Содержание к диссертации
Введение 7
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Адгезия холерных вибрионов 17
Адгезины холерных вибрионов 19
Факторы, влияющие на адгезивную активность
холерных вибрионов 25
1.1.3. Модели изучения адгезии in vivo и in vitro 26
1.2. Лектины микроорганизмов 27
Общие сведения о лектинах 28
Распространение и биологическое значение лектинов 29
Состав и структура лектиновых рецепторов 30
Углеводная специфичность лектиновых рецепторов
и методы их выявления 32
Лектины холерных вибрионов 34
Некоторые механизмы образования биопленки
холерными вибрионами 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы, используемые в работе 39
Питательные среды 40
Коммерческие препараты углеводов 40
Эритроциты млекопитающих 40
Методы 41
2.5.1. Методы изучения лектиновых рецепторов
холерных вибрионов 42
2.5.1.1. Метод изучения адгезии холерных вибрионов
на эритроцитах in vitro 42
2.5.1.2. Метод изучения гемагглютинации холерных
вибрионов с эритроцитами и ингибирование
сахарами реакции гемагглютинации 43
Метод изучения образования биопленок холерными вибрионами на жидких питательных средах и рецепторов, участвующих в этом процессе 44
Метод определения гемолитической активности
холерных вибрионов на эритроцитах человека 45
Фотографирование микробиологических мазков 45
Статистическая обработка результатов 45
Глава 3 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АДГЕЗИВНОЙ
АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП НА ШИРОКОМ СПЕКТРЕ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
3.1. Адгезивный потенциал токсигенных (негемолитических) и
атоксигенных (гемолитических) V. cholerae eltor
на модели эритроцитов человека и животных (in vitro) 47
3.1.1. Характеристика адгезивных свойств токсигенных
штаммов вибрионов эльтор (ctx^cp4!^") in vitro 47
3.1.2. Характеристика адгезивности гемолитических штаммов
эльтор (ctx"tcp"Hly+) in vitro 51
3.1.3. Характеристика гемолитических вибрионов эльтор, имеющих ген
токсинкоррегулируемых пилей адгезии (ctx^cp^ly"1")
по адгезивным свойствам in vitro 54
Характеристика токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) вибрионов «Бенгал» на модели эритроцитов человека и животных 57
Особенности адгезивного потенциала
V. cholerae cholerae in vitro 60
3.4. Изучение возможности использования эритроцитов человека
для постановки пробы Грейга 61
3.5. Экспресс - метод определения эпидемической значимости
холерных вибрионов на основании комплекса показателей:
адгезии и гемолиза в мазке на эритроцитах II группы
крови человека 63
Глава 4 СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЛЕКТИНОЫХ РЕЦЕПТОРОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗНЫХ БИОВАРОВ И СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП
4.1. Изучение способности холерных вибрионов к гемагглютинации
эритроцитов человека и животных (I, II, III и IV групп крови человека,
нативных и формалинизированных эритроцитов барана,
эритроцитов кролика) 69
Особенности гемагглютинации эритроцитов человека и животных токсигенными (негемолитическими) и атоксигенными (гемолитическими) вибрионами эльтор 70
Гемагглютинирующая активность V. cholerae О]39 72
Особенности реакции гемагглютинации
вибрионов классического биовара 74
4.2. Определение углеводной специфичности
лектиновых рецепторов холерных вибрионов различных
биоваров и серологических групп 77
4.2.1. Изучение спектра лектиновых рецепторов
токсигенных негемолитических (ctx^cp^Hly") и атоксигенных
гемолитических (ctx"tcp"Hly+) V. cholerae eltor 78
Особенности специфичности лектиновых рецепторов атоксигенных вибрионов эльтор, имеющих ген токсин-коррегулируемых пил ей адгезии tcp (ctx'tcp^ly*) 81
Изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов токсигенных и атоксигенных
V. cholerae 0139 83
Спектр лектиновых рецепторов вибрионов классического биовара 86
Возможности фенотипической идентификация гемолитических холерных вибрионов эльтор имеющих и не имеющих tcpA ген
на основании определения углеводной специфичности некоторых
лектиновых рецепторов 89
Глава 5 НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ IN VITRO.
Изучение закономерностей образования биопленок холерными вибрионами на поверхности жидких питательных сред 95
Изучение спектра лектинов и соответствующих им углеводов, участвующих в образовании биопленки холерными вибрионами
эльтор в сравнении с механизмами адгезии 100
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ!
