Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди задач, стоящих перед здравоохранением, особое место занимает настоятельная необходимость укрепления здоровья людей, повышение качества оказываемой медицинской помощи на основе интенсификации работы учревдеяий здравоохранения. Важнейшим направлением в этой области является углубление существующих способов борьбы со многими заразными болезнями и развитие новых путей и подходов в предупревдении инфекций и в том числе такой актуаль-яой в настоящее время, как пневмококковая ( Вишнякова Л.А. и др., L984, 1987; Кагосова Л.К. I99Uj Ginsburg С. et а11979; Douglas Е. м. et al.,1983; Banks R.A. 1984; Balows А.,, 1986; Davies A. J.1988 ).
Пневмококк, являясь возбудителем менингитов, пневмонии, эндо-
сардитов, гнойных отитов и целого ряда других заболеваний ( Костю-
гова Н.Н., 1У8І; Демина А.А. И др., 1983; Austrian Н., 1977, 1986;
artlett J.O. ; 1986; Lawrenson J.B. et al., 1988 ) В настоящее
іремя, по мнению американского ученого page m.j. (. 1973 ), остает-я одной из основных причин смертности в мире, этот микроорганизм ироко распространен на всех континентах t Kaiin м. І98и; arpuoh J. et а1.,ІУ83; Powderly W.G. et al., 1986; Lipsky B.A., 986;Salwen K.M. et al., 1987; Nair R., 1988 ).
В последнее время исследователи отмечают увеличение роста за-элеваемости и смертности от данного возбудителя. Обращается внима-ие на особую чувствительность к пневмококковой инфекции детей, лиц эжилого возраста, а так же больных с врожденными болезнями сердца, яефротическим синдромом, хроническими заболеваниями легких, уда-;нной селезенкой и другими заболеваниями ( Austrian R ., ISTY;
Sohlech \Ї.Р. et al., 1985: Gelli M.G. et al., 1985; Hebert J.G.
et al., 1987 ).
Длительность пребывания больного в стационаре, часто с осложнённым течением, тяжелые последствия перенесенного заболевания, высокая летальность, отсутствие надежных методов диагностики, привело к тому, что данная проблема стала одной из актуальных в советском
И МИРОВОМ здравоохранении ( Vachon Е. et al., 1979; De Вас s. et al., 1980: оtart I.E. et al., 198? ; Катосова Л.К., 1Э91 ).
Несмотря на то, что пневмококк является ведущим этиологическим фактором при многочисленных заболеваниях, в настоящее время отсутствуют высокочувствительные питательные среды для выделения и культивирования возбудителя, диагностические агглютинирующие пневмококковые антисыворотки, модель пневмококковой инфекции, что не позволяет проводить исследования на современном уровне, для совершенствования микробиологической диагностики пневмококковой инфекции необходимо располагать не только качественными питательными средами, диагностическими сыворотками, но и оовршешшми схемами и методами выделения и идеятифікации возбудителя. Заметим, что назначение лечащими врачами антибактериальной терапии до взятия Оииматериала на исследование, снижает высеваемость этиологических агентов. Это затрудняет получение данных о доминирующих серотипах пневмококков при большинстве заболеваний, вызванных этим возбудителем.
Острой проблемой остается отсутствие рабочего контакта лечащего врача и бактериолога, территориальная и организационная разобщенносп микробиологических лабораторий с лечебными отделениями. В итоге результаты исследований часто не выполняют своей роли при решении вопросов адекватной терапии. В результате этого отсутствует дифферен-
дированный подход в выборе тактики исследования и квалифицированная эцекка полученных данных. Все это определяет актуальность совершенствования схем и методов установления этиологического лидера при за-іолеваниях, вызванных пневмококком.
Следует отметить, что в литературе имеется незначительная- информация о роли и доминирующих серотипах пневмококков в структуре эазличных острых и хронических заболеваний. Получение подобных даних будет способствовать составлению формул вакщн и изучению отдел шх вопросов эпидемиологии пневмококковой инфекции.
