Введение к работе
. АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Известно, что нормальная, кишечная микрофлора принимает активное участие в метаболизме различных соединений в организме хозяина... При ее нарушении, возникают патологические состояния с различными клиническими проявлениями [Подопригора Г.К., 1979; Шендеров Б.А., 1987; Midtvedt А-С.,1994]. Для профилактики и лечения заболеваний, этиопатогенетически связанных с дисбалансом кишечной микрофлоры, в течение последнего времени успешно применяют эубиогики на основе жиеых бактерий - представителей нормальной микрофлоры [Шендеров Б.А-., Манвелова М.А., 1994; Goldin B.R. et а-1.. 1988]. Наше внимание привлекло исследование возможной роли микрофлоры толстого кишечника в деструкции щавелевой кислоты, поступающей в организм с пищей при идиопатическом нефролитиазе. Частота этой патологии в популяции человека неуклонно возрастает, что дало основание рассматривать мочекаменную болезнь (МКБ) как "болезнь цивилизации" [Schneider H.J., 1989]. Причины ее развития продолжают привлекать внимание специалистов различного профиля. Установлено, что оксалатурия в значительной степени определяется содержанием оксалата в пище. Из организма соли щавелевой ' кислоты преимущественно выводятся с фекалиями и с мочой [Kodama Н.,1989]. Основным местом абсорбции оксалата являются дистальний отдел тонкой и слепая кишки [Dobson D.M., Finlayson В., 1973]. Абсорбция оксалатов из кишечника в значительной степени связана с содержанием в пище кальция [Мепоп М., Mahle C.J., 1982]. Расшифровка механизмов формирования гкпероксалурии (для людей это означает превышение оксалата в моче 0,39-0,45 ммолъ/24 часа) поставила в последние годы вопрос об участии кишечной микрофлоры в развитии этой, патологии. К настоящему времени показано, что некоторые микроорганизы, постоянно или временно присутствующие в толстом кишечнике, могут как ферментативно разрушать поступающий с пищей оксалат, так и синтезировать щавелевую кислоту из таких присутствующих в пище предшественников, как белки, аминокислоты, углеводы, спирты, витамин С [Williams Н.Е., Wansilak R., 1989]. Помимо прямого вмешательства в метаболизм оксалата кишечные микроорганизмы способны и опосредованно влиять на пул щавелевой кислоты в организме за счет участия в водно-солевом обмене, метаболизме органических кислот, печеночно-кишечной рециркуляции и т.д. [Шендеров '"Б.А., 1987; Midtvedt А-С.,1994, Midtvedt
T.,1985].
К сожалению, работ, посвященных нормализации метаболизма щавелевой кислоты путем направленного поиска оксалат-деградирущих-бактерий, с-целью их назначения с пищей- для профилактики и лечения гипероксалурии, практически нет. Известна единственная публикация на эту тему [Daniel S.L. et al. І993], хотя, возможно, микроэкологический подход для борьбы с все возрастающим количеством случаев гипероксалурии и МКБ может оказаться эффективным, экономически целесообразным и экологически безопасным.
Кроме того, использование этого подхода может дополнить, а возможно, и по-новому осветить роль кишечной микрофлоры хозяина в поддержании его здоровья. Обнаружение культур микроорганизмов с повышенной оксалат-деградирущей активностью может послужить также основой создания биосенсоров для экспрессного обнаружения и количественного определения оксалата в различных субстратах.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы: в условиях -эксперимента выявить роль кишечной микрофлоры в этиопатогенезе гипероксалуриии и . селектировать штаммы деструкторы оксалатов, перспективные для создания- эубиотиков со специфической направленностью.
Для достижения- поставленной цели были определены следующие
задачи: .
1. Отработать методы определения оксалата в биологическом
материале с использованием различных хроматографических и
ферментных методов. ч
2.Исследовать экскрецию ионов щавелевой кислоты с мочой и фекалиями у безмикробных и конвенциональных линейных крыс. 3.Отработать модель гипероксалурии на животных с целью установления коррелятивных связей гипероксалурии с содержанием оксалата и кальция в пище.
4.Создать селективные среды для изоляции бактерий- представителей нормальной микрофлоры, метаболизирующих оксалат и исследовать распространенность таких микроорганизмов в фекалиях различных животных, птиц и человека.
