Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Современное представление о таксономическом положении цианобактерий 9
1.2. Цианобактерий - как объекты биотехнологии 12
1.2.1. История возникновения циано — бактериальных сообществ 14
1.3. Циано - бактериальное сообщество как целостная система 17
1.3.1. Экзометаболиты цианобактерий 17
1.3.2. Взаимоотношения цианобактерий с сопутствующей микрофлорой в культурах и естественных экотопах 22
1.3.2.1. Состав микрофлоры цианобактерий в культурах 24
1.3.2.2. Состав циано - бактериальных сообществ in situ 27
1.3.3. Жизнеспособность цианобактерий в аксеничном состоянии 32
1.4. Взаимовлияние партнеров и характер отношений, складывающийся в консорциуме 38
1.5. Естественные и искусственные консорциумы цианобактерий 47
1.6. Понятие об искусственных консорциумах 55
Глава II. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований 61
2.1. Методы исследований 68
2.1. Агроклиматические условия района проведения опытов 76
Глава IIІ. Составление микробных циано -бактериальных консорциумов
3.1. Составление микробных циано - бактериальных консорциумов 78
3.1.1. Консорциумы Nostoc paludosum и Nostoc linckia с Rhizobium leguminosarum bv. viceae, шт. 1022, Rhizobium leguminosarum
bv. trifolii, ium.348ta, Mesorhizobium loti, шт. 1801, Bradyrhizobium sp. (Lupinus), шт. 1676 79
3.1.2. Консорциумы Nostoc paludosum с Agrobacterhim radiobacter и Pseudomonas fluorescens 87
3.2. Локализация ризобий в циано - ризобиальных консорциумах 93
3.3. Подбор питательных сред для культивирования консорциума 98
3.3.1. Возможность использования полиметилметакриламидных полимеров для культивирования консорциума 98
Глава IV. Примеры практического использования консорциумов
4.1. Эффективность консорциума Nostoc paludosum, шт. 18 - Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, шт. 348 а на клевере луговом (Trifolium pratense L.) 107
4.2. Эффективность консорциума Nostoc paludosum, шт. 18 — Mesorhizo bium loti, шт. 1801 (агроциана) на лядвенце рогатом {Lotus corniculatus L.) Ill
4.2.1. Влияние агроциана на лядвенец рогатый в вегетационном опыте 112
4.2.2. Влияние агроциана на лядвенец рогатый в полевом опыте 114
4.3. Эффективность консорциума Nostoc paludosum, 18- Agrobacterium radiobacter, шт.17 - Pseudomonasfluorescens, шт.АВХ
(агроциана) на капусте белокочанной (Brassica oleracea L.) 120
4.3.1. Вегетационный опыт 120
4.3.2. Защищенный грунт 124
В ыводы 131
Список литературы 134
Приложения 174
- Современное представление о таксономическом положении цианобактерий
- Взаимоотношения цианобактерий с сопутствующей микрофлорой в культурах и естественных экотопах
- Составление микробных циано - бактериальных консорциумов
- Эффективность консорциума Nostoc paludosum, шт. 18 - Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, шт. 348 а на клевере луговом (Trifolium pratense L.)
Введение к работе
Актуальность темы. Цианобактерии привлекают к себе внимание специалистов разных профилей в связи с древностью их происхождения, особенностями генома и широчайшими адаптационными свойствами (Панкратова Е.М., 1998), позволившими им сохраниться в течение миллиардолетий в виде и ныне процветающей группы микроорганизмов. В поле зрения биологов они попали благодаря способности к бурному развитию в водных экосистемах, получившему название «цветение» воды и приводящему к вредным экологическим последствиям. В то же время исследования Э.А. Штиной и ее школы показали, что нет почв, в которых бы не обнаруживались цианобактерии (Штина Э.А., Голлербах М.М., 1976). При определенных условиях они могут вызывать «цветение» почвы подобное «цветению» водоемов (Панкратова Е.М., 1987; Домрачева Л.И., 1998 а, б).
