Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Азотфиксирующие ризобактерии рода Azospirillum 10
1.1.1 Физиолого-морфологические особенности азоспирилл 12
1.1.2 Практическая значимость использования бактерий рода Azospirillum 14
1.1.3 Характеристика этапов, ассоциативного взаимодействия 16
1.2 Структура и функции липополисахаридов грамотрицательных бактерий 22
1.2.1 Строение клеточной оболочки бактерий 22
1.2.2 Структурные особенности липополисахаридов 24
1.2.3 Роль липополисахаридов в реализации растительно-микробных взаимодействий 29
1.3 Методы исследования липополисахаридов 31
1.3.1 Выделение и очистка липополисахаридов 31
1.3.2 Разделение липидного и углеводного компонентов липополиса-харида .33
1.3.3 Изучение строения О-специфических полисахаридов 35
1.3.3.1 Химические методы исследования 35
1.3.3.2 Структурный анализ полисахаридов методом ЯМР -спектроскопии 37
1.4 Липополисахариды и О-спецйфические полисахариды азоспирилл 40
2 Материалы и методы 42
2.1 Микробиологические культуры и условия их выращивания 42
2.2 Характеристика растительного объекта 43
2.3 Приборы и материалы 44
2.4 Методы исследования : 46
2.4.1 Исследование адсорбции бактерий на корнях растений 46
2.4.2 Хроматографические методы 46
2.4.2.1 Гель-фильтрация 47
2.4.2.2 Ионообменная хроматография 48
2.4.2.3 Распределительная хроматография на бумаге 48
2.4.2.4 Газо-жидкостная хроматография 49
2.4.3 Колориметрическое определение 50
2.4.4 ЯМР - спектроскопия 50
2.4.5 Встречная двойная иммунодиффузия 51
2.4.6 Электрофорез в полиакриламидном геле 52
2.4.7 Дот-анализ ЛПС и О-ПС с использованием АЗП, меченого коллоидным золотом 52
2.4.8 Исследование изменений морфологии корневых волосков 52
2.5 Экстракция и анализ липополисахаридов Azospirillum brasilense 53
2.6 Выделение и характеристика О-ПС азоспирилл 55
2.6.1 Получение О-ПС кислотным гидролизом ЛПС 55
2.6.2 Получение полисахаридов с поверхности бактериальных клеток 55
2.6.3 Распад по Смиту 56
2.6.4 Анализ полисахарида методом метилирования 56
3 Результаты исследований и их обсуждение 57
3.1 Исследование адсорбционной способности Azospirillum brasilense Sp245 57
и КМ252
3.1.1 Изучение гидрофобности бактериальной поверхности 61
3.2 Сравнительная характеристика ЛПС Azospirillum brasilense 63
3.2.1 Выделение и очистка ЛПС 63
3.2.2 Хроматографический и электрофоретический анализ ЛПС 63
3.2.3 Изменения химического состава ЛПС у омегон-Km мутантов Azospirillum brasilense 71
3.3 Изучение сродства ЛПС Azospirillum brasilense к лектину пшеницы 74
3.4 Влияние ЛПС Azospirillum brasilense Sp245 и его омегон-Km мутантов на морфологию корневых волосков проростков пшеницы 80
3.5 Определение первичной структуры повторяющегося звена О-ПС A. brasilense Sp245, КМ018 и КМ252 83
3.6 Определение структуры повторяющегося звена О-ПС A. irakense КВС1 96
Заключение 102
Выводы 106
Список использованной литературы
- Азотфиксирующие ризобактерии рода Azospirillum
- Роль липополисахаридов в реализации растительно-микробных взаимодействий
- Микробиологические культуры и условия их выращивания
- Изучение гидрофобности бактериальной поверхности
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Активные исследования диазотрофных микроорганизмов Azospirillum spp. были начаты в рамках прикладного направления микробиологии, посвященного поиску и использованию биологических агентов, способных положительно влиять на урожайность растений (Лукин с соавт., 1987). Азоспириллы относятся к группе ризобак-терий, стимулирующих рост растений благодаря потенциально высокой азотфикси-рующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Okon and Vanderleyden, 1997).