5.Отобрать штаммы бактерий с; выраженной .оксалат-деструктивной активностью и дать их детальную биологическую характеристику. 6. Исследовать в модельных экспериментах динамику деструкции оксалата лактобациллами и кишечными палочками.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована экскреция ионов щавелевой кислоты с мочой и фекалиями у безмикробных и конвенциональных крыс, отработана модель гипероксалурии на безмикробкых и конвенциональных крысах -линии AGUS,- не содержащих в - своем кишечнике оксалат-деградирующих -. бактерий. У конвенциональных животных этой линии установлена четкая зависимость содержания в моче щавелевой кислоты от количества оксалата и кальция в пищевом рационе.
Сконструированы простые по составу элективные и дифференциально-диагностические среды с оксалатом, позволяющие вести массовое обследование значительных групп животных и людей на присутствие микроорганизмов, метаболйзирующих оксалат.
Установлено, что в фекалиях разных животных, птиц и человека содержатся значительные количества микроорганизмов, способных использовать оксалат в качестве источника углерода и энергии.
Отработана методология отбора штаммов, различной таксономической принадлежности, способных метаболизировать оксалаты.
Создана оригинальная коллекция штаммов-деструкторов оксалата из лактобацилл различного происхождения и энтеробактерий.
Впервые экспериментально обоснованы микроэкологические подходы конструирования препаратов и продуктов функционального питания для профилактики и лечения гипероксалурии и МКБ на основе гсактобацилл.
' ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые создана коллекция дтаммов-деструкторов, способных утилизировать оксалат, используя зго в качестве единственного источника углерода и энергии.
В Государственную коллекцию микроорганизмов - представителей
термальной микрофлоры человека в Московском'
іаучно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии ш. Г.Н.Габричевского депонированы два высокоактивных итамма-деструктора оксалата Lactobacterium plantarum CS,-..actobacterium plantarum 421-2. Подана заявка о выдаче патента РФ и изобретение "Штамм Lactobacillus plantarum CS, деградирующий жсалат" (N94018728, дата приоритета от 25.05.1994).
Сконструированы среды, позволяющие- выделять
жсалат-деградирующие бактерии из различного материала.
Результаты исследования позволили с новых позиций подойти к ітиопатогенезу гипероксалурии и МКБ и наметить пути создания
оригинальнах препаратов на основе лактобацилл для профилактики и лечения этой патологии.
Настоящая работа является часть» комплексных исследований, выполняемых- Московским научно-исследовательским .- институтом-эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского по программам Государственного - Комитета Санэпиднадзора РФ "Разработка экспресс-методов диагностики нарушений микробной экологии и иммунитета, создание эубиотиков второго и третьего поколения, способствующих оздоровлению населения и снижающих заболеваемость в условиях усиливающегося воздействия экстремальных факторов внешней среды" N 3-131-66 и "Разработка новых типов эубиотиков и модуляторов биологических эффектов из бифидобактерий и лактобацилл на основе структурных компонентов микробной клетки" N 3-131-183.
1.Оксалат-метаболизирующие бактерии широко распространены в кишечнике различных животных, птиц и человека.
2.Создание экспериментальной модели гипероксалурии на крысах линии AGUS, на которой показана четкая корреляция выраженности гипероксалурии от содержания оксалата в пище.
3.Изолированы лактобациллы и кишечная палочка, способные в культуральнои.'среде и фекалиях на 30-70% снижать содержание оксалата.
4.С новых позиций рассматривается этиопатогенез
гипероксалурии и связанных с ней патологических состояний и
обосновываются оригинальные микроэкологические подходы
профилактики и лечения этой патологии.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования и основные положения работы обсуждались на научно-практической конференции "Дисбиотические состояния человека, пути профилактики и лечения" (Пермь, 1993), на XI Международном симпозиуме по гнотобиологии (Xlth International Symposium on Ghotobiology), Brasil, Belo-Horisonte, June 1993; на XIX Международном Конгрессе по микробной экологии и болезням (XIX International Congress on Microbial Ecology and Disease), Italy, Rome, September, 1994.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 работ...
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка основной использованной литературы.