Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Микробиологическая конверсия пентоз (обзор литературы) 17
1.1 Природные источники пентоз 17
1.2 Структурно-функциональная характеристика пентоз
растительной биомассы 21
1.3 Микроорганизмы, ассимилирующие экзогенные пентозы 25
1.4 Катаболизм пентоз в микробной клетке
1.4.1 Транспорт 27
1.4.2 Начальные этапы 30
1.4.3 Метаболические циклы
1.4.3.1 Пентозофосфатный цикл (путь Варбурга-Дикенса-Хорекера) 3 5
1.4.3.2 Фосфокетолазный путь 37
1.4.3.3 Гликолиз (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса) 38
1.4.3.4 Метаболизм пирувата
1.4.3.4.1 Окисление пирувата до ацетил-КоА 41
1.4.3.4.2 Конверсия пирувата в этиловый спирт 42
1.4.3.4.3 Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) 43
1.4.4 Продукты неполного окисления пентоз 45
1.5 Биотехнологические преимущества дрожжей 50
1.6 Теоретические расчеты продуктивности этанола и ксилита 55
1.7 Условия, влияющие на образование этанола и ксилита 57
1.8 Генетика катаболизма D-ксилозы 61
1.9 Заключение к главе 1 64
ГЛАВА 2 Материалы и методы 67
2.1 Штаммы, использованные в работе 67
2.2 Среды для культивирования дрожжей 67
2.3 Методы культивирования дрожжей 77
2.3.1 Ферментации на качалочных колбах 77
2.3.2 Ферментации на лабораторной пилотной установке
2.4 Морфологические методы исследования 80
2.5 Методы выделения и анализа мутантов P. tannophilus 81
2.6 Методы получения и анализа гибридов P. tannophilus 82
2.7 Подготовка бесклеточных экстрактов дрожжей 82
2.8 Аналитические методы исследования 83
2.8.1 Определение активности ксилозоредуктазы и ксилитдегидгидрогеназы 83
2.8.2 Определение активности цитохром с оксидазы 84
2.8.3 Определение концентрации растворенного кислорода 85
2.8.4 Хроматографическое определение этанола 86
2.8.5 Хроматографическое определение моносахаридов и ксилита 86
2.8.6 Определение летучих органических кислот 88
2.8.7 Определение веществ лигнофуранового комплекса 88
2.8.8 Анализ фурфурола и оксиметилфурфурола 89
2.9 Статистическая обработка результатов 89
Собственные исследования 90
Глава 3 Анализ биоконверсии d-ксилозы у разных видов дрожжей 90
3.1 Ферментация D-ксилозы ксилозоассимилирующими дрожами 90
3.2 Оценка продукции ксилита и этанола из D-ксилозы 93
3.3 Ферментация D-глюкозы ксилозоассимилирующими дрожжами 96
3.4 Сравнительный анализ биоконверсии D-ксилозы и D-глюкозы в условиях ограниченной аэрации 98
3.5 Биохимические особенности начальных этапов катаболизма D-ксилозы.. 100
3.5.1 Активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы в микроаэробных условиях 100
3.5.1.1 Общая активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы 101
3.5.1.2 НАДH и НАДФH специфические активности ксилозоредуктазы 103
3.5.1.3 НАДФ+ и НАД+ специфические активности ксилитдегидрогеназы 103
3.5.2 Влияние условий аэрации на активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы 106
3.5.2.1 Изменение общей удельной активности ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы 106
3.5.2.2 Изменение специфических удельных активностей ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы 109
3.6 Заключение к главе 3 111
ГЛАВА 4 Физиология роста ксилозоассимилирующих дрожжей c. shehatae и p. tannophilus 1 15
4.1 Потребность в макро- и микроэлементах 115
4.2 Кислород 117
4.3 Температурный режим 118
4.4 рН среды 122
4.5 Концентрация D-ксилозы 122
4.6 Концентрация этанола 125
4.7 Токсические примеси 126
4.8 Рост периодической культуры C. shehatae и P. tannophilus в ксилозосодержащих субстратах различного состава 130
4.8.1 Параметры кривой роста в D-ксилозе 130
4.8.2 Рост дрожжей P. tannophilus в промышленных субстратах 131
4.9 Заключение к главе 4 135
ГЛАВА 5 Жизненный цикл дрожжей P. Tannophilus 136
5.1 Морфологическая гетерогенность коллекционных штаммов 136
5.2 Особенности споруляции морфологических изолятов 137
5.3 Устойчивость морфологических изолятов, жизненный цикл 140
5.4 Изогенные гаплоидный и диплоидный штаммы P. tannophilus 142
5.5 Динамика жизненного цикла штаммов различной плоидности 144
5.6 Стабилизация фаз жизненного цикла дрожжей P. tannophilus 149
5.7 Поведение изогенных штаммов P. tannophilus в жидких средах 153
5.8 Заключение к главе 5 159
ГЛАВА 6 Выделение и анализ биохимических мутантов дрожжей P. Tannophilus 160
6.1 Создание коллекции мутантов P. tannophilus 160
6.1.1 Условия мутагенеза, индуцированного действием НГ 161
6.2 Ауксотрофные мутанты 1 61
6.3 Гибридологический анализ дрожжей P. tannophilus 1. 65
6.4 Мутанты с нарушениями катаболизма D-ксилозы
6.4.1 Морфологическая оценка 174
6.4.2 Микроаэробная ферментация D-ксилозы 1 77
6.4.3 Активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы 1 84
6.4.4 Метаболические особенности мутантов P. tannophilus, продуцирующих этанол и ксилит 187
6.5 Заключение к главе 6 191
ГЛАВА 7 Спиртовая ферментация ксилозосодержащих субстратов дрожжами p. tannophilus 193
7.1 Влияние условий аэрации на ферментацию D-ксилозы 193
7.2 Влияние концентрации биомассы P. tannophilus на ферментацию модельного гексозо-пентозного субстрата 199
7.3 Влияние ингибиторов на ферментацию промышленного субстрата 2 01
7.4 Кинетические параметры спиртовой ферментации ксилозосодержащих субстратов различного состава
7.4.1 D-ксилоза 205
7.4.2 Модельная гексозо-пентозная смесь
7.5 Промышленные источники D-ксилозы 208
7.6 Заключение к главе 7 212
ГЛАВА 8 Проблемы и перспективы микробиологической конверсии пентоз (обсуждение) 213
8.1 Комплексная методология исследования катаболизма D-ксилозы 213
8.2 Общие черты и особенности катаболизма D-ксилозы у дрожжей 215