Одной из ключевых задач в решении комплекса проблем, связанных с использованием азотфиксации для повышения производительности сельскохозяйственно-значимых растений, остается выявление молекулярных основ контактных взаимодействий ассоциативных бактерий с растениями. При изучении механизма, определяющего такие взаимодействия, особое внимание привлекают данные, касающиеся структуры и функций компонентов клеточной поверхности растений и микроорганизмов, которым отводится существенная роль в формировании ассоциаций.
Исследования экстраклеточных полисахаридсодержащих биополимеров бактерий рода Azospirillum ведутся достаточно активно (Del Gallo et al, 1989; Michiels et al, 1990; Konnova et al, 1994). Предполагают, что в адсорбции микроорганизмов на корнях растений принимают участие как белковые, так и полисахаридные компоненты бактериальной поверхности (Croes et al, 1993; Michiels et al, 1991; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Было показано, что различные изменения поверхности азоспи-рилл, в частности, связанные с возрастом культуры, а также удаление капсульных материалов, сказываются на способности микроорганизмов прикрепляться к корням пшеницы (Егоренкова с соавт., 2000).
Морфологические изменения в растительной корневой системе при контакте с бактериями являются одним из признаков, характеризующим начальный этап бактериальной инфекции. Они могут реализоваться посредством различных поверхностных соединений бактериальных клеток или веществ, экскретируемых бактериями в окружающую среду. Способность азоспирилл индуцировать различные деформации корневых волосков пшеницы (Jain and Patriquin, 1985) связывают с активной продукцией фитогормонов (Dobbelaere et ah, 1999) и пектолитических ферментов (Tien et ah, 1981). Также выявлено, что полисахаридсодержащие внеклеточные комплексы азоспирилл способны вызывать аналогичные изменения корневых волосков пшеницы (Коннова с соавт., 1995, 1999).
Липополисахариды (ЛПС) играют важную роль в реализации симбиотических и патогенных взаимоотношений бактерий с растениями (Leroug and Vanderleyden, 2001; Newman et ah, 2001). Данные об участии ЛПС в растительно-микробных ассоциациях, представленные в литературе, остаются достаточно разрозненными и противоречивыми (Жемеричкин с соавт., 1989; Matora et ah, 1995). Основная часть исследований ЛПС азоспирилл ведется преимущественно иммунохимическими методами (Matora et ah, 2001; Матора, Щеголев, 2002).
Трудность исследований функций ЛПС обусловлена сложностью химической структуры данных биополимеров и достаточно тонкой природой их воздействия на растения. Знание детального строения ЛПС, обуславливающего его свойства, делает возможным понимание индукции и развития биологического действия ЛПС и его функционирования на молекулярном уровне. Структура повторяющегося звена О-специфического полисахарида (О-ПС) определена только для одного штамма азоспирилл, принадлежащего к виду A. lipoferum (Choma et ah, 1992). Таким образом, выделение и изучение индивидуальных препаратов бактериальных О-антигенов Azospiril-lum spp. является актуальным, как для таксономических исследований, так и для выяснения их роли в процессах взаимодействия с корнями растений.
Цель и задачи исследования.
Основной целью настоящей работы было выявление участия липополисахари-дов азоспирилл в процессах взаимодействия с корнями пшеницы и характеристика особенностей структуры О-специфических полисахаридов внешней мембраны бактерий.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: Отработать методы выделения ЛПС из внешней мембраны бактерий A. brasilense и A. irakense, получить очищенные препараты ЛПС и провести анализ их химического состава.
Исследовать активность ЛПС A. brasilense в отношении морфологии корневых во лосков проростков пшеницы.
Провести сравнительное исследование способности к адсорбции на корнях проро стков пшеницы бактерий A. brasilense Sp245 и КМ252 - омегон-Km мутанта этого штамма, дефектного по ЛПС.
Провести сравнительное исследование первичной структуры повторяющихся звеньев О-ПС бактерий Л. brasilense Sp245, КМ018, КМ252.