.107 .115 117 140
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПА - средний показатель адгезии
НЭБ - нативные эритроциты барана
ФЭБ - формалинизированные эритроциты барана
ЭК - эритроциты кролика
ЭЧ - эритроциты человека
ctx - ген холерного токсина
ЫуА - ген, отвечающий за продукцию гемолизина
tcpA - ген токсин-коррегулируемых пилей адгезии
Да - Дальтон
Msh - ген маннозачувствительного гемагглютинина
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
В последнее время большое внимание уделяется изучению лектиновых свойств различных биологических объектов, из которых патогенные микроорганизмы представляют наибольшую актуальность.
Лектины - это протеины или гликопротеины, содержащие как минимум два или четыре активных центра, обладающих способностью связывать углеводы, не изменяя их структуры, которые обеспечивают возможность агглютинировать клетки и преципитировать гликоконъюгаты, взаимодействуя с углеводами, особенно с групповыми детерминантами крови (Boyd W., 1970). Однако микроорганизмы, обладая лектинами (адгезинами, агглютининами), могут участвовать и в таких взаимодействиях in vitro, как гемагглютинация, преципитация, цитотоксичность (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994), гемолиз (Телесманич Н.Р., 2003). Можно предположить важную роль лектинов и лектиновых рецепторов в персистенции холерных вибрионов и вибрионо-сительстве, явлениях бактериоциногении, в прикреплении к зоо- и фитопланктону, в формировании биопленок.
Безусловно, адгезия является начальным и необходимым элементом патогенеза, а структуры, обусловливающие адгезивность возбудителя к клеткам хозяина, признаны определяющими факторами патогенности, так как специфическая адгезия является пусковым механизмом для каскада патологических реакций (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994; Тихомирова Е.И., 2003). В 80-90 годы исследованиям адгезии холерных вибрионов был посвящен ряд работ (Смоликова Л.М., 1989; Урбанович Л.Я., 1984; Андрусенко И.Т., 1991). На наличие адгезивных свойств исследовались клеточные стенки (Оленечева Л.С., 1984, 1985), пили, компоненты слизи, жгутиков (Уралева B.C., 1983). Некоторые из них были выделены и охарактеризованы (Король В.В., 1992; Ларионова Л.В., 1992). Относительно лектиновых рецепторов холерных виб-
рионов и их участия в различных процессах в литературе имеются отрывочные сведения. Предполагается, что лектины кишечной группы микроорганизмов взаимодействуют с гликокаликсом щёточной каймы энтероцитов кишечника и вызывают его повреждение. Это приводит к нарушению функции всасывания слизистой кишечника, повышает ее проницаемость для бактериальных токсинов. Они же усиливают катаболизм белков в тканях и приводят к нарушению азотистого баланса. Лектины устойчивы к протеолизу в желудочно-кишечном тракте (Brady Р., 1978; Liener I., 1976).
Известно, что холерный токсин является типичным лектином, углево-дсвязывающая (лектиновая) активность которого сосредоточена в В субъединице (Yangulu N.K., 1996) и специфична ганглиозиду (GM1) (Ouchterlonie О., 1980).
Имеются сведения о том, что маннозочувствительный лектин Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae 0139 способствует адгезии к зоопланктону, образуя на своей поверхности маннозочувствительные пили. Их синтез кодируется кластером генов msh. Экспрессия маннозочувствительного гемагглю-тинина и не выявленных факторов адгезии различается в зависимости от се-рогруппы и биотипа V. cholerae (Chivelli D.A., 2001). Предполагается, что маннозочувствительный лектин V cholerae принимает участие в формировании биопленок, которые в последнее время привлекают внимание исследователей в связи с их возможной ролью в экологии холерных вибрионов - в сохранении вирулентных клонов в межэпидемический период, формировании новых патогенных клонов в результате передачи генетической информации.
Установлено, что атоксигенные гемолитические V. cholerae eltor используют связанный с клеткой рецептор, специфичный N-ацетил-Д-глюкозамину гемагглютинин (лектин), как для формирования биологической пленки на поверхности раздела фаз жидкой питательной среды и воздуха, так и для специфической адгезии к клеткам макроорганизма. Следует отметить, что полимер N-ацетил-Д-глюкозамина — хитин, входящий в состав экзоскеле-
та ракообразных и зоопланктона, является питательной средой, которую многие виды Vibrio используют как источник углерода и азота (Sasmal D., 2002).