8.3 Значение физиологического и генетического аспектов для исследования регуляции катаболизма D-ксилозы 219
8.4 Факторы, регулирующие продукцию этанола и ксилита 227
Заключение 235
Выводы 237
Список сокращений и условных обозначений 240
Список использованной литературы
- Пентозофосфатный цикл (путь Варбурга-Дикенса-Хорекера)
- Ферментации на лабораторной пилотной установке
- Оценка продукции ксилита и этанола из D-ксилозы
- Рост периодической культуры C. shehatae и P. tannophilus в ксилозосодержащих субстратах различного состава
Введение к работе
Актуальность исследований и состояние проблемы. Динамичное развитие мировой цивилизации невозможно без поиска дешевых возобновляемых энергоносителей, альтернативных нефти и каменному углю (Mller et al., 2014). Этиловый спирт, по сравнению с другими формами биоэнергии, выгодно отличают низкие стоимость и токсичность для окружающей среды (Lim et al., 2013). Главным условием его конкурентоспособности на рынке моторного топлива считают использование непищевого сырья – гидролизатов, полученных из отходов сельского хозяйства, лесного и лесоперерабатывающего комплекса, а также побочных продуктов целлюлозно-бумажных комбинатов – сульфитных щелоков (Grio et al., 2010), которые являются многокомпонентными смесями гексоз и пентоз, на 20-92% состоящими из D-ксилозы (Novy et al., 2013). Неспособность традиционных продуцентов спирта, дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ассимилировать этот источник углерода вплоть до недавнего времени препятствовала комплексной микробиологической переработке разнообразных отходов биомассы растений. Ситуацию принципиально изменило обнаружение ксилозоассимилирующих бактерий и дрожжей, продуцирующих этанол. Однако использование бактерий в качестве продуцентов спирта мало актуально, так как при распаде D-ксилозы их клетки образуют многокомпонентную смесь продуктов (Mishra and Singh, 1993). Лучшие перспективы для промышленной реализации такого процесса имеют дрожжи, которые образуют лишь этанол и ксилит (Winkelhausen and Kuzmanova, 1998).
К началу исследований было опубликовано огромное количество материалов, посвященных катаболизму D-ксилозы у дрожжей (Jeffries, 1983; Toivola et al., 1984; Ojamo, 1994), его ключевым этапам и ферментам (Ditzelmuller, 1984; Prior et al., 1988; Rizzi et al., 1989; Verho et al., 2003). Недостаточная изученность биологии и физиологии ксилозоассимилирующих штаммов, ранее не являвшихся экспериментальными объектами, препятствовала установлению единых критериев выбора модели, интересной для анализа не только прикладных, но и фундаментальных аспектов катаболизма D-ксилозы. Ее отсутствие затрудняло выявление причин тесной взаимосвязи катаболизма D-ксилозы с процессами роста, условий накопления ксилита, побочного продукта спиртовой ферментации, а также идентификацию факторов и биохимических этапов, лимитирующих продукцию этанола.
Низкая спиртообразующая активность дрожжей на ксилозосодержащих субстратах (Alexander et al., 1987) не позволяла адекватно оценить перспективность коллекционных штаммов в качестве продуцентов этанола (Jeffries, 1981; Slininger et al., 1987; Horitsu et al., 1992). Вследствие этого, формулирование принципов и механизмов управления спиртообразованием дрожжей имело первостепенную значимость для определения стратегии генетического конструирования промышленных продуцентов этанола на ксилозосодержащих субстратах из отходов растительной биомассы (Toivari, 2007; Demeke et al., 2013).
Решить данные проблемы невозможно без единого целостного представления о биохимических закономерностях распада D-ксилозы в дрожжевой клетке, а также условиях поддержания ее высокой каталитической активности на сложных многокомпонентных субстратах. Поэтому изучение метаболической и физиологической регуляции образования этанола и ксилита у ксилозоассимилирующих дрожжей актуально не только в плане разработки научных основ получения ценных для народного хозяйства веществ, но также создания новых экологически-безопасных технологий утилизации вторичных непищевых источников растительной биомассы, которые ежегодно в огромных количествах поставляют целлюлозно-бумажные и гидролизные предприятия Российской Федерации.
Цель настоящего исследования - на основании анализа метаболической и физиологической регуляции образования этанола и ксилита у ксилозоассимилирующих дрожжей сформулировать научные основы получения биоэтанола из вторичных непищевых источников растительного сырья.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Сравнительная оценка биотехнологических и биохимических аспектов катаболизма D-ксилозы у 21 штамма 12 видов ксилозоассимилирующих дрожжей, относящихся к родам Candida, Kluyveromyces, Pachysolen, Pichia и Torulopsis.
-
Выбор модельного объекта, характеристика его физиологических, биологических и генетических особенностей, получение мутантов с нарушениями катаболизма D-ксилозы.
-
Изучение факторов, влияющих на процессы образования этанола и ксилита у штаммов дрожжей Candida shehatae Y-1632 и Pachysolen tannophilus Y-1532.
-
Выявление энзиматических особенностей, активирующих селективную продукцию этанола из D-ксилозы.
-
Определение основных физиологических параметров, благоприятствующих метаболической активности ксилозоассимилирующих дрожжей Р. tannophilus Y-1532.
-
Анализ закономерностей спиртовой ферментации ксилозосодержащих субстратов различного состава.
-
Оценка возможностей регуляции экономического выхода спирта из промышленных источников D-ксилозы (гидролизатов гемицеллюлозной фракции лиственной древесины и сульфитных щелоков) традиционными биотехнологическими приемами.