Выполнить анализ структуры повторяющегося звена О-ПС, полученных традиционным методом и методом прямой экстракции из бактериальной мембраны A. irakense КВС\.
Научная новизна работы.
Продемонстрировано участие ЛПС в процессе колонизации азоспириллами корней пшеницы при исследовании адсорбционной способности бактерий штамма А. brasilense Sp245 и его омегон-Km мутантов, дефектных по структуре ЛПС. Впервые показана активность ЛПС азоспирилл в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы.
Впервые в ходе данной работы было установлено строение повторяющихся звеньев О-полисахаридов A. irakense КВС1 и A. brasilense Sp245. Показано, что О-специфические полисахариды бактерий A. brasilense Sp245, КМ018, КМ252 характеризуются регулярностью строения и имеют идентичную первичную структуру повторяющихся пентасахаридных звеньев и являются гомополимерами D-рамнозы (Rha).
Научно-практическая значимость.
Исследование ЛПС бактерий Azospirillum spp. вносит существенный вклад в понимание процессов формирования растительно-микробных ассоциаций. Полученные нами приоритетные данные о первичной структуре О-полисахаридов A. brasilense и A. irakense могут быть использованы для внутривидовой классификации в качестве хемотипических признаков, а также при установлении филогенетического родства с другими бактериальными таксонами.
Адаптированная для азоспирилл методика выделения О-ПС с поверхности целых клеток позволяет оптимизировать процесс получения бактериальных О-ПС вследствие снижения его трудоемкости и продолжительности.
Были разработаны «Методические рекомендации по выделению гомогенных
8 препаратов липополисахаридов из наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов», рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым Советом биологического факультета СГУ (протокол № 4 от 21 декабря 2000). Кроме того, разработаны методические рекомендации «Получение бескапсульных клеток азоспирилл», которые были одобрены Ученым Советом ИБФРМ РАН и утверждены директором института (протокол № 2 от 23 января 2002).
Полученные нами препараты ЛПС и О-ПС A. brasilense применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории физической химии клеточных структур, лаборатории микробиологии и микологии, лаборатории биохимии, лаборатории биохимии растительно-бактериальных симбиозов и лаборатории структурных методов исследований ИБФРМ РАН.
Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического и химического факультетов Саратовского государственного университета.
Апробация работы.
Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 9-м Международном конгрессе по растительно-микробным взаимодействиям (Амстердам, Голландия, 1999 г.), на 6-ом съезде общества физиологов растений России (Москва, Россия, 1999 г.), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, Россия, 2000 г.), на 4-й Европейской конференции по азотфик-сации (Севилья, Испания, 2000 г.), на 13-й Интернациональной конференции по азот-фиксации (Гамильтон, Канада, 2001 г.), на молодежной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2002 г.), на 2-й германско-польско-российской конференции «Бактериальные полисахариды» (Москва, Россия, 2002 г.). Доклад «Влияние изменений структуры ЛПС Azospirillum brasilense на биологическую активность в растительно-микробных взаимодействиях», представленный на 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, Россия, 2002 г.), был удостоен диплома первой степени.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН 17 декабря 2002 года.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 15 работ в зарубежных и отечественных научных изданиях.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Изменение структуры липополисахаридов у мутантных штаммов азоспирилл приводит к снижению биологической активности бактерий в отношении корней проростков пшеницы.
Липополисахариды Azospirillum spp. способны вызывать изменения морфологии корневых волосков проростков пшеницы.
О-специфический полисахарид Azospirillum brasilense Sp245 является линейным D-рамнаном с пентасахаридным повторяющимся звеном.
О-специфический полисахарид A. irakense КВС1 является регулярным гетеро-полимером с разветвленным гексасахаридным повторяющимся звеном, состоящим из остатков рамнозы, галактозы и маннозы.
Адаптированный для азоспирилл метод прямой экстракции О-специфических полисахаридов является более эффективным, благодаря снижению трудоемкости процесса выделения и увеличению выхода полисахарида.
Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой НИР "Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов" (№ гос. per. 01890057691, научный руководитель - засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.). Отдельные этапы работы выполнялись в соответствии с планами НИР проектов РФФИ «Липополисахариды и О-специфические полисахариды бактерий Azospirillum brasilense Sp245: их структура и активность во взаимодействии с корнями пшеницы» (№ 01-04-49237, руководитель -д.б.н. проф. Игнатов В.В.), «Структура липополисахаридов и О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum » (№ 02-04-48224, руководитель - д.б.н. проф. Игнатов В.В.).
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 230 источников, в том числе - 189 зарубежных. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 6 таблиц.
Азотфиксирующие ризобактерии рода Azospirillum
Биологическая фиксация азота - один из важнейших процессов, протекающих в природной среде. Это преобладающий путь утилизации атмосферного азота для последующего преобразования в различные азотсодержащие соединения, такие как нитриты, нитраты, аммоний, а в дальнейшем глутамин и др. (Мишустин, Шильникова, 1968; Онофраш с соавт., 1992). Очень актуальными являются исследования, связанные с использованием этого феномена для повышения урожайности сельскохозяйственных культур, особенно злаков.
В настоящее время несимбиотические бактерии, фиксирующие молекулярный азот и колонизирующие злаковые растения, разделяют на три группы: свободноживущие ризосферные организмы, факультативные и облигатные эндофиты (Baldani et ah, 1997). В первую категорию включают все виды, обладающие способностью колонизировать поверхность корня, такие как Azotobacter paspali, Beijerinkia spp. Факультативными эндофитами называют те азотфиксирующие микроорганизмы, которые могут заселять поверхность и внутренние ткани корней. Эта группа образована, главным образом, видами рода Azospirillum, исключая А. halopr deferens. К облигатным эндофитам относятся бактерии, выделенные относительно недавно из внутренних тканей подземных и наземных органов растений: Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirilhim spp, Azoarcus spp.
Термин "эндофиты" стал применяться несколько лет тому назад по отношению к микрорганизмам (бактериям и грибам), колонизирующим внутренние ткани корня, которые существуют, частично или полностью, за счет внутренних ресурсов организма-хозяина, не вызывая при этом каких-либо симптомов патогенеза (комменсализм). Позднее это понятие было расширено для бактерий и грибов, поселяющихся внутри растений и приносящих им пользу (мутуализм) (Kloepper and Beauchamp, 1992). Благодаря упомянутой выше способности отдельных бактерий-диазотрофов, сохраняющих низкую жизнеспособность в почве, заселять корневую систему злаковых растений и фиксировать азот в ассоциации с этими растениями, термин "эндофиты" был интродуцирован к данной группе микроорганизмов (Dobereiner, 1992а; 19926). Деление микроорганизмов-эндофитов на факультативные и облигатные формы вызвано характерными особенностями метаболизма, позволяющими одним видам сохранять жизнеспособность в почве, а другим -выживать только внутри растения.
Большинство исследований почвенных азотфиксирующих микроорганизмов, способных вступать в ассоциативные взаимоотношения с различными растениями, сконцентрировано на бактериях рода Azospirillum, что отражено в обзорных статьях (Лукин с соавт., 1987; Michiels et ah, 1989; Bashan and Holgium, 1997; Волкогон, 2000; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Во многом это обусловлено тем, что они относятся к рост-стимулирующим ризобактериям, увеличивающим продуктивность и устойчивость различных растений к неблагоприятным факторам среды (Okon and Vanderleyden, 1997).
Первое упоминание об азоспириллах появилось в 1925 г. в работе Бейеринка, посвященной микробиологическому исследованию почв Нидерландов, обедненных азотом (Bejerinck, 1925). Выделенные им бактерии Бейеринк описал как Spirillum lipoferum. Через сорок лет в 1963 г. они были переоткрыты Беккингом (Becking, 1963). Проведение детальных физиолого-биохимических и генетических исследований позволило отнести эти организмы к новому роду -Azospirillum (Tarrand et al., 1978), относящемуся к семейству Spirillaceae.