7совершенствовать схему диагностики пневмококковой инфекции і целью сокращения времени получения окончательного ответа можно за счет использования новых питательных сред на основе непищевого ?ырья, сбалансированных с учетом питательных потребностей пневмскок-са. Однако основным сырьем при производстве микробиологических писательных сред в настоящее время продолжает оставаться дефицитнее шщевве продукты. Значительные количества мяса, рыбы, печени, яиц і других продуктов питания- используется при изготовлении диагности-іееких питательных сред, в производстве питательных сред для полу-іения вакцин, сывороток и других иммунобиологических препаратов. 3 этой связи актуальность исследований, направленных на поиск нового 5олее экономичного белкового сырья, не вызывает сошений.
Решение вопросов усовершенствования существующих технологий фоизводства питательных сред на непищевых основах при крупномасштаб 1ом производстве будет способствовать созданию малоотходных и безотходных производств в ряде отраслей промышленности и утилизации от-содов, создавая экологически чистые поточные линии и обеспечивая экономический эффект.
2Х_622
Цель работы - совершенствование диагностики пневмококковой инфекции с учетом современных достижений микробиологии и использование разработок в практическом здравоохранении.
Задачи исследования;
-
Разработать способ получения более совершенных питательных сред для выделения и культивирования пневмококка с использованием непищевого сырья и отечественных ингредиентов.
-
Долучить а провести апробацию диагностических агглютинирующих пяевмококковііх аншсывороток.
-
Создать экспериментальную лабораторную модель пневмококковой инфекции на животных.
-
Усовершенствовать схему диагностики пневмококковой инфекции.
-
Определить этиологическую роль пневмококка при острых и хронических заболеваниях органов дыхания у детей.
-
Изучить серотиповой спектр пневмококка при острых и хронических заболеваниях органов дыхания и острых гнойных отитах у детей.
Научная новизна и практическая значимость'исследования.
Разработана схема диагностики пневмококковой инфекции, предусматривающая комплексное проведение исследования с использованием бак-териоскопического, бактериологического, серологических и биологического методов исследования. Использование данной схемы позволяет получать окончательный ответ на вторые сутки с необходимой информацией об этиологическом лидере, степени его участия в патологическом процессе, количественном содержании в единице объема исследуемого материала.
предложены критерии, достаточные для идентификации пневмококка, и перечень признаков, являющихся косвенным подтвервдением этиологической роли пневмококка в патологическом процессе.
Разработаны критерии, необходимые для получения положительного ответа в ходе анализа в соответствии с глубиной исследования, в основе которых лежит количественный посев и учет результата исследования с ^пользованием одного или нескольких методов диагностики.
Разработаны способа получения гидролизагов из непищевого сырья ( спадковая осі резь и плацента человека ) для питательных сред. На основе полученных гидролизатов сконструированы жидкая, полужидкая и плотная питательные среди для выделения и культивирования пневмококка.
Применение экспериментально-аналитического метода балансирования позволило получить среды из непищевого сырья, имеющие более высокие коэффициенты использования компонентов в сравнении с исходными несбалансированными средами и более экономичные за счет уменьшения количественного содержания компонентов, а также за счет увеличения выхода биомассы.
Создание питательных сред позволило изучить биологические и физиологические свойства циркулирующих в настоящее время штаммов пневмококков в городе Москве.
Сконструированная среда на основе ферментативного гидролизата плаценты человека дала возможность впервые получить пневмококковые диагностические агглютинирующие антисыворотки не содержащие антител к балластным белкам питательной среды.
На основе полученных сывороток разработаны эритроцитарные антительные диагностикумы, которые использовались при исследовании раз-
личных биоматериалав от бальных и реакции агрегат-гемагглютшации.
Создана лабораторная модель экспериментальной пневмоксжловой инфекции, позволяющая проводить лабораторные эксперименты с учетом строго контролируемых параметров, использование сублетальных доз пневмококка позволило изучить динамику распределения возбудителя по органам и установить различия при изученных методах заражения.
Впервые проведено изучение оатоморфологических, иммуноморфо-логических и гистохимических изменений при персистировайии пневмококков в организме мышеи и морских свинок.
Впервые изучены вопросы, направленные на выявление механизма и условий перекрестного заражения морских свинок пневмококками разных серотипов на фоне бактерионосительства. Установлена зависимость степени тяжести заболевания от способа инфицирования и серо-типа возбудителя.
Показаны особенности заселения носовых ходов морских свинок пневмококками разных серотипов в условиях вивария при совместном содержании зараженных и интактных животных.
"Установлен факт длительного персистирования капсульних форм пневмококка.