Научная новизна. Доказаны уникальные особенности штаммов дрожжей P. tannophilus: лабильность путей катаболизма D-ксилозы (продукция сопоставимых количеств этанола и ксилита), физиологическая пластичность (устойчивость к изменению температуры, рН, концентраций D-ксилозы, этанола и токсических продуктов деструкции лигноцеллюлозы). Обоснованы преимущества использования этих дрожжей в качестве модели для анализа закономерностей спиртовой ферментации промышленных источников D-ксилозы.
Установлены причины внутрипопуляционной гетерогенности и диссоциации коллекционных штаммов P. tannophilus, подробно описан их жизненный цикл. Впервые определены условия дифференциации, а также стабилизации фаз жизненного цикла P. tannophilus, выявлена первостепенная роль источников углерода, азота, серы, комплекса микроэлементов и витаминов.
Получены важные доказательства ключевой роли ксилозоредуктазы (ЕС 1.1.1.21) и кси-литдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.9) в регуляции катаболизма D-ксилозы у дрожжей. Сформировано целостное представление о зависимости уровня продукции ксилита и этанола от активности и коферментной специфичности ксилозоредуктазы, а также ксилитдегидрогеназы. Раскрыт механизм влияния кислорода на активность этих ферментов.
Показано, что главная причина накопления ксилита - дисбаланс НАДФ/НАДхН2 является результатом скоординированной перестройки углеводного обмена дрожжевой клетки в целом, а не только изменения активности ключевых ферментов катаболизма D-ксилозы. Установлено, что ингибирование процессов биологического окисления и окислительного фосфорили-рования активирует спиртообразование ксилозоассимилирующих штаммов. Цитозольный баланс НАДФ/НАДхНг в таких условиях поддерживается достаточно высокими активностями ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы, а также 1-глицерофофатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.8) и лактатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27).
Впервые доказана потенциальная возможность активации спиртообразования у штамма Р. tannophilus Y-1532 неспецифическими ингибиторами метаболизма, обычными компонентами промышленных источников D-ксилозы - фурфуролом, оксиметилфурфуролом, летучими органическими кислотами и веществами лигнофуранового комплекса. Установлены кинетические характеристики и динамика накопления этанола из многокомпонентных гексозо-пентозных субстратов растительного происхождения.
Положения, выносимые на защиту:
-
Распад D-ксилозы у ксилозоассимилирующих дрожжей протекает по единой схеме. Вовлечение данного источника углерода в общие пути катаболизма осуществляют ферменты кси-лозоредуктаза и ксилитдегидрогеназа, регулирующие образование D-ксилулозы. В микроаэробных условиях катаболизм D-ксилозы тормозится, приводя к накоплению ксилита и этанола. Их соотношение коррелирует с общей активностью ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы.
-
Кислород - главный фактор, регулирующий активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы дрожжей. При микроаэробном режиме культивирования в клетках большинства исследованных видов формируется дисбаланс коферментов НАДФ/НАДхН2, частично либо полностью блокирующий катаболизм D-ксилозы на этапе образования ксилита.
3. Дрожжи P. tannophilus выгодно отличает уникальная лабильность путей катаболизма
D-ксилозы (способность продуцировать ксилит и этанол в сопоставимых количествах), а также физиологическая пластичность (устойчивость к варьированию температурного режима, рН среды, концентрации D-ксилозы, большая толерантность к присутствию этилового спирта и токсических примесей). Штаммы этого вида целесообразно использовать в качестве моделей для анализа метаболической и физиологической регуляции образования этанола и ксилита, а также биоконверсии разнообразных отходов промышленной деструкции лигно-целлюлозы.
-
Жизненный цикл P. tannophilus относится к дипло-гаплонтному типу с преобладанием гап-лофазы. Диплоидная стадия жизненного цикла кратковременна и неустойчива. Продолжительность вегетативного роста клеток различной плоидности, динамика полового процесса гаплоидов зависят от качественного и количественного состава источников углерода, азота, серы, микроэлементов, витаминов. Мутационный и гибридологический анализ применимы для изучения основ генетической системы, а также конструирования штаммов P. tannophilus различного фенотипа. Селективные среды с D-ксилозой, ксилитом или этанолом в качестве единственного источника углерода позволяют осуществлять направленный скрининг мутантов P. tannophilus с нарушениями катаболизма D-ксилозы.
-
Главными атрибутами коллекционных штаммов дрожжей, а также мутантов P. tannophilus, образующих этанол из D-ксилозы, являются достаточно высокие общие активности НАДФхН/НАДхН-ксилозоредуктазы со значительной долей НАДхН-специфической активности и НАД+-ксилитдегидрогеназы. Спиртообразованию благоприятствует увеличение активностей 1-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы на фоне ингибирования НАД+-зависимой малатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.37) и цитохром с оксидазы (ЕС 1.9.3.1).
-
Спиртообразование из D-ксилозы возможно лишь при жестком ограничении роста дрожжей. Такой эффект, помимо кислорода, оказывают неспецифические ингибиторы метаболизма: фурфурол, оксиметилфурфурол, летучие органические кислоты и вещества лигнофуранового комплекса - обычные компоненты промышленных гидролизатов лигноцеллюлозы и сульфитных щелоков.
-
Образование этанола из ксилозосодержащих субстратов носит диауксический характер, соответствующий характеру ассимиляции различных гексоз и пентоз дрожжевой клеткой. При этом глубина утилизации D-ксилозы зависит от суммарной концентрации D-глюкозы и D-маннозы. Спиртовая биоконверсия кислотных гидролизатов и сульфитных щелоков ксило-зоассимилирующими дрожжами эффективно регулируется традиционными биотехнологическими приемами (оптимизацией плотности засева дрожжей, раздельной ферментацией гексоз и пентоз, осуществлением процесса в дифференцированных режимах аэрации).
Научно-практическая значимость. Результаты позволили сформулировать комплексную методологию исследования регуляции образования этанола и ксилита у дрожжей, включающую биохимический (анализ ферментов начальных этапов распада D-ксилозы и общих путей катаболизма сахаров), физиологический (оценка параметров роста ксилозоассимилирующих штаммов), генетический (выделение и анализ биохимических мутантов с нарушениями катаболизма D-ксилозы), а также биотехнологический (определение условий поддержания каталитической активности ксилозоассимилирующих дрожжей на промышленных источниках D-ксилозы) аспекты.