В настоящее время становится ясной положительная экологическая роль цианобактерии в почве в качестве азотфиксаторов, накопителей органического вещества, центров микрокосмов как автотрофных организмов, с удивительными способностями к симбиотрофным взаимоотношениям (Горелова О.А. и др., 1997; Лобакова Е.С. и др., 2001; Rai A.N. et al., 2000; и др.). Последнее свойство цианобактерии особенно интересно в связи со смещением парадигмы использования в биотехнологии не монокультур микроорганизмов, а консорциумов (Заварзин Г.А., 2003). В природе цианобактерии никогда не наблюдаются в виде популяций клеток одного вида. Они находятся в тесных взаимоотношениях, прежде всего, с микрофлорой, находящейся в слизи и окружающей их клетки. Исследования показали, что состав спутников цианобактерии очень лабилен и зависит от изменения условий местообитания. Аксеничные культуры цианобактерии существуют только в лабораторных условиях. В природе они находятся в сообществах и оставаясь эди-фикаторами микросообществ, они могут менять микробный состав, что дает
возможность конструирования искусственных микроконсорциумов на основе этих организмов.
В исследованиях кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии ВГСХА разрабатывается новое направление использования циано-бактериальных консорциумов в агробиотехнологии, которое требует углубленного изучения взаимоотношений микробов с цианобактериями с одной стороны, и с другой - цианобактерий и растений. Учитывая фрагментарность сведений в этом направлении в отечественной и зарубежной литературе, в данной работе частично восполняется данный пробел.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы было изучение возможности формирования на основе почвенных азотфиксирующих цианобактерий Nostoc paludosum Kiitz., шт. 18, Nostoc linckia (Roth.) Born, et Flah. ium.271, искусственных стабильных микробных консорциумов и использование их в агробиотехнологии.
Перед работой стояли следующие задачи:
изучить искусственные консорциумы между аксеничными культурами
Nostoc paludosum, 18 и Nostoc linckia, 271:
с видами Rhizobium leguminosarum bv. viceae (Frank, 1879) Frank 1889, R. leguminosarum bv. trifolii Dangeard 1926, Mesorhizobium loti Jarvis et al. 1982, Bradyrhizobium sp. (Lupinus) (Schroeter, 1886) Eckhardt et al. 1931.
и Agrobacterium radiobacter (Beijerinck and van Delden 1902) Conn 1942, Pseudomonas fluorecens Migula 1895.
выявить характер взаимных влияний в би- и трехкомпонентных консорциумах цианобактерий и хемотрофных бактерий и локализацию хемо-трофных вселенцев в аксеничной культуре цианобактерий;
исследовать возможность замены агар-агара на химические полимеры с гелифицирующими свойствами;
изучить действие циано-ризобиальных консорциумов на клевер и лядве-нец и сложных циано-бактериальных консорциумов при выгонке рассады капусты.
Основные положения, выносимые на защиту:
Возможность конструирования микробных консорциумов на основе почвенных азотфиксирующих цианобактерий.
Возможность использования созданных микробных циано-бактериальных консорциумов при возделывании бобовых культур и выгонке рассады капусты.
Новизной работы является углубление нового направления использования азотфиксирующих цианобактерий как автотрофного компонента для культивирования хемотрофных бактерий с целью создания искусственных стабильных микробных консорциумов направленного действия. Новым является утверждение о совместимости ЦБ с агрономически значимыми организмами — бактериями pp. Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas. Установлено, что ЦБ не обнаруживают реакции при смене бактериального партнера, не выявляя специфики по отношению к «вселенцам» разных видов. Новым является обнаружение консортов в околоклеточной слизи ЦБ, что свидетельствует об образовании устойчивых взаимоотношений между партнерами искусственно созданного консорциума. Искусственные консорциумы обладали повышенной жизнеспособностью по сравнению с аксеничными культурами, что выражалось в увеличении нитрогеназной активности и содержания хлорофилла а.
Прием создания микробных консорциумов на основе азотфиксирующих цианобактерий открывает новые перспективы в использовании микробных препаратов в агрономии и, с большой вероятностью, может быть использован для решения общих задач биотехнологии, где возникает потребность в стабильно работающих микробных сообществах.
Исследования выполнялись на кафедре ботаники, физиологии растений и микробиологии ВГСХА в рамках исследовательской работы, имеющей государственную регистрацию 01.200.201264.