Пристальное внимание исследователей во всем мире было обращено на бактерии рода Azospirillum в 70-х гг. прошлого столетия. В этот период было обнаружено массовое развитие этих микроорганизмов в прикорневой зоне тропических трав. Азоспириллы выделялись среди многообразия ризосферных микробов потенциально высокой азотфиксирующей активностью, проявляемой ими как в чистой культуре, так и в ассоциации с корнями растений (Dobereiner and Day, 1976).
Азоспириллы - грамотрицательные несимбиотические диазотрофы, принадлежащие к альфа-субклассу протеобактерий. До недавнего времени внутри рода Azospirillum выделяли шесть видов (Martin-Didonet et al., 2000). Наиболее исследованы A. brasilense и A. lipoferum, первые из описанных видов данного рода бактерий (Tarrand et al., 1978). Позднее были выделены и охарактеризованы А. amasonense (Magalhaes et al., 1983), A. halopraeferens (Reinhold et al., 1987), A. irakense (Khammas et al., 1989) и A. largimobile (Sly and Stackebrandt, 1999). По последним литературным данным, к этому роду отнесен еще один вид - A. doebereinerae (Eckert etal, 2001).
Azospirillum spp. широко распространены в почвах различных климатических зон. Они вступают во взаимоотношения с корнями кормовых трав, злаков и других небобовых растений (Bashan and Holgium, 1997). Наиболее часто азоспирилл колонизируют поверхность корней растений. Главным образом, это касается зон элонгации и дифференциации корня. Значительно реже удавалось выявить бактерии в местах появления боковых корней (Tien et al., 1979), где азоспириллы формировали агрегаты на поверхности корня, либо встречались в виде одиночных клеток.
Роль липополисахаридов в реализации растительно-микробных взаимодействий
Изучение механизмов действия ЛПС на растения проводится уже около 30-ти лет, но данные представленные в литературе, остаются достаточно разрозненными и противоречивыми (Newman et al, 2001).
ЛПС, формируя внешний слой клеточной поверхности грамотрицательных бактерий, составляют основу для защиты клетки от неблагоприятного воздействия экстраклеточного окружения, а в случае симбиотических микроорганизмов, они играют важную роль во взаимодействии с эукариотическими клетками хозяина (Rietschel et al., 1994).
Наиболее результативным способом изучения функций отдельных структур бактериальной поверхности является использование мутантов, дефектных по синтезу интересующего компонента. Мутанты с нарушенной структурой ЛПС были получены для различных патогенных (Garcia-del Portillo et al, 1997; Newman et al, 2000), симбиотических (Noel et al., 1986) и ассоциативных (Katzy et al, 1998) бактерий, вступающих в соответствующие взаимоотношения с растениями.
Роль ЛПС в фитопатогенезе несколько отличается от таковой в бактериальном патогенезе человека и животных. В последние годы были получены данные, которые подтвердили предположение об участии реакций врожденного иммунитета растений в ответ на воздействие патогенных бактерий или их ЛПС (Medzitov and Janeway, 2000). Изменения в структуре ЛПС у фитопатогенных микроорганизмов приводило к снижению вирулентности у мутантных штаммов, а очищенные препараты ЛПС оказывали определенные эффекты на растения, приводящие к значительному снижению гиперчувствительного ответа к последующей инокуляции авирулентными штаммами (Newman et al., 2000). Хотя проникновение ЛПС в организм растения-хозяина не вызывало проявления макроскопических симптомов, характерные изменения в экспрессии растительного генома могли быть обнаружены (Hammod-Kosack and Jones, 1997).
Для проявления фитопатогенеза наличие О-антигена у бактерий не являлось существенным, в то время как, при утрате внешней части кора они теряли устойчивость к воздействию различных физико-химических факторов и демонстрировали значительное снижение патогенности (Graham et al., 1977).