Выявлены основные метаболические характеристики дрожжей-продуцентов этанола и ксилита. Штаммы P. tannophilus использованы в качестве моделей для изучения фундаментальных и прикладных аспектов катаболизма D-ксилозы. Доказана применимость мутационного и гибридологического анализа для изучения генетической системы дрожжей P. tannophilus, предложены алгоритмы отбора мутантов с улучшенной продукцией этанола и ксилита, которые успешно апробированы в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (Техническом университете), Петрозаводском государственном университете в ходе подготовки курсовых и дипломных проектов, а также диссертационных работ.
Определены физиологические параметры роста и спиртообразования дрожжей P. tannophilus на сложных многокомпонентных субстратах растительного происхождения. Апробированы различные технологические схемы ферментации промышленных источников D-ксилозы, установлены исходные параметры ее лабораторного регламента. Рассчитаны теоретические выходы биоэтанола из вторичных непищевых источников растительной биомассы.
Экспериментальные материалы диссертационной работы использованы для подготовки лекционного курса «Введение в биотехнологию» для бакалавров и специалистов эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университета.
Методология и методы исследования. Штаммы ксилозоассимилирующих дрожжей разных таксономических групп инкубировали стандартными методами, изучали традиционными приемами биохимического и физико-химического анализа. Активность ключевых ферментов катаболизма D-ксилозы, а также ферментов общих путей катаболизма сахаров определяли спектрофотометрически, предварительно разрушая дрожжевые клетки стеклянными шариками диаметром 0,4-0,5 мм на гомогенизаторе. Биохимические мутанты выделяли, обрабатывая суспензию гаплоидных клеток P. tannophilus в экспоненциальной фазе роста химическим мутагеном 1-метил-3-нитро-1`-нитрозогуанидином. Фенотипы ауксотрофных мутантов устанавливали тестом Холлидея, их генетические особенности выявляли, применяя общепринятую методологию исследования спорогенных дрожжей. Нарушения катаболизма D-ксилозы идентифицировали по характеру роста мутантов P. tannophilus на D-ксилозе, ксилите или этаноле в качестве единственного источника углерода. Плоидность штаммов P. tannophilus подтверждали, анали-
зируя макроморфологию (цвет, форму, характер поверхности колоний) и микроморфологию
(размер, форму, характер почкования и споруляции клеток). Физиологию роста дрожжей, а
также спиртовые ферментации ксилозосодержащих субстратов изучали в лабораторном фер
ментере ёмкостью 2 л при коэффициенте заполнения 0,75. Концентрацию растворенного кисло
рода устанавливали с помощью кислородного электрода. Для количественного определения
этилового спирта, моносахаридов и ксилита использовали газовую хроматографию. Соли лету
чих органических кислот разрушали фосфорной кислотой и определяли титриметрически. Со
держание веществ лигнофуранового комплекса рассчитывали спектрофотометрически. Фурфу
рол и оксиметилфурфурол анализировали методом газо-жидкостной хроматографии. Влияние
температуры, D-ксилозы и этилового спирта на метаболическую активность
дрожжей оценивали, применяя математическое моделирование. Все эксперименты выполнены в нескольких повторностях, а полученный фактический материал обработан методами статистического анализа.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Настоящая работа является развитием научных исследований программы «Биотехнология 2000» в соответствии с Госзаказом №1891-5365-01 и №0005365061Б3, а также Федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России на период 2002-2006 годы».
Экспериментальный анализ коллекционных штаммов ксилозоассимилирующих
дрожжей; изучение жизненного цикла P. tannophilus и основ генетической системы данного вида; определение параметров спиртовой ферментации ксилозосодержащих субстратов различного состава и происхождения выполнены в лаборатории промышленной микробиологии ВНИИ-Гидролиз (г. Санкт-Петербург). Биотехнологические характеристики мутантов P. tannophilus устанавливали на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (Технического университета). Дифференциацию и стабилизацию жизненных фаз дрожжей P. tannophilus, подбор условий для мутационного и гибридологического анализа штаммов этого вида проводили на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии, а также кафедре фармакологии и организации экономики фармации с курсами микробиологии и гигиены Петрозаводского государственного университета. Оценку активности 1-глицерофофатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, НАД+-зависимой ма-латдегидрогеназы и цитохром с оксидазы мутантов P. tannophilus проводили на базе лаборатории экологической биохимии Карельского научного центра Российской академии наук (г. Петрозаводск). Активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы коллекционных штаммов дрожжей и мутантов P. tannophilus была изучена в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации
(НИИ гриппа РАМН, г. Санкт-Петербург). Научные положения диссертации и выводы базируются на собственных исследованиях автора.
Апробация работы. Экспериментальные результаты представлены на VII и VIII межгосударственных межвузовских научно-практических конференциях «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (г. Cанкт-Петербург, 1995 и 1996); I-ой международной конференции «Биоиндикация и оценка повреждения организмов и экосистем» (г. Петрозаводск, 1997); международной молодежной научной школе «Биоиндикация-98» (г. Петрозаводск, 1998); IV всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (г. Санкт-Петербург, 1999); всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы питания населения и военнослужащих» (г. Санкт-Петербург, 2000); III съезде биохимического общества (г. Санкт-Петербург, 2002); международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки – к новым технологиям» (г. Тверь, 2002); всероссийской конференции по проблемам науки и высшей школы «Фундаментальные исследования в технических университетах» (г. Санкт-Петербург, 2005); международном форуме «Биотехнология и современность» (г. Санкт-Петербург, 2005); научной конференции «Рациональное использование природных биологических ресурсов» (Тунис, 2005); международной научно-практической конференции «Новые топлива с присадками» (г. Санкт-Петербург, 2006); VII международном форуме «Биотехнология и современность» (г. Санкт-Петербург, 2006); I-ой международной школе-семинаре для молодых ученых «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Биологические ресурсы Арктики и Субарктики – потенциал для биотехнологии» (г. Петрозаводск, 2010); VIII международной научно-практической конференции «Дни науки-2012» (г. Прага, 2012); международной интернет–конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (г. Казань, 2012); II-ой международной научно-практической конференции «Фундаментальная наука и технологии – перспективные разработки» (г. Москва, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 15 статей в российских журналах из списка ВАК, 17 статей в российских и международных журналах и сборниках трудов научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав (обзор литературы, материалы и методы, пять глав результатов собственных исследований, обсуждение), заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка использованной литературы и приложений общим объемом 280 страниц машинописного текста. В работу входит 37 рисунков и 58 таблиц. Список цитируемой литературы включает 91 русскоязычный источник и 246 зарубежных источников.