Апробация работы. Материалы работы были доложены на Всероссийской конф. «Микробиология почв и земледелие», Санкт — Петербург, 1998; на 14 Республиканской молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2000; Всероссийской конференции «Аграрная наука на современном этапе», Санкт-Петербург, Пушкин. 2002; I Всероссийской научно - практической конференции, Киров: Вятская ГСХА, 2004; конференции, посвященной 75-летию основания Вятской государственной сельскохозяйственной академии «Науке нового века - знания молодых», 2005 г; на Международной научно - практической конференции, посвященной 110-летию Вятской сельскохозяйственной опытной станции (Зональный НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого), 2005; на VIII Международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, ВВЦ, 2008), где разработка «Цианобактерии как основа нового направления при создании агробиопрепаратов» была удостоена диплома и бронзовой медали (приложение 1).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, 1 работа в рецензируемом журнале, одобренном ВАК РФ.
Личный вклад автора. Все исследования по теме диссертации проводились лично автором или при его непосредственном участии (соавторы указаны при изложении результатов работы), включая постановку задач исследования, сбор полевого материала, получение экспериментальных данных и их математическую обработку, а также обобщение и интерпретацию полученных результатов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав и выводов. Работа содержит 14 рисунков, 21 таблицу, 2 приложения. Библиография представлена 361 источником, из которых 131 на иностранных языках.
Современное представление о таксономическом положении цианобактерий
Классификацию любых живых организмов следует рассматривать всего лишь как алгоритм, обеспечивающий упорядоченное описание, способствующее идентификации объектов. В задачи биологической классификации в лучшем случае должно входить объяснение закономерностей организации и эволюции живых организмов а, по возможности, и составлять основу рациональной и максимально объективной таксономии (Пиневич А.В., Аверина С.Г., 2002).
В середине 20 века была сформулирована теория двух глобальных морфотипов (Stanier R.W., Van Niel СВ., 1962), что позволило разделить все живые организмы на прокариот и эукариот, а также дать ответ о специфике клеточной организации бактерий в отличие от других микроскопических организмов.
В настоящее время фенотипическая классификация заменяется на филогенетическую, которая разработана и строится на определении последовательности нуклеотидов в гене 16S рибосомной РНК. Из последовательности нуклеотидов строится филогения, важнейшей особенностью которой является разделение живых организмов на три крупные ветви: бактерий - Bacteria, архей - Archaea и эукариот - Eukaiya (Woese C.R. et al., 1990). С 1999 года предлагается узаконить эту номенклатуру и признать существование таксона высшей категории Ітрегіит (мн.число Impend) и множество живых существ распределить между тремя империями: Eukaiyota, Archaeobacteria и Eubacte-ria (цит.по: Бактериальная палеонтология, 2002).
Вновь вводимая филогенетическая классификация имеет и своих противников, убедительно доказывающих, что рРНК не может быть «метроно 10 мом эволюции», вследствие разного количества копий генов рРНК у прокариот, каждая из которых эволюционирует автономно (Головлев И.Н., 1998). Неравномерность темпов нуклеотидных замен в молекулах нуклеиновых кислот подчеркивает Роджер Левин в работе «Молекулярные часы идут неравномерно» (Lewin R., 1990). Применение идентификации объектов по 16S рРНК к природным популяциям показало, что даже в случаях минимального разнообразия (сообщества экстремальных местообитаний) генетически определяются не те организмы, которые есть в культурах. А для познания роли бактерий в природе их классификация на основе морфо - физиологических родов оказывается чрезвычайно удобной из-за соответствия функциональной роли бактерий в природных процессах (Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н., 2001).
Цианобактерии (ЦБ) = синезеленые водоросли = цианеи = Cyanophyta = Cyanobacteria являются одной из ветвей Enbacteria. До недавнего времени систематика этой обширной группы организмов разрабатывалась на принципах ботанической номенклатуры, где основополагающим критерием считались морфологические признаки, наличие оксигенного фотосинтеза (с хлорофиллом «а») и близость экологических ниш ЦБ и водорослей (Голлербах М.М., Штина Э.А., 1969; Кондратьева Н.В, 1981, 1989; Догадина Т.В., 1989; GeitlerL., 1979; Siemenska J., 1979; и др.).