В последнее время установлено, что ген ЫуА, отвечающий за продукцию гемолизина, кодирует синтез рициноподобного галактозоспецифичного лек-тина, принимающего участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика, а также в гемагглютинирующей способности атоксигенных и токсигенных штаммов холерных вибрионов (Телесманич Н.Р., 2003).
Генетическим маркером эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов являются гены ctx АВ, кодирующие продукцию холерного токсина - одного из основных факторов вирулентности, который по своим свойствам и строению является типичным лектином (Ouchterlony О., 1980; Holmgren J., 1978). Вместе с тем токсигенные штаммы без токсин-корегулируемых пил ей адгезии (TCP) не способны колонизировать слизистую кишечника и вызывать инфекционный процесс. Поэтому ген tcpA, контролирующий биосинтез TCP, признан наряду с ctx АВ ключевым генетическим фактором, определяющим эпидемический потенциал вибрионов (Tracksis М., 1998). Однако фенотипическому проявлению гена tcpA, изучению уровня адгезии штаммов и углеводной специфичности их лектиновых рецепторов, а также участию углеводных рецепторов мембраны-мишени в различных процессах взаимодействия не уделяется должного внимания. Вместе с тем известно, что фила-ментозные придатки бактерий фимбрии или пили (Brinton С, 1959) представляют собой надмолекулярные сложноорганизованные структуры, являющиеся поливалентным лектином. Поливалентность лектина достигается за счет их углеводсвязывающих доменов.
Таким образом, понимание молекулярных основ адгезии холерных вибрионов, которая имеет место в различных межклеточных взаимодействиях, требует знаний о поверхностных структурах патогена, ответственных за этот процесс. Однако бактериальные клетки имеют на своей поверхности целый спектр рецепторов, узнающих углеводы и определяющих специфичность
межклеточных взаимодействий. Спектр этих рецепторов различается у разных видов бактерий и является определяющим в проявлениях патогенности и в механизмах адаптации к условиям окружающей среды. Поэтому изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов микроорганизмов является чрезвычайно важным для разработки подходов к дифференциальной диагностике и познания механизмов патогенности и персистенции.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель: определение спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Задачи исследования:
Для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов оценить возможность использования эритроцитов четырех групп крови человека и эритроцитов животных in vitro.
Оптимизировать методические подходы in vitro для определения адгезивной и агглютинирующей способности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов на эритроцитах четырех групп крови человека, нативных и формалинизированных эритроцитах барана и кролика.
3. Выяснить возможность использования эритроцитов человека для
постановки пробы Грейга.
Отработать в условиях in vitro методы ингибирования сахарами процессов адгезии и гемагглютинации.
Определить спектр углеводов, специфически связывающихся с лекти-новыми рецепторами, локализованными на поверхности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов.
Оценить роль лектиновых рецепторов в адгезивной и гемагглютини-рующей активности холерных вибрионов.
Отработать условия для изучения специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, участвующих в образовании биопленки in vitro.
8. Провести сравнительный анализ специфичности лектиновых рецепторов, участвующих в образовании биопленок холерными вибрионами в эксперименте, в сравнении с механизмами адгезии холерных вибрионов in vitro.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые адгезивная и гемагглютинирующая способности холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп были изучены на широком спектре нативных и формалинизированных эритроцитов млекопитающих in vitro.
Впервые установлено, что адгезивная активность холерных вибрионов коррелирует с гемагглютинирующеи активностью на эритроцитах II группы крови человека.
Впервые предложен экспресс-тест для оценки эпидемической значимости холерных вибрионов in vitro на основании комплекса показателей: адгезии, гемагглютинации и гемолиза на эритроцитах II группы крови человека.
Впервые показана возможность использования эритроцитов II группы крови человека для постановки пробы Грейга.
Впервые выявлены внутривидовые различия между возбудителями холеры 01 и 0139 серогрупп по углеводной специфичности лектиновых рецепторов.
Впервые показан доминирующий спектр углеводной специфичности рецепторов адгезии холерных вибрионов и установлены отличия токсигенных (негемолитических) штаммов от атоксигенных (гемолитических) по специфичности лектиновых рецепторов.
Впервые изучены лектиновые рецепторы, участвующие в адгезии и гемагглютинации, и показана гетерогенность популяции гемолитических холерных вибрионов эльтор, имеющих ген tcpA.
Впервые предложен способ фенотипической дифференциации гемолитических вибрионов эльтор, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности некоторых лектиновых рецепторов.
Впервые отработаны условия для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов, необходимых для образования биопленок холерными вибрионами эльтор in vitro.