Рассмотрены структурно-функциональные особенности D-ксилозы и других пентоз ге-мицеллюлозы, их катаболизм (транспорт, начальные этапы, универсальные пути, целевые продукты, а также факторы, определяющие их накопление) микроорганизмами различных таксономических групп. Установлены преимущества биоконверсии ксилозосодержащих субстратов дрожжами по сравнению с бактериями и грибами. Представлен критический анализ теоретических выходов ксилита и этанола, способов увеличения их продукции коллекционными штаммами, а также генетического контроля распада D-ксилозы в дрожжевой клетке. Обоснована необходимость изучения метаболической и физиологической регуляции этого процесса для осуществления направленной биоконверсии промышленных источников D-ксилозы – кислотных гидролизатов древесины и сульфитных щелоков в этиловый спирт.
Пентозофосфатный цикл (путь Варбурга-Дикенса-Хорекера)
Большинство про- и эукариотических видов не способно метаболизировать компоненты гемицеллюлозы без предварительной деструкции (Беккер, 1988; Gottschalk, 1986). В промышленных условиях ее гидролиз обеспечивают HCl, H2SO4 или варочная кислота, традиционно применяемая для сульфатной варки древесины (Шарков и др., 1972; Taherzadeh and Keikhosro, 2007). Кроме смеси моносахаридов и лигнина такие реагенты способствуют образованию органических кислот, фурфурола, оксиметилфурфурола (5-гидроксиметилфурфурола), а также веществ лигнофуранового комплекса. Их негативное влияние на рост микроорганизмов достаточно хорошо известно (Kim et al., 2001; Nigam, 2002).
Так, муравьиная, уксусная и левулиновая кислоты диффундируют через цитоплазматическую мембрану, диссоциируют, снижают величину рН, вызывая широкий спектр биохимических изменений (Watson et al., 1984; Скрябин, 1988). Фурфурол и оксиметилфурфурол ингибируют активность целого ряда ферментов: гексокиназы, альдолазы, фосфофруктокиназы, триозофосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, ацетальдегиддегидрогеназы и пируватдегидрогеназного комплекса (Виноградова, 2001; Helle et al., 2003). Установлено, что дрожжи способны метаболизировать фурфурол, продуцируя менее токсичную фуранкарбоновую кислоту (Watson et al., 1984). Токсичность оксиметилфурфурола определяется, главным образом, длительностью его воздействия на клетку (Taherzadeh and Keikhosro, 2007). В составе кислотных гидролизатов часто обнаруживают ароматические соединения, продукты деградации лигнина и экстрактивных веществ (Watson et al., 1984). Адсорбируясь в форме коллоидных пленок на поверхности клетки, они увеличивают микровязкость среды, нарушают избирательность транспорта веществ органической и неорганической природы (Kim et al., 2001). Эти причины объясняют необходимость предварительной детоксикации промышленных субстратов из растительной биомассы. Ее глубина в каждом случае зависит от качественного и количественного состава лигноцеллюлозного сырья, а также физиологических особенностей микроорганизмов, использованных для биоконверсии (Magree et al., 1985).
На основе достижений инженерной энзимологии разработан метод гидролиза растительной биомассы в присутствии целлюлаз и гемицеллюлаз бактериального и грибного происхождения (Martin et al., 2002). Такие ферменты стереоспецифичны, их активность регулируется целым рядом внешних и внутренних факторов (Saddler et al., 1983). Кроме того, полный гидролиз достигается лишь в случае тщательного подобора эндо- и экзогидролаз с учетом источника растительного сырья (Taherzadeh and Keikhosro, 2007). Несмотря на безопасность для окружающей среды, финансовые затраты, обычно сопутствующие иммобилизации ферментов, заметно снижают коммерческую привлекательность энзиматического гидролиза вторичных непищевых источников растительной биомассы (Kim et al., 2001).
Тем не менее, возможность деструкции гемицеллюлозы позволяет рассматривать пентозы в качестве колоссального возобновляемого источника биоэнергии. Это является предпосылкой для пересмотра и расширения наших представлений об участии пентоз в круговороте органических форм углерода на Земле, а также разработки научных основ их биотехнологического применения. Подавляющее большинство про- и эукариотических микроорганизмов утратило способность к ассимиляции таких источников углерода. Главная причина – структура, определяющая химическую реактивность пятиатомных моносахаров.