Сегодня неопровержимым фактом является принадлежность ЦБ, [термин предложен Стейниером (Stanier R.W. et al. 1978)], к Eubacteria, с которыми их объединяет: прокариотное строение клетки, состав клеточной стенки, наличие газовых вакуолей (у водных форм), наличие 70S-pn6ocoM, вместо 80S у водорослей, чувствительность клеток к антибиотикам, запасное вещество - оксимасляная кислота, фиксация азота, рост и выживание при высоких температурах. В то же время ЦБ присущи некоторые свойства эукариот: ок-сигенный фотосинтез, наличие многоклеточных дифференцированных форм, II хлорофилла «а», строение каротиноидов, присутствие специфических липи-дов в мембранах и отсутствие жгутиковой стадии (Саут Р., Уиттик А., 1990).
Существует несколько попыток детальных классификаций цианобакте-рий по Бактериологическому коду. Так, цианобактерии предлагается разделить на 5 больших секций, основываясь на критерии деления клеток (Rippka R. etal., 1979):
Секция I. Одноклеточные цианобактерии, которые делятся бинарно или почкованием (Gloeobacter, Gloeothece, Synechococcus, Chamaesiphori).
Секция II. Одноклеточные цианобактерии, которые размножаются различными способами (Dermocarpa, Xenococcus, Dermocarpella, Myxosarcina, Chroococcidiopsis, Pleurocapsa).
Секция III. Нитчатые негетероцистные цианобактерии, которые делятся в одном направлении {Spirulina, Oscillatoria, LPP группа A, Pseudoana-baena, LPP группа В).
Секция IV. Нитчатые гетероцистные цианобактерии, которые делятся только в одном направлении {Anabaena, Nodulafia, Cylindrospermum, Nostoc, Scytonema, Calothrix).
Секция V. Нитчатые гетероцистные цианобактерии, которые делятся в более чем одном направлении (Chlorogloeopsis, Fisherella).
Сходной классификации придерживается и Е.Н. Кондратьева (1996). Она подразделяет цианобактерии на 5 порядков: порядок Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales и Stigonematales.
Исследования автора диссертации относятся к штаммам цианобактерии, принадлежащим к ностоковым. По классификации Риппки с соавт. — это IV секция; по Е.Н.Кондратьевой - пор. Nostocales.
Взаимоотношения цианобактерий с сопутствующей микрофлорой в культурах и естественных экотопах
В природе и в лабораторных условиях рост ЦБ сопровождается развитием организмов, которые принято называть сопутствующими. Природа разнообразия спутников, по-видимому, кроется в определенных морфологических особенностях ЦБ. Их клетки покрыты слизистым гелеобразным чехлом - гликокаликсом (рис.1), благодаря выделению большого количества веществ полисахаридной природы. Структура чехла установлена у многих видов и может быть представлена гомогенным или фибриллярным, однослойным или слоистым строением (Герасименко Л.М и др., 2002). Чехлы и обертки клеток, нитей, трихомов и колоний защищают их от быстрого высыхания и излишней инсоляции, хелатизируют многие микро- и биогенные элементы, стабилизируя фосфорное и катионное питание (Belnap J., Gardner J., 1993). В то же время они являются благоприятной экологической нишей, прежде всего, для трофики бактерий. Последние могут поселяться на поверхности слизи или проникать внутрь ее.
Г.А. Заварзин (2003) обобщил значение слизистого чехла в формировании микробного сообщества. Оно заключается: 1) в удерживании организмов внутри локального пространства и обеспечении стабильности по отношению к физическим факторам; 2) в формировании макроструктуры сообщества с оптимальными диффузионными расстояниями; 3) в ограничении диффузии веществ молекулярной диффузией и создании транспортных колодцев для проникновения питательных веществ; 4) в связывании питательных веществ; 5) в ограничении проникновения вредных факторов как химической природы, так и питающихся бактериями мелких хищников — протист.
Разграничение сопутствующей ЦБ микрофлоры на случайных спутников и «вселенцев» в гликокаликс очень трудно и достаточно условно. Принцип попыток разграничения сводится к отмывке культур от слизи. В то же время, этот прием изменяет физиолого - биохимические свойства клеток ЦБ, как единого организма, включающего и слизистые чехлы. Поэтому большинство исследователей прибегает в лабораторных условиях или к анализу куль-туральньтх жидкостей ЦБ, или, в лучшем случае, подвергают клетки многократным отмывкам и приемам десорбции бактерий, тесно связанных с слизью ЦБ. Таким образом получают приближенные данные о спутниках ЦБ.