Основным отличием симбиотических отношений микроорганизмов с растениями, среди которых наиболее охарактеризована система Rhizobiam - бобовые, является способность микробов нейтрализовать реакции защитной системы макросимбионта, либо не вызывать их совсем при взаимодействии (Lerouge and Vanderleyden, 2001). Специфичные компоненты клеточной стенки ризобий, включая ЛПС, принимают непосредственное участие в формировании эффективного симбиоза: в инфицировании корневых волосков, процессах нодуляции и физиологической адаптации бактерий (Noel et al., 1986). Имеются данные, что мутанты R. leguminosarum и R. meliloti с нарушенным синтезом ЛПС вызывали формирование дефектных клубеньков у на корнях растений-хозяев (Brink et al., 1990; Putnoky et al, 1990).
Считается признанным мнение о том, что ризобиальные ЛПС участвуют в самых ранних этапах распознавания микросимбионтом растения-хозяина, включая адсорбцию на корнях (Dazzo and Brill, 1979). Лектин-полисахаридные взаимодействия играют важную роль в прикреплении бактерий к растению. Было показано, что ЛПС R. leguminosarum trifolii связывает трифолин А - лектин, локализованный на кончиках корневых волосков белого клевера. Это специфичное взаимодействие индуцирует быстрые изменения в активности цитоскелета корневых волосков, а также содержании некоторых протеинов, объединяемых в группу «инфектины» (Dazzo et al., 1991). Возможно, специфичность ЛПС к растительным лектинам опосредована уникальной структурой бактериальных макромолекул (Noel et al., 2000).
Необходимо отметить, что для начала инфекционного процесса в бобово-ризобиальном симбиозе наличие О-ПС в молекуле ЛПС является критическим. Было показано, что при действии на растения ЛПС мутантных штаммов R. leguminosarum,
утратившими О-антиген, происходило недоразвитие инфекционных нитей, либо образование быстро стареющих бактероидов, не способных фиксировать азот (Lerouge and Vanderleyden, 2001). Напротив, клетки мутанта Sinorhizobium meliloti, дефектые по ЛПС, формировали эффективные азотфиксирующие нодули на корневой системе Medicago sativa (Clover et al., 1989). Однако детальный анализ ЛПС этого штамма продемонстрировал присутствие в молекуле О-цепей, хотя и в модифицированной форме (Lagares et al., 1992).
В свое время для выделения ЛПС были предложены различные способы их экстракции из клеток грамотрицательных бактерий, среди которых можно отметить такие как, например, экстракция водой, водными растворами диэтиленгликоля, формамида, цетавлона, мочевины (Lindberg and Holme, 1972), диметилсульфоксида (ДМСО) (Adams, 1967) и фенола (Morgan and Partridge, 1941; Westphal et al, 1952).
Выбор метода выделения ЛПС из бактериальных клеток определяется исходным материалом и поставленной целью (компонентом ЛПС, которому будет посвящено дальнейшее исследование). Так, экстракция водным фенолом по методу Вестфаля (Westphal and Jann, 1965) в основном используется при работе с S-штаммами и приводит к выделению препаратов ЛПС с максимальным содержанием молекул с длинными О-антигенными цепями. Для изучения липида А и кора рекомендуются более мягкий способ экстракции, например, с применением ЭДТА (Borneleit et al., 1989). Он используется при слабом связывании ЛПС с внешней мембраной и дает препараты, в которых полнее представлены молекулы с короткими полисахаридными цепями. При экстракции ЛПС из R-штаммов наилучшие результаты дает метод Галаноса (экстракция смесью фенол-хлороформ-петролейный эфир) (Galanos and Liideritz, 1975).
В состав экстракта ЛПС могут входить в качестве примесей другие высокомолекулярные компоненты бактерий, такие как белки, нуклеиновые кислоты (НК) и гликаны. При использовании целых клеток количество примесей обычно весьма значительно, но оно может быть снижено путем экстракции отделенных клеточных оболочек. Существуют различные способы очистки препаратов ЛПС, такие как осаждение НК из экстракта цетавлоном (бромистым цетилтриметиламмонием) с последующим осаждением ЛПС (обычно 80%-ным этанолом) (Westphal and Jann, 1965). Применяется также осаждение НК при понижении рН до 2-2,5, достигаемом добавлением в экстракт трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (Arbatsky et al., 1997), и удаление примесей белков и НК обработкой специфическими ферментами (нуклеазами и протеазами) (Goldman and Leive, 1987). При работе с бактериями, для которых отмечают слабое удерживание ЛПС в наружной мембране клеток, например Pseudomonas syringae, возможна экстракция ЛПС 0,85 % раствором NaCl (Здоровенко с соавт., 1987).