предложен способ получения антигенного препарата с целью произ водства пневмококковых антисывороток с использованием пиательнои среды, свободной от балластных белков сыворотки и крови.
В результате использования комплекса бактериологического и серологического методов исследования получены новые данные об этиологической структуре острых и хронических заболевании органов дыхания у детей, острых гнойных отитов, деструктивных пневмониях. Показана доминирующая роль пневмококка в этиологии указанных заболеваний и удельный вес данного возбудителя в этиологической структуре острых
и хронических воспалительных заболеваний легких.
Установлено постоянное обновление штаммов пневмококка в процессе колонизация верхних дыхательных путей в зависимости от возраста ребенка. Определена длительность колонизации ротоглотки пневмококками, полученная при выявления серотиповои принадлежности возбудителя.
Установлены доминирующие серотипы пневмококков при острых и хронических воспалителыщх заболеваниях органов дыхания у детей, при острых гнойных отитах, деструктивных пневмониях, бактерионосительстве. Изучена взаимосвязь возраста больных детей и серотипов пневмококков при различных заболеваниях.
Введение количественных критериев оценки результатов позволило Золее точно судить об этиологической значимости выделенных микроорганизмов. Получение на вторые сутки данных о резистентности возбудителя к антибактериальным препаратам позволило врачу начинать целенаправленное адекватное лечение больного через день после поступления в стационар.
Выбор материала, направляемого в бактериологическую лабораторию, предварительный этиологический диагноз, дальнейшее направление а объем исследования проводится только после консультации с леча-цим врачом с учетом состояния больного, эпидемиологического анамнеза и данных бактериоскопии мазка мокроты после количественного пета микрофлоры.
Использование данной схемы, основанной на применении питательных сред на основе гидролизата плаценты человека и спилковой обре-зи, диагностических агглютинирующих пневмококковых антисывороток :о специфическим спектром антител, реакции агрегат-гемагглютинации,
»*-622
модели пневмококковой инфекции на лабораторных животных, количественных методах посева и учета, позволило увеличить число диагностируемых заболеваний пневмококковой этиологии на 20, сократить сроки выделения возбудителя до 8-12 часов, снизить затраты на проведение исследований в 3-4 раза.
Показано, что для выявления этиологического лидера при изученной патологии, установления прогноза заболевания необходимо применение комплекса диагностических методов с использованием количественных критериев посева биоматериала и учета результатов при условии консультации бактериолога с лечащим врачом на кавдом этапе исследования.
Приведены условия, необходимые для выделения и идентификации пневмококка из биоматериала.
Сведения о чувствительности к антибиотикам выделенных штаммов пневмококков позволили научно обосновать средства для адекватной антибиотикотерапии при острых и хронических воспалительных заболеваний легких, острых гнойных отитов, деструктивных пневмоний.
Данные серотипового пейзажа пневмококков, циркулирующих у больных при изученной патологии будут способствовать созданию мобильных лечебных и профилактических препаратов.
Предложенные питательные среды апробированы с рекомендациями о целесообразности их использования в диагностике пневмококковой инфекции в ведущих специализированных лабораториях ( ЦКБ 4 Главного Управления МЗ СССР, ЦКБ 4 Главного Управления МЗ РСФСР, НИИ СП им. Склифасовского, ГКБ J6 2 им. И.В.Еусакова, ГКБ * 64, Центральном ордена Ленина институте усовершенствования врачей. Клинике детских болезней I ММИ им. И.М. Сеченова, ВНИИ БП при Совете Министров СССР,
fflffl туберкулеза МЗ СССР, Противотуберкулезном диспансере №.4 ).
Основным научным достижением проведенной работы язляется комплекс новых данных в отношении пневмококковой инфекции, полученный при разработке и внедрении цели и задач данного исследования.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная схема диагностики пневмококковой инфекции, позволяющая увеличить число диагностируемых заболеваний пнешококковой этиологии на 20, сократить сроки выделения возбудителей до 8-12 іасов, снизить затраты на проведение исследований в 3-4 раза.
-
Сконструированные питательные среда для выделения и культивирования пневмококка на основе гидролизатов, полученных из непищевого :ырья, заменяющие дорогостоящие питательные среды на основе мясных гидролизатов, сокращающих время получения конечного результата и [ающих значительный экономический эффект.