В свою очередь прямой микроскопический контроль с контрастированием слизи дает возможность увидеть бактерии - «вселенцы». Это коренным образом отличает ЦБ от капсульных бактерий, например, из трибы клебсиел сем. Enterobacteriaceae, которые имеют постоянно выраженную капсулу и никогда не имеют внутри нее посторонних бактерий.
Приходится признать, что с уверенностью разграничить слизевую и эпифитную микрофлору ЦБ трудно. В дальнейшем, в рамках допустимого, мы попытаемся проанализировать состав микрофлоры обычно сопутствующей ЦБ.
Еще в ранних работах было показано, что состав и количество гетеротрофных бактерий в культурах варьирует в огромных пределах. Так, Л.А. Юнг (1975), работая с культурами почвенных ЦБ кафедры ботаники КСХИ, изолировала и идентифицировала 212 штаммов различных хемотрофных бактерий. Наиболее часто встречаемыми спутниками в культурах ностока были: Pseadomonas sp., Agrobacterium radiobacter Conn., Psendomonas liquefa-ciens Migula, 1900, Chromobactermm auranticum (Frankl. Et Frankl.) Topley et Wilson, 1931. Несколько меньше, но также постоянно в культурах ЦБ ветре 25 чались бактерии p.p. Flavobacterium, Mycobacterium, Bacillus, Sarcina и некоторых других. Так, в 30-ти дневной культуре Nostoc muscorum Л.А. Юнг обнаружила 18 штаммов Pseudomonas различных видов, а в 30 - ти суточной культуре N. paludosum наряду с Pseudomonas доминировали бактерии .Bacillus. Современные исследования также говорят о постоянном присутствии в культурах ЦБ псевдомонад и бацилл (Кособуцкий Л.А. и др., 2003).
Е.И. Андреюк с соавторами (1990) выделили 300 штаммов разнообразных бактерий - спутников из слизи ЦБ возбудителей «цветения» воды. Авторы исследовали: Microcystis pulveria (Wood) Forti emend. Elenk.; M. aeruginosa Kiitz. emend. Elenk.; Anabaena hassali (Kiitz.) Wittr.; A. variabilis Kutz. 125.; Nostoc sp. 5.; Calothrix sp. 10.; Nostoc punctiforme, n.f. 48.; N. punctiforme (Kutz.) Hariot 55.; Calothrix braunii Born. Et Flah. 16.; Phormidium uncinatum (Ag.) Gom. 18.; P. bijugatum Kongiss. 35.; P. autumnale (Ag.) Gom. 112.
Например, спутниками азотфиксирующей ЦБ Nostoc punctiforme, n.f.48 были: Micrococcus albus (Rosenb.), Buchanan, 1911; M. coralloides Zimmerman, 1894; Pseudomonas radiobacter (Beij. et Deld) Bergey et at, 1934; P. desmolyti-cum Gray et Thornton, 1928; Bacterium agile lens en, 1898; Streptomyces globo-sus Krassilnikov, 1944; S.fumosus Krassilnikov, 1944.
Составление микробных циано - бактериальных консорциумов
В обзоре литературы было показано (гл. 1.3.2.2), что ЦБ в естественных экосистемах обитают совместно с сапротрофной микрофлорой. Возможно это содружество сложилось в исторически отдаленное время, в века, предшествующие развитию эукариот (гл. 1.2.1.). Поэтому разрушение этих связей всегда должно основываться на скрупулезности наблюдений и исследований за фактически спмбиотрофными организмами (цианобактерии — бактерии слизистого чехла).
В ранних исследованиях кафедры было установлено, что аксеничные культуры ЦБ могут существовать длительное время совместно с популяциями ризобий (Панкратова Е.М. и др., 2004). Однако решения требовали следующие вопросы: первый — многие ли виды ЦБ способны к сожительству с ррізобиями и, второй - есть ли у ризобиум специфичность по отношению к ЦБ, т.к. большинство видов p. Rhizobium известны как узкоспецифичные организмы по отношению к растению. Решение этого вопроса требовало более широкой амплитуды видов, но мы ограничились только двумя представителями рода Nostoc - Nostoc paludosum и Nostoc linckia, наиболее широко используемых в исследованиях кафедры.