По химической структуре пентозы относятся к полиоксиальдегидам (альдозам), их принадлежность к D-, либо L-ряду определяет пространственная конфигурация гидроксильной группы у центра хиральности с наибольшим порядковым номером. Основным пентозным компонентом гемицеллюлозы считают D-ксилозу, на долю которой в лиственных породах деревьев и однолетних растениях приходится от 28 до 63% (Гудвин и др., 1986). Ферменты про- и эукариотических микроорганизмов катализируют преимущественно реакции с участием D-сахаров. Метаболизму L-изомеров предшествуют эпимеризация либо окислительно-восстановительные превращения (Gottschalk, 1986; Беккер, 1988). Реакционная активность пентоз в водных растворах зависит от преобладания тетрагидропиранового (пиранозного) либо тетрагидрофуранового (фуранозного) циклов, а также пространственной локализации ОН-групп относительно плоскости молекулы (Кочетков и др., 1967). Известно, что конформационная устойчивость D-изомеров пентоз тесно связана с ориентацией полуацетального гидроксила (у Сі атома пиранозы либо Сг атома фуранозы). Его экваториальное положение (/?-аномер) уменьшает «прочность» шестичленного цикла, и, напротив, стабилизирует конформацию пятичленного «кольца» (Кочетков и др., 1967), см. таблицу 1.2, рисунок 1.2. Заметный вклад в создание реакционной подвижности циклических форм пентоз вносит цис-конфигурация заместителей относительно плоскости молекулы (Стоддарт, 1975). По этой причине D-рибоза, в отличие от других пентоз, является интермедиатом универсальных и специфических путей микробного метаболизма (Gottschalk, 1986; Шлегель, 1987). Пространственная «жесткость» молекулы, легкость образования 0-гликозидных и N-гликозидных связей в водной среде делают /?-аномеры рибозы, ксилозы и арабинозы незаменимыми компонентами нуклеиновых кислот, липополисахаридов, протео- и гетерогликанов (Finch, 1999). Тем не менее, скорость катаболизма экзогенных пентоз в микробной клетке значительно ниже по сравнению с гексозами. Данное отличие вызвано преобладанием «экваториальных» ОН-групп в пиранозном цикле, транс-ориентации заместителей у С2 и С3 фуранозы (Стоддарт, 1975). Поэтому лишь узкий спектр бактерий, включающий представителей родов Bacillus, Clostridium, Enterobacter, Pseudomonas, а также некоторые другие виды без определенного таксономического положения, ксилозоассимилирующие дрожжи, грибы «белой» и «бурой» гнили ассимилируют данные источники углерода в природных условиях (Jeffries, 1983; Saddler et al, 1983; Ojamo, 1994).
Ферментации на лабораторной пилотной установке
Известно, что дрожжи - гетеротрофные микроорганизмы, ассимилирующие углерод преимущественно в форме моносахаридов, реже - в форме ди- и трисахаридов. Более 50 разнообразных индуцибельных ферментов регулируют активность основных, а также запасных путей катаболизма (Берри, 1985; Квасников и Щелокова, 1991). Дрожжевая клетка функционирует по принципу максимальной экономии, синтезируя лишь необходимые в соответствии с качественным и количественным составом питательной среды, а также другими условиями культивирования ферменты (Коновалов, 1969; Котельникова, 1984). Потребление компонентов сложных субстратов, таких как растительные гидролизаты, сопровождается явлением полиауксии: первоочередной ассимиляции D-глюкозы и D-маннозы - наиболее энергетически выгодных источников углерода. Данная особенность обеспечивает не только высокую скорость роста дрожжевых культур, но также большую по сравнению с бактериями и грибами интенсивность метаболических процессов (Коновалов, 1969; Barnett, 1976; Бабьева и Чернов, 2004).
Ярко выраженный бродильный тип катаболизма сахаров приводит к гликолитическому окислению 65-83% шестиатомных сахаров до пировиноградной кислоты (Бабьева и Чернов, 2004). В соответствии с данными Д. Барнетта (Barnett, 1976), более 50% известных видов дрожжей продуцируют этанол из D-глюкозы, 10% - из D-галактозы, рисунок 1.10. Кроме того, выявлена четкая корреляция между способностью этих микроорганизмов к анаэробной ферментации D-глюкозы и сбраживанием D-фруктозы и D-маннозы (Kavanagh and Whittaker, 1994). Конкуренция пентозофосфатного цикла и пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса за глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат и глицеральдегид--3-фосфат обеспечивает перераспределение метаболических потоков и, как следствие, гибкую регуляцию энергетического обмена при ассимиляции «запасных» источников углерода, подобных D-ксилозе.
Особенности катаболизма различных сахаров дрожжами физиологической пластичностью дрожжей: осмотолерантностью, устойчивостью к высоким концентрациям сахаров в ферментируемом субстрате, а также присутствию спирта, малой чувствительностью к изменению температурного режима и рН (Берри, 1985; Квасников и Щелокова, 1991; Бабьева и Чернов, 2004). Благодаря этим качествам они были признаны наиболее перспективными объектами для получения спирта из вторичных непищевых источников растительной биомассы (Hinman et al., 1989).
Согласно исследованиям Барнетта, аэробная утилизация D-ксилозы свойственна более 50% из 434 видов дрожжей (Barnett, 1976). Однако в течение длительного периода времени господствовало утверждение об их неспособности сбраживать D-ксилозу. Причиной тому являлась неээфективность теста Дунбара, традиционного метода оценки спиртообразующей активности дрожжей (Бабьева и Голубев, 1979), в отношении ксилозоассимилирующих штаммов. Лишь к 1980-84 гг. целый ряд авторов продемонстрировал возможность спиртовой ферментации D-ксилозы при режиме ограниченной аэрации (Maleszka and Schneider, 1982; Du Preez and Wan der Walt, 1983; Delweg et al., 1984; Toivola et al., 1984). Это вызвало большой интерес. Данный феномен стали изучать различными методами (Slininger et al., 1987; Prior et al., 1989; Schneider, 1989; Mishra and Singh, 1993) в аэробных (Jeffries, 1981; Mutze and Wandrey, 1983; Nigam et al., 1985; Lighthelm et al., 1988), микроаэробных (Slininger et al., 1987) и анаэробных (Delgenes et al., 1986; Ligthelm et al., 1988; Grootjen et al., 1990; Furlan et al., 1994) условиях на обогащенных и синтетических средах, а также ксилозосодержащих субстратах из растительной биомассы (Prior et al., 1989). Данные, касающиеся одних и тех же видов, часто были непригодны для сравнительного анализа, что значительно осложняло биотехнологическую оценку ксилозоассимилирующих дрожжей. Наибольший уровень продукции спирта отличал штаммы Pichia stipitis, Candida shehatae, Candida sp. XF 217, Candida tenius и Candida fructus (Таблица 1.5).
