Введение к работе
Актуальность темы. Среди многочисленных веществ - метаболитов бактерий особое место занимают углеводы и их производные, которые в виде разнообразных производных комплексов входят в состав живых клеток, выполняя роль источника энергии, регуляторов специфических биохимических процессов.
Источником получения экзополисахаридов (ЭПС) на сегодняшний день являются многие микроорганизмы. К наиболее известным микроорганизмам, которые способны продуцировать ЭПС, относятся бактерии разных родов. Среди них значительное место занимают молочнокислые бактерии.
Изучение ЭПС, продуцируемые молочнокислыми бактериями, началось c 80-х годов прошлого столетия и активно развивается в настоящее время, отражением чего служат постоянно публикуемые обзоры (Sandford, Cottrell, Pettitt, 1984; Degeest, Vaningelgem, Vuyst, 2001; Bergmaier, Champagne, Lacroix, 2003; Champagne, Gardner, Lacroix, 2007 и др.).
Среди молочнокислых бактерий особое внимание уделяется бактериям рода Lactobacillus, представители которого широко распространены в природе. Разными исследователями показано, что лактобациллы обладают большим потенциалом в отношении синтеза экзополисахаридов (van den Berg et al., 1995; Gassem, Schmidt, Frank, 1995; Macedo et al., 2002 и др.), однако функции этих биополимеров являются не до конца изученными. Для формирования представления о влиянии ЭПС молочнокислых бактерий на физиологические реакции в организме животных, необходимо накопление данных о химической структуре, физических и биологических свойствах ЭПС разных видов и штаммов.
В связи с этим исследования, посвященные изучению функций экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus различных штаммов, являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.
Цель работы состояла в выделении ЭПС из Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, изучении их основных физико-химических свойств и влиянии их на содержание цитокинов в организме животных в норме и при стафилококковой инфекции.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Подобрать оптимальные условия культивирования L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (состав питательной среды, температура, рН, время культивирования) для обеспечения максимального продуцирования ими экзополисахаридов в лабораторных условиях.
-
Выделить и очистить экзополисахариды L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 из культуральной жидкости.
-
Определить молекулярную массу, химическую природу, моносахаридный состав и вязкость полученных экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.
-
Изучить влияние in vivo экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 на содержание цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных.
-
Оценить цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой инфекции на фоне действия ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.
Научная новизна
Впервые выделены ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936, L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 и определены их молекулярные массы, химическая природа, моносахаридный состав и вязкость. Показано, что L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 максимально продуцируют экзополисахариды на среде A.Welman с соавт. (2003) в нашей модификации при 38С, рН 5,5 на 44-46 ч культивирования.
Обнаружено, что введение ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 в организм лабораторных мышей оказывает неоднозначное влияние на содержание цитокинов: ИЛ-1a, ФНО-a, ИФ-, ИЛ-4 в сыворотке крови. Показана возможность коррекции цитокинового статуса организма лабораторных мышей путем введения им ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 при стафилококковой инфекции.
Практическая значимость работы
Способность экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 регулировать содержание некоторых провоспалительных и регуляторных цитокинов в организме животных открывает перспективы использования их в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при инфекционных заболеваниях.
По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Г.Е. Рысмухамбетовой, Е.Н. Бухаровой, Д.А. Жемеричкиным, Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Выделенные из культуральной жидкости ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 представлены одной нейтральной фракцией с молекулярными массами 140 кДа, 220 кДа, 1700 кДа соответственно и характеризуются сходным моносахаридным составом, однако обладают разной относительной вязкостью.
-
Оптимальными условиями культивирования для наибольшей продукции экзополисахаридов для L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 являются: 38 С, рН 5,5, время культивирования 44-46 ч на модифицированной питательной среде A.Welman с соавт. (2003).
-
ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 оказывают влияние на цитокиновый статус организма экспериментальных животных в норме и при стафилококковой инфекции.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».
Апробация работы:
Материалы диссертации были представлены на: II-Открытой Всероссийской конференции «Молодежь и наука XXI века» (Россия, Ульяновск, 2007); региональной конференции молодых ученых «Вавиловские чтения – 2007» (Россия, Саратов, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины (Россия, Саратов 2009); XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Россия, Санкт-Петербург, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 106 страницах, содержит 2 таблицы, 25 рисунков. Список использованных литературных источников включает 148 наименований, в том числе 128 зарубежных.