При планировании опытов мы исходили из соображений, что поскольку in situ циано - бактериальные сообщества формируются вновь из той микрофлоры, которая присуща тому или иному местообитанию, то видовая специфичность бактерий в их взаимоотношениях с цианобактериями отсутствует. Предполагалось, что в создаваемых ассоциациях, могут возникнуть стабильные отношения, которые позволят нам использовать такие консорциумы в агробиотехнологии. Стабильность создаваемых консорциумов зависит от многих факторов: отсутствия антагонистических взаимоотношений, установления трофических связей, длительности совместного сосуществования партнеров, совместимости партнеров по темпам размножения, и ряда других факторов. Без решения этих задач невозможно моделирование искусственных ассоциаций с заданными свойствами.
Изучение ассоциаций такого рода имеет особое значение с целью поиска стабилизации эффекта инокуляции семян бобовых растений клубеньковыми бактериями.
В природных условиях между цианобактериями и бактериями, колонизирующими их слизистые чехлы, формируются.стабильные отношения, которые можно определить как симбиотические, характерной особенностью которых является длительное сосуществование партнеров. Такое взаимодействие взаимовыгодно, хотя ухудшение условий жизни цианей может спровоцировать негативную активность сопутствующих им микроорганизмов, что в конечном итоге может привести к гибели фототрофа. Это выражается в резком увеличении количества бактерий - спутников, которым недостаточно прижизненных выделений ЦБ, и они начинают проявлять агрессию по отношению к живым клеткам. С другой стороны, необходимо было учитывать возмолшость выделения культурами цианобактерий бактерицидных веществ (Громов Б.В., 1996; обзор: Сиренко Л.А., Кондратьева Н.В., 1998), что могло бы сдерживать конструирование бактериальных консорциумов.
Между бактериями — спутниками существует конкурентная борьба за прижизненные выделения фототрофа, итогом которой является установление оптимальной численности гетеротрофных организмов. Обычно их число составляет 104 - 105 кл /мл месячной культуры ЦБ (Штина Э.А., Панкратова Е.М., 1974; Калинин А.А., 1995). Поэтому для создания устойчивой саморе гулирующейся системы фототроф - гетеротроф необходимо установление оптимального титра подселяемого бактериального партнера.
Аксенизация цианобактерий ведет к их ослаблению, что проявляется в снижении скорости роста, уменьшении околоклеточной слизи, поэтому не менее важным является и определение времени подсева бактерий - спутников. Ранее в работах кафедры (Ковина А.Л. и др., 1994; Калинин А.А., 1995; Ковина А.Л., Зяблых Р.Ю., 1997) показана возможность совместного существования цианобактерий с двумя видами клубеньковых бактерий. Однако, это не снимало вопроса о видовой специфичности партнеров, поскольку различные виды (штаммы) бактерий и цианей несут в себе черты индивидуальности. Поэтому всякий раз должен решаться вопрос видовой совместимости прогнозируемых компонентов консорциума.
На рисунке 3 (А и Б) виден отклик двух видов ностока на подсев клубеньковых бактерий. На 15-е сутки популяции Nostoc paludosum и Nostoc linckia достигают определенного «пула» клеток, после чего наступает фаза экспоненциального роста. На 65-е сутки культивирования консорциума, численность клеток фототрофа продолжает возрастать, вопреки тому, что к этому времени в аксеничных культурах начинается процесс аутоингибирования. Сравнительное микроскопирование, проведенное нами, у аксеничных культур ЦБ и цианобактерий в составе консорциума показало, что образование акинет и разрушение хлорофилла в ассоциативной культуре отодвигается на четвертый — пятый месяц культивирования, которые в чистой культуре наблюдаются уже на второй месяц роста цианобактерий.
Расположение номинантов на представленных популяционных кривых (рис.3) не требует математической обработки, так как находится в пределах ошибки опыта. По реакции фототрофов на подселение запрограммированной микрофлоры можно сказать, что подселение ризобий не оказывает специфического действия на рост цианобактерий, мало различаясь по итогам культивирования.
Эффективность консорциума Nostoc paludosum, шт. 18 - Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, шт. 348 а на клевере луговом (Trifolium pratense L.)