Год от года усиливается интерес к анализу возможностей получения ксилита из D-ксилозы, тем не менее, эта способность дрожжей изучена значительно хуже. Так, из 58 различных штаммов, исследованных Ониши и Сузуки, лишь 22 продуцировали ксилит с экономическими коэффициентами 0,1 г/г потребленной D-ксилозы. Лучшими экономическими выходами пятиатомного спирта, по их мнению, характеризуются Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida polymorpha (Onishi and Suzuki, 1966). Среди различных представителей Candida sp. Гонг с соавторами выделили дрожжи Candida parapsilosis и Candida tropicalis, образующие 0,55-0,65 г ксилита на г потребленной D-ксилозы (Gong et al, 1983). Барбоса с соавторами оценили продукцию ксилита у 44 штаммов дрожжей, относящихся к родам Candida, Hansenula и Kluyveromyces (Barbosa et al., 1988). Согласно их данным, наибольший выход этого спирта (0,75 г/г потребленной D-ксилозы) отмечали у Candida guilliermondii. Лучшими продуцентами ксилита в настоящее время признаны дрожжи Debaryomyces hansenii, Pichia guilliermondii, Candida parapsilosis и Candida intermediae (Таблица 1.5). Таким образом, в результате целенаправленных поисков нами были выявлены ксилозоассимилирующие дрожжи, исследование которых представляло интерес для разработки научных основ биоконверсии промышленных источников D-ксилозы: кислотных гидролизатов лигноцеллюлозы и сульфитных щелоков.
Оценка продукции ксилита и этанола из D-ксилозы
Морфологические изоляты дрожжей P. tannophilus обнаружили склонность к диссоциации (Таблица 5.3). Треть колоний В-типа уже на восьмые сутки имела признаки типа А. Из 146 колоний А-изолятов лишь у двух обнаружили новые морфологические признаки. Кроме того, после длительного (более 20-и суток) инкубирования был выявлен третий, смешанный тип колоний (С): на блестящей поверхности колоний А-типа при микроскопировании легко выделялись радиальные матовые секторы, представленные клетками типа В. Их появление косвенно указывало на возможную гаплоидность клеток А-изолятов P. tannophilus. Некоторые из них вступали в коньюгацию на среде №2 (Таблица 2.3). Часть коньюгантных клеток формировала аски, тогда как другая - давала начало вегетативной диплоидной культуре, представленной колониями В-типа.
Вероятность этого события была незначительной: лишь 2 из 146 клонов в рассеве изолята А приобрели свойства другого типа. Формирование таких клонов могло быть следствием копуляции и вегетативного размножения коньюгантных клеток на ранних этапах роста колонии. Тогда появление секторного клона С – результат протекания указанных процессов на более поздних этапах роста колонии. Скорее всего, причиной значительного числа колоний А–типа в рассевах изолятов типа В являлась споруляция диплоидных клеток и прорастание аскоспор, впоследствии формирующих гаплоидные клоны.
Для подтверждения нашей гипотезы оценили споровое потомство коньюгированных (тип А) и неконьюгированных (тип В) асков (Таблица 5.3). Установили, что практически все клоны, прораставшие из аскоспор изолятов А-типа, относились к этому же типу (за исключением четырех колоний В-типа и шести секторных колоний С-типа). Большинство спор изолятов В-типа давало начало колониям другого типа (А). Учитывая это, можно заключить, что появление С колоний в споровых рассевах изолятов типа В являлось следствием изменения плоидности клеток P. tannophilus.
Сопоставление наших результатов с опубликованными ранее материалами (James and Zahab, 1982) привело к выводу: клетки А-типа находятся в гаплофазе, а В-типа, соответственно, – в диплофазе жизненного цикла. По классификации Крегер-Ван Рея (Kreger-Van Rij, 1984) жизненный цикл P. tannophilus является дипло-гаплонтным с преобладанием гаплофазы, он схематично представлен на рисунке 5.1. В процессе роста гаплоидной (тип А) культуры на плотной среде ее клетки начинают копулировать. Некоторые из них переходят в следующую фазу жизненного цикла – образуют коньюгированные аски и споры, дающие начало гаплоидной вегетативной культуре. Другие коньюгантные клетки продолжают вегетативный рост, делятся и формируют диплоидную культуру (тип В). Включаясь в половой процесс, диплоидные клетки становится источниками неконьюгированных асков и спор, прорастание которых заканчивается появлением вегетативной гаплоидной культуры. Такая схема хорошо объяснила диссоциацию морфологических изолятов, однако до конца не раскрыла причины коньюгации гаплоидных клеток, формирования аскофоров и вегетативного размножения диплоидов. Чтобы разрешить эти вопросы, изучили условия дифференциации и стабилизации фаз жизненного цикла дрожжей P. tannophilus.
Для проведения экспериментов на основе штамма P. tannophilus Y-1532/В2 (Раздел 4.7) выделили изогенные гаплоид и диплоид. Гаплоидный штамм P. tannophilus 22-Y-1532/В2 получили стандартным способом, элиминируя вегетативные клетки в спорулирующей культуре диэтиловым эфиром (Захаров и др., 1984). Его плоидность была подтверждена морфологическими признаками: белые блестящие выпуклые колонии состояли из мелких клеток, формировавших только коньюгированные аски и споры (Рисунок 5.1). После длительного 1,5-го месячного культивирования гаплоидного штамма P. tannophilus 22-Y-1532/В2 (Среда №2, таблица 2.3) на поверхности одной из колоний выявили матовый сектор. Он состоял из более крупных клеток, образующих лишь неконьюгированные аскофоры и аски. Учитывая особенности жизненного цикла P. tannophilus (Рисунок 5.1), данный сектор охарактеризовали как диплоидный штамм, изогенный гаплоиду и обозначили
Для выявления причин диссоциации коллекционных штаммов P. tannophilus исследовали динамику жизненного цикла изогенных галоида P. tannophilus 22-Y-1532/В2 и диплоида P. tannophilus 1Д-22–У-1532/В2 на плотных средах различного состава №2, №4-10 и №14, рекомендованных Инге-Вечтомовым (Инге-Вечтомов, 1963), Джеймсом и Захабом (James and Zahab, 1983), Крегер-Ван Реем (Kreger-Van Rij, 1984), Захаровым и соавторами (Захаров и др., 1984), Бороховой (Борохова, 1994), а также модифицированных нами в соавторстве с Михайловой Н.П., Бодуновой Е.Н. и Шабалиной М.В. питательных средах № 15-26 (Таблица 2.3). В ходе эксперимента подбирали условия, стабилизирующие вегетативный рост и активирующие половой процесс штаммов P. tannophilus различной плоидности. Кроме того, наше внимание привлекала длительность каждой стадии жизненного цикла. Полученные результаты отражает рисунок 5.2 и таблица 5.4.
