы в ехногенные пустыни. Вследствие того, что масштабы нефтяных їгрязнений огромны (Пнковский, 1993; Яблоков, 1995; Shukla, 1990) сключительную важность приобретает проблема рекультивации почв. При том, несмотря на значительные интеллектуальные усилия, финансовые нвестиции и некоторые успехи в области моделирования очистки ефтезагрязненных почв (Мурзаков и др., 1992; Воронин, Сгаровойтов, 994; Atlas, Bartha, 199 Chen, 1992) эта проблема по прежнему далека от воего окончательного решения. По нашему мнению, это связано: во-іервьіх, с нечетким пониманием механизмов повреждающего действия іефтн на свойства почвы, а, во-вторых, с недостаточным вниманием к гсобенностям почвы как среды обитания микроорганизмов (Звягинцев, 987; Marshall, 1992), коренным образом отличающим ее от других сред, и ірежде всего от воды.
Целью настояиіего исследования является разработка теоретичеоагх >снов биотехнологии восстановления почв, загрязненных нефтью и [ефтепродуктами.
Основные задечп /фб&ть/. Исследовать экологические закономерности ювреждающего действия нефти на почвенную микробноту. На их основе, 'читывая особенности почвы, как среды обитания, оптимизировать хяювные операции биотехнологии рекультивации нефтезагрязнешшх почв гутем лабораторного моделирования.
Научная кот&яа. Установлено, что негативные последствия нефтяного (агрязнения почвы в большей степени связаны с действием тяжелых фракций нефти. Последние, увеличивая падрофобность почвы, нарушают ее юдный режим, что и лимитирует активность почвенной биоты.
Впервые экспериментально обнаружена зависимость, имеющая ярю выраженный максимум, темпов утилизации углеводородов нефти в почв от интенсивности процесса потребления в ней углеводов, и предлохсеї вероятный механизм этого эффекта.
Практическая значимость. Полученные данные о негативны: последствиях применения поверхностно-активных веществ на первы: этапах рекультивации нефтезагрязненных почв (ингибироваш* потребления углеводородов и стимулирование денитрификации) должнь учитываться при использовании ПАВ в биотехнологии очистю нефтезагрязненных почв.
Разработанные способы оценки эффективности биопрепаратов, йогу быть использованы для лабораторного испытания культуї микроорганизмов, потенциально предназначенных для иіггродукціга і нефтезагрязненные почвы.
Предложенные методы биоиндихацни состояния нефтезагрязненныз почв и критерии эколого-микробиологнческого нормирования содержанш нефти в почве могут быть использованы при решении природоохранныз задач.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и тезись докладов.
Авуобацая работы. Результаты диссертационной работы был* доложены на конференции "Биотехнол. защиты окруж. среды" (Лущимо 1994); 3rd German-Russian Workshop Biotcchnol. (Berlin, 1994); I Bcepocc конф. "Аісгуальн. проблемы теор. и прикл. токсикологии" (Санкт-Петербург, 1995), а также на совместном заседают кафедры биологии поче факультета почвоведения МГУ и Российского общества почвоведов (1996).
Структура и объем реМшз, Материал диссертации изложен на й страницах машинописи, состоит нз введения, обзора литературы, описанні
объектов и методов исследований, четырех глав результатов собственных ісследований, двух глав обсуждения результатов и выводов. Работа ишюстрирована рисунками i.'f таблицами. Список использованной нтературы включает/Йнаименования, из нихдана иностранных языках.
Автор выражает искреннюю благодарность профессору Д.Х. [оджаеву, к.б.н. И.С. Кулнчевской, к.б.н. СВ. Левину, к.б.н. Л.В. Лысак и .б.н. А,Л. Степанову за консультации и содействие в работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке ГНТП России Новейшие методы биоинженерии", основное направление "Биотехнология ащиты окружающей среды" и Российского фонда фундаментальных сследований (код проекта 96-04-48332).
Объекты исследования. В работе использовали образцы гумусового оризонта (5-25 см) четырех почв следующих зональных тнпоа:
модельной дерново-подзолистой среднесуглинистой под многолетними разами, отобранные на Почвенном стационаре МГУ в сентябре 1993 года;
типичного чернозема тяжелосуглинистого, отобранные в запозедшксе Каменная степь" Воронежской области в мае 1992 года;
выщелоченного чернозема малогумусного и легаосуглнішстого под іменем, отобранные в ноябре 1993 года, в Самарской области в месте азлива нефти, произошедшего о апреле 1990 года вследствие разрыва іарочного шва нефтепровода "Дружба".
каштановой тяжслосуглнкистой под сенокосными угодьями, гобранные в Волгоградской области в апреле 1991 года;
типичного серозема яегкосуглгашстого под хлопчатником, отобранные Самаркандской области в мае 1992 года.