Для выявления агробиотехнологического потенциала циано — бактериальных консорциумов необходимо проведение исследований непосредственно in situ, так как особенности микробных популяций интродуцентов не обязательно проявляются в этих условиях. Зачастую утрата функциональной индивидуальности представляет собой плату за выживание в рамках естественного микробного сообщества (Кожевин П.А., 2002).
Сравнение эффективности инокуляции основных бобовых культур на территории России в Географической сети опытов (Кожемяков А.П., Тихонович И.А., 1998), показывает, что прибавка урожая после обработки семян препаратами клубеньковых бактерий достоверна лишь в 65 % случаев, относительно небактеризованных вариантов. У однолетних бобовых прибавка урожая часто не превышает 10 - 15 %, что сравнимо с ошибкой обычного полевого опыта.
Нестабильность эффекта инокуляции семян бобовых культур ризоби-альными препаратами, обусловлена многими причинами: генотипом растений и азотфиксирующих микроорганизмов, ингибирующим действием экссудатов семян на бактерии, конкуренцией интродуцированных (производственных) штаммов ризобий с аборигенными популяциями этих бактерий. Последние оказываются столь активными, что до 100 % клубеньков бывает сформировано «местными» штаммами, которые, как правило, обладают низким потенциалом симбиотической азотфиксации (Denton M.D. et al., 2002). Другая причина - поиск подходящей почвенной микрониши, в которой ин-тродуцируемые бактерии могли бы выжить в течение длительного времени и обеспечить эффект от инокуляции. В связи с этим трудно предположить конечное действие бактеризации и, таким образом, все успехи в создании высокоэффективных штаммов не имеют значения, если не обеспечить этим штаммам преимущества при образовании клубеньков (Тихонович И.А., 1996).
В искусственном консорциуме, названном нами агроцианом, цианобак-териям предназначается роль не только носителя и особой экологической ниши, защищающей своего партнера от конкурирующей аборигенной микрофлоры, а также роль энергогенератора. Вместе с тем цианобактерии оказывают самостоятельное воздействие на почву и растение в качестве сильного азотфиксатора, стимулятора роста корней и ингибитора грибной инфекции.
Влияние консорциума (агроциана) исследовалось нами в полевом опыте на клевере луговом (Trifolium pratense L.) совместно с А.Л. Ковиной. Были взяты два сорта местной селекции - среднеспелый районированный сорт Дымковский и ультрараннеспелый сорт Трио. В качестве микросимбионта в консорциуме с ЦБ был взят производственный штамм Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, шт. 348 a.
Подсчет растений, после появления всходов показал, что у бактеризованных вариантов они были более энергичными по сравнению с контролем (рис. 12). Инокуляция агроцианом обеспечила семенам большую энергию прорастания, что в последующем отразилось и на развитии растений. При этом отмечалось преобладание агроциана над традиционным способом нит-рагинизации. К концу вегетации это проявилось в существенном различии количества растений (шт./м2) и при разных вариантах обработки составило: в контрольном варианте - 154 и 128; при обработке семян клубеньковыми бактериями 187 и 149, и обработке агроцианом -312и301,а также числа листьев (шт./м2) - 289 и 276 в контрольном варианте, 296 и 343 в варианте с обработкой семян монопопуляцией Rhizobium legurhinosarum bv. trifolii и 907 и 869 при обработке агроцианом, для сортов Дымковский и Трио, соответственно.
Существенными оказались различия и по другим анализируемым показателям (табл. 12).
Эффективность инокуляции определялась, в первую очередь, относительной прибавкой массы растений по сравнению с неинокулированным контролем. Инокуляция способствовала повышению биомассы надземных органов (табл. 12). Оба сорта оказались отзывчивыми на инокуляцию (у сорта Дымковский прибавка составила - 58,8 и 110,9 %, у сорта Трио - 5,8 и 215,1 % в вариантах с тривиальной нитрагинизацией и обработкой агроцианом), что по-видимому явилось следствием высокой энергии прорастания семян.
Следует отметить, что превышение над неинокулированным контролем у всех сортов достоверно в варианте с агроцианом, а в случае со стандартным приемом, отзывчивым на нитрагинизацию оказался только сорт Дымковский. Это говорит о способности этих сортов клевера в благоприятных для развития симбиоза условиях формировать достаточно высокую массу надземных органов на фоне аборигенных штаммов клубеньковых бактерий, присутствующих в почве.