Впервые проведен сравнительный анализ специфичности лектиновых рецепторов, участвующих в механизмах адгезии и в формировании биопленки в эксперименте.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов на эритроцитах человека является удобной моделью для исследования рецепторов клеточной мембраны не только холерных вибрионов, но и других микроорганизмов.
Знание углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов на поверхности цитомембраны полезно для выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах, а также разработки новых подходов к дифференциальной диагностике.
Изучение ингибирующего действия углеводов на адгезию и агглютинацию эритроцитов холерными вибрионами in vitro, дает возможность определить наличие или отсутствие лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры, а ингибирование способности вибрионов к пленкообразованию на поверхности жидких питательных сред важно для понимания механизмов выживания вибрионов в окружающей среде.
Характеристика спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов расширила наши представления о биологии и фенотипе возбудителя холеры и может быть использована для дальнейшего углубленного изучения роли лектинов в патогенезе холеры и способности возбудителя образовывать микробиологические сообщества в условиях окружающей среды.
Данные по адгезивности и лектиновому составу токсигенных и атокси-генных холерных вибрионов, имеющих и не имеющих ген tcpA, 01 и 0139 серогрупп могут быть использованы для дальнейшего научного исследования, и в результате привести к совершенствованию подходов диагностики и лечения холеры.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Данные оценки адгезивной активности холерных вибрионов in vitro по среднему показателю адгезии на стекле и гемагглютинирующеи активности позволили предложить новый тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) штаммов холерных вибрионов.
Отличия лектинового состава вибрионов классического биовара от вибрионов эльтор и «Бенгал», а также токсигенных штаммов от атоксигенных, имеющих и не имеющих ген tcpA, дает возможность на основании экспресс-метода определения фенотипических свойств возбудителя установить принадлежность выделенной культуры не только к биовару и серологической группе, но и ориентировочно прогнозировать эпидемическую значимость выделяемых культур.
Предложена модификация пробы Грейга с возможностью ее использования для постановки теста с эритроцитами II группы крови человека, взамен эритроцитов барана.
Получен патент «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№2288274 РФ от 27.11.06).
Получен патент на изобретение «Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae 0139 по их адгезивной способности» (№2332460 РФ от 27.08.08).
Разработаны Методические рекомендации по постановке экспресс-теста для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов
на основании комплекса показателей: адгезии, гемолиза, гемагглютинации на эритроцитах II группы крови человека in vitro и Методические рекомендации по фенотипической идентификации гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности лектиновых рецепторов.
Предложенный экспресс-тест для определения эпидемической значимости выделяемых штаммов холерных вибрионов внедрен в практику в ФГУЗ Иркутском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Роспот-ребнадзора и ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотреб-надзора. Этот метод также используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского противочумного института — головного по проблеме холеры в стране, ведущего постоянный мониторинг за свойствами свежевыделенных штаммов холерных вибрионов.
Метод фенотипической идентификации гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности лектиновых рецепторов внедрен в практику в ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотребнадзора и используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора при мониторинге свежевыделенных культур.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Эритроциты II группы крови человека могут быть использованы в качестве модели для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов в тесте адгезии, гемагглютинации и применены в пробе Грей-га, взамен эритроцитов барана.
Токсигенные Vibrio cholerae eltor и V. cholerae 0139 имеют рецепторы, специфичные гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе).
Гемолитические атоксигенные штаммы V. cholerae eltor и V. cholerae 0139, наряду с рецепторами, специфичными гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе), обладают лектинами, специфичными аминоса-
харам (Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину), которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.
4. Vibrio cholerae eltor, Vibrio cholerae 0139 не имеют рецептора, специфичного арабинозе. Холерные вибрионы классического биовара отличаются наличием рецептора арабинозы, наряду с гексозами, при отсутствии амино-сахаров.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации были представлены на проблемных комиссиях Научного совета по Санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); научной конференции, посвящен-ной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 2005 г.); VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).
Диссертация выполнена в рамках трех научных тем ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора: «Основы гемолитической активности холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 01.20.03 115443); «Лектиновые рецепторы холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 0120.0 507858); «Липазная и адгезивная активность холерных вибрионов не Ol серогруппы» (№ гос. регистрации 01.2.007 07281).
ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
По теме диссертационного исследования опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 148 страницах, содержит введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, заключение и выводы, иллюстрирована 26 таблицами и 10 рисунками. Библиография представлена 131 отечественными и 57 зарубежными источниками.