Гаплоидный штамм. Установили, что концентрация источника углерода оказывала наибольшее влияние на смену фаз жизненного цикла P. tannophilus 22-Y-1532/B2. Так, 100,0 г/л D-глюкоза обеспечивала вегетативное размножение этого штамма (без коньюгации клеток) в течение двух недель и длительное (до месяца) хранение. При концентрациях углерода от 36,5 г/л и менее, начиная с 3-их суток культивирования, появлялись коньюгантные клетки, вступавшие затем в копуляцию. Их доля в популяции P. tannophilus 22-Y-1532/B2 неуклонно увеличивалась. Таким образом, наблюдали индукцию полового процесса гаплоидной культуры (Рисунок 5.2,А). Его активность зависела от ряда дополнительных факторов. Использование в качестве источников углерода смеси пятиатомных и шестиатомных сахаров (Среда №16), а также «чистой» D-ксилозы (Среда №4) задерживало коньюгацию и копуляцию гаплоидных клеток. Снижение концентрации углерода в среде 4,0 г/л (среды№5 и 22) ингибировало не только половое, но и вегетативное размножение гаплоидной культуры P. tannophilus.
Рост периодической культуры C. shehatae и P. tannophilus в ксилозосодержащих субстратах различного состава
Традиционные методы утилизации вторичных непищевых источников растительной биомассы основаны на сбраживании фракции гексоз: D-глюкозы, D-маннозы и D-галактозы производственными расами дрожжей S. сerevisiae (Сапотницкий, 1965). Их технологические параметры неприменимы для ферментации D-ксилозы. (Холькин, 1989). Известно, что кислород является главным фактором, регулирующим направленность катаболизма этого пятиатомного сахара. Тем не менее, режим аэрации, оптимальный для спиртовой ферментации ксилозосодержащих субстратов, гексозо-пентозных смесей в присутствии ингибиторов, до сих пор не определен. Кроме того, из-за тесной взаимосвязи катаболизма D-ксилозы с реакциями пути Варбурга-Дикенса-Хорекера и цикла Кребса, рост ксилозоассимилирующих штаммов преобладает над спиртообразующей активностью даже при недостатке кислорода в среде (Vandeska et al, 1995; Granstrm and Leisola, 2002; Chmielewska and Dzluba, 2003). Однако факторы, способные увеличить селективность образования этанола дрожжами P. tannophilus, не были идентифицированы. Для формулирования научных основ комплексной микробиологической утилизации отходов растительной биомассы такие аспекты имели принципиальную значимость. Поэтому изучили условия, благоприятствующие спиртообразованию периодической культуры P. tannophilus Y-1532/В2 на ксилозосодержащих субстратах различного состава.
Скорость растворения кислорода в ферментационной среде часто оценивают сульфитным методом (OTR, мМоль/лхч), его несомненным достоинством является возможность установить интенсивность принудительной аэрации, необходимую для максимального выхода целевого продукта (Slininger et al, 1989; Sampaio et al, 2004). В эксперименте варьировали степень заполнения колб и ферментера питательной средой №3 (Таблица 2.3), а также число оборотов круговой термостатированной качалки (мешалки ферментера). Условия принудительной аэрации, соответствующие значениям OTR от 2,0 до 140,0 мМоль/лхч, иллюстрирует таблица 7.1. В качестве положительного контроля использовали аэробные, не лимитирующие рост ксилозоассимилирующих дрожжей условия (Перт, 1978), а в качестве отрицательного контроля анаэробные условия без принудительной аэрации (Раздел 2.3.1). Субстратное ингибирование предотвращали добавлением в ферментационную среду низких концентраций биомассы P. tannophilus Y-1532/В2 (Перт, 1978), которую выращивали при оптимальной температуре и рН (Огородникова и др., 1995).
Согласно экспериментальным данным, в течение 96 час анаэробной ферментации культура P. tannophilus Y-1532/В2 использовала лишь незначительную часть D-ксилозы. Увеличение OTR до 2,0 мМоль/лхч уже активировало данный процесс, хотя скорость потребления D-ксилозы оставалась низкой. Интенсивная аэрация (140 мМоль/лхч) существенно улучшила кинетику потребления D-ксилозы исследуемыми дрожжами, сократив длительность периода ферментации (Таблица 7.2).
Для оценки изменения концентрации растворенного в среде кислорода (р02) использовали рекомендации, подробно изложенные в разделе 2.8.3. Значение рОг быстро достигало нуля при OTR 8,0-36,0 мМоль/лхч, указывая на кислородное голодание дрожжевой культуры (Рисунок 7.1,А1 и A2). Интенсивная аэрация (OTR=140 мМоль/лхч) обеспечивала 90%-ное насыщение среды кислородом к моменту окончания ферментации (Рисунок 7.1,В), что активировало рост P. tannophilus Y-1532/В2.
Образование этанола и ксилита при низких значениях OTR имело сходные тенденции. Длительность экспоненциальной фазы роста дрожжей составляла 1/2-2/3 общего времени. В данный период культура P. tannophilus утилизировала до 40% D-ксилозы. Концентрация пятиатомного спирта ксилита монотонно возрастала с первых часов ферментации, достигая наибольшей величины к моменту исчерпания 60% D-ксилозы. Содержание этанола в культуральной жидкости заметно увеличивалось после 20-ти часового
Режимы принудительной аэрации (OTR, мМоль/л х ч), использованные для ферментации D-ксилозы OTR, мМоль/лхч Коэффициент заполнения колбы Скорость вращения качалки (мешалки ферментера), об/мин