Все образцы высушивали до воздушно-сухого состояния и хранили д использования в лаборатории. Перед экспериментом почву растирали ступке, предварительно удалив крупные корешки, просеивали через сито диаметром отверстий 1 мм, увлажняли до 60% от полной влагоемхостн тщательно перемешивали.
Микроорганизмы. Чистые культуры дрожжеподобного гриба Candid
lipolytica D40 и устойчивого к нистатину мицелиальног
миіфоскопического гриба Cladosporiira resinae G-1 были получены \ лаборатории почвенной микробиологии ИНМИ РАН.
Реагенты, В качестве реагентов использовали сырую нефть (удельны вес 863-865 мг/смЗ, содержание воды 0,15%, солей - 6-7 мг/л, серы 1,4% толуол, бензші марки АИ-92, летнее дизельное топливо, масло М-6з/12 ] "всесезонное" моторное (ГОСТ 10541-78 с гом. 1-7) и гудрон. Нефть нефтепродукты получены на Московском нефтеперерабатывающем заво/ (Капотня).
Методы иссле&ошкии 1. Реакцию почвенной микробиоты на нефтяш загрязнение изучали с помощью метода инициированного михробноі сообщества (Guzev et al., 1982). Сущность и отличительные признал данного метода состоят в активации источником энергии (крахмалої развития микроорганизмов на поверхности почвы и последующем изучен* видового состава и структуры активно функционирующего сообщесл микроорганизмов. Ишщиированнсе микробное сообщество расематриваї как реальную модель для оценки изменашй почвешюй микробиоты щ загрязнении возрастающими дозами нефти и нефтепродуктов. Опыт проводили в 9-кратной повторносте.
2. О фитотоксичноат почвы, загрязненной поллютантом судили і всхожести семян тест-растения. Фитотоксической дозой назваї
5 гонцентрация поллютанта, при которой прорастает лишь 50% (LD50) семян гресс-салата. Повторность опыта была 6-кратной.
-
Метод целлофановых мембран. Для количественного определения (еллюлозолитичеекой активности почвы применяли метод целлофановых «ембран (Гузев и др., 1988). Сущность метода состоит в инструментальном мтредсленни скорости нарушения механической прочности целлофановой щенки в процессе ее инкубации на поверхности почвенной пластинки. Зпыты проводили в 14-кратной повторности.
-
Определение оптимальной инокуляциотой дозы интродуцентов. испытуемые культуры вносили в почву в виде суспензии. Концентрацию сонидий или вегетативных клеток определяли в камере Горяева. Во всех іарнантах опыта в почву вносили нефть (10 объем.%), а также (NH^SCH и К.2НЮ4 по I мг/г. Наличие и прирост внесенных в почву микроорганизмов эценивали по площади проективного покрытия поверхности почвенной ггастинки данным микроорганизмом путем прямого микроскопирования. Цолю интродуцента выражали в процентах. Параллельно измеряли интенсивность дыхания почвы.
-
Попупяционную динамику интродуцентов в почве определяли путем высева на подкисленный сусло-агар через каждые 7 суток инкубации. Учет микроорганизмов в диапазоне низких плотностей проводили на среде, содержащей нистатин (500 ед./ші). В качестве контролей использовали варианты: исходная почва, почва + нефть и почва + интродуцируемый микроорганизм.
-
Определение денитрификационной и дыхательной активности почвы проводили на газовом хроматографе "Хроматограф" - модель 3700/4, и спектрофотометрически с помощью И1С-газоанализатора "Инфралита-4". Повторность - 4-кратная.
7. Численность отдельных групп угленодородокисляющи:
микроорганизмов почвы определяли методом посева на агаризованнук
среду, рекомендованную для выделения липолитических микроорганизме]
(Watanabe et а!., 1977), в которой в качестве источника углерода вместе
оливкового масла использовали дизельное топливо. Повторность опыта 1
кратная. Типичные колонии микроскопировали, рассеивали ш
стандартные питательные среды и полученные чистые культурь
идентифицировали используя руководства (Нестеренко, 1985
Добровольская и др., 1989; Bergey's, 1994).
8. Для сравнительной количественной оценки гидрофобных свойат
почвы разработан метод, основанный на определении скорости впитыванш
капли дистиллированной воды (объемом 0,02 мл) на выравненно»
поверхности насыпного образца воздушно-сухой почвы, предварительнс
просеянной через сито диаметром 0,25 мм. За действующую доз)
поллютанга (К і мин) принята концентрация, при которой время впитыва;
ния капли увеличивалось до і минуты (в контроле - не более 1 сек). Опыты
проводили в 9-кратной повторности.
Все опыты проводили при 25С. Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием пакета программ "Statgraf и выражали в виде таблиц, графиков и диаграмм с помощью пакета программ "Harvard Graphics", использовали текстовой редактор "Microsoft Word".