-
Новый способ получения диагностических агглютинирующих пнев-юкокковых ангисывороток, позволяющих установить доминирующую роль шевмококка в этиологической структуре различных воспалительных за-іолеваний легких и других заболеваний. С помощью полученных антисыво-юток установлены преобладающие серотшш пневмококков при различных аболеваниях детей и взрослых в Москве.
-
Серологические вариации изолятов bTieprecOCcus рпштоп\<л(L ависят от возраста больного, времени персистирования возбудителя в рганизме, нозологической формы заболевания, характера исследуемого атериала, сезонных колебаний, анамнестических особенностей.
-
Основным функциональным подразделением, где происходит обмен epoianoBS"he|p loco ecu?, pneumomae. являются многоместные боль-ичные палаты, а основным факгором распространения - больные с разно-рофильными диагнозами и бактерионосители.
Внедрение в практику. Министерством здравоохранения СССР утверждены методические рекомендации "Методы и особенности идентификации микрофлоры, выделенной от больных неспецифическими заболеваниями органов дыхания" ( 1991 ).
Используемый в работе метод балансирования питательных сред лег в основу "Методических рекомендаций по балансированию состава микробиологических питательных сред" ( Ї987 ), позволяющий получать среды из не^ пищевого сырья, имеющие более высокие коэффициенты использования компонентов и более экономичные за счет уменьшения их количественного содержания.
На основании экспериментальных исследований разработана и утвержде на на Ученом Совете ЦЕШВС им. И.И.Мечникова "Инструкция по изготовлению и контролю питательной основы из белковых отходов кожевенного производства, сухой"( 1985 ). Инструкция позволяет наладить выпуск триптического гидролизата на основе безотходного производства предприятий кожевенной промышленнооги, обеспечивая экономический эффект. На предприя тии по производству бактерийных препаратов ЦДЛЛВС им. И.И.Мечникова испытан метод приготовления триптического гидролизата и получено несколько серий питательной основы с определением физико-химических параметров ( И I329/4-III5 . 27. 09. 1986 г. ).
Результаты диссертации по методам экспресс-диагностики пневмококковой инфекции, принципам микробиологической диагностики пневмококковой инфекции на фоне лечения антибиотиками, использованию питательной среды, сконструированной на основе гидролизата плаценты человека для выделения пневмококка при поражении легких у детей, использованию пневмококковых антисывороток с типоспецифическим спектром антител в диагностике легоч -ной патологии у детей внедрены в практическую деятельность кафедры детской хирургии ЦОЛИУВ ( № 03/073. 29.01.1985 г. )
Разработанная схема диагностики пневмококковой инфекции внедрена в практическое здравоохранение ( Акт внедрения № 332 от 21.09.3В г.)
Пневмококковые диагностические агглютинирующие антисыворотки и питательные среды на основе гидролизатов плаценты человека и спилковоі обрези используются в лабораториях научно-исследовательских и практических учреждений ( Акт внедрения А 330 и № 331 от 21.09.89 г.)
Получено 2 авторских свидетельства на изобретения и принято 8 рационализатроских предложений.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на совместном заседании секции микробиологии и инфекционной иммунологии с научной конференцией ЩИ-ШО им. И.И.Мечникова ( Москва, 1984 ;, на совместной конференции ГКБ а 2 им. И.В.Русакова и ЦОЛИУВ ( Москва, 1984 ;, на Всесоюзной научно-практической конференции "Биотехнологические и биотехнические процессы в мясной и молочной промышленности" ( Москва, 1987), на 3-ей Всесоюзной конференции "Научные основы технологии промышленного производства биопрепаратов" ( Щелково, 1987 ), на совместной конференции ГКБ J 64 и кафедры педиатрии Университета дружбы народов ям. Патриса Лумумоы ( Москва, 1989 ), на сессии института Пульмонологии ( Москва, 1990 ;, на совместной научной конференции кафедры микробиологии медицинского факультета Университета дружоы яародрв им. Патриса Лумумоы и ЦНШВЦ им. И.Й.Мечяикова ( Москва, 1991 ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 научных работы, из них 17 в центральной печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 408 страницах машинописи и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 9 глав собственных исследований, заключения, выводов, раздела "Практические рекомендации" и списка литературы, включающего 178 отечественных и 235 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 52 таблицами и 31 ри сунками-графиками, схемами, микрофотографиями. Приложение содержит