Микробиологические культуры и условия их выращивания
Объектом наших исследований служили бактерии A. brasilense Sp245, КМ018, КМ252 и A. irakense КВС1. A. brasilense Sp245, выделенные из поверхностно стерилизованных корней пшеницы (Baldani et al., 1983), были любезно предоставлены доктором Доберейнер (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, Rio de Janeiro, Бразилия). Канамицин-устойчивые мутанты этого штамма КМ252 и КМ018 с инсерцией омегон-Км в плазмиде 120-мДа были получены в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН Е.И. Кацы (Katzy et al., 1998). A. irakense КВС1 был выделен из прикорневой зоны риса в субтропическом поясе Ирака (Khammas et al, 1989). Фосфатный буфер Солевая основа
Для препаративных целей исследуемые микроорганизмы выращивали на ферментере АНКУМ 2М (СССР) на жидкой синтетической среде, представляющей собой модификацию среды, предложенной Дэй и Доберейнер (Day and Dobereiner, 1976), Пиридоксаль 0,2.
В среду вносили также раствор хелата железа из расчета 10 мл на литр среды. Хелат железа приготовляли в следующей пропорции, г/л: FeS04 2,0; НТК 5,6.
Среду стерилизовали в течение 30 мин при 121 С. Культивирование проводили в термостатируемых условиях при 30 С. Перемешивание вели со скоростью 200-250 об/мин. Интенсивность аэрации отвечала 60 % от насыщения среды кислородом. Микроорганизмы культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста. Осаждение бактериальных клеток осуществляли центрифугированием в течение 60 мин при 3000 об/мин.
Культуры используемых штаммов сохраняли на полужидкой синтетической среде, содержащей 15 % глицерина при -70 С. Культура поддерживалась на твердой синтетической среде того же состава с добавлением 2 % агар-агара на чашках Петри при 4 С.
Контроль чистоты культуры посевного материала осуществлялся методом раздавленной капли (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983) на микроскопе "Биолар" при увеличении около х 500. После каждого выращивания культуру подвергали иммунохимическому анализу (см. 2.4.5).
Исходным биологическим материалом для всех экспериментов, связанных с корнями проростков пшеницы, являлись зерновки мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum сорта Саратовская 29. В работе были использованы зерновки репродукции 1996 г., полученные нами из ВНИИСХ Юго-Востока (г. Саратов). Они хранились в бумажных пакетах при комнатной температуре.
Для проведения экспериментов семена пшеницы Саратовская 29 сортировали, отбирая целые, однородные по размеру, а затем подвергали поверхностной стерилизации. Для этого зерновки помещали в коническую колбу, промывали дистиллированной водой и заливали на 30 сек этиловым спиртом. Спирт сливали, семена погру жали в раствор диацида (1:1000) (Большой практикум по физиологии растений, 1978), выдерживали 5 мин. После чего зерновки многократно отмывали стерилизованной дистиллированной водой и замачивали для набухания в течение 60-90 мин.
Подготовленные таким образом пшеничные семена раскладывали в стерильные чашки Петри с мясопептонным агаром и оставляли в темноте на 32 ч при 25 С. Суточные проростки оценивали визуально, выбирая из них не имеющие внешних признаков бактериального или грибкового поражения. Отобранные проростки переносили на чашки Петри со стерильной водой и помещали в неосвещенный термостат при 25 С на 16 ч. Среди двухсуточных проростков отбирали те, у которых длина главного корня достигала 10-15 мм.
Препаративное выращивание культур бактерий A. brasilense проводили на жидких питательных средах и ферментере Анкум 2М (СССР) с рабочей емкостью 10 л. Часть экспериментов по наращиванию биомассы осуществляли в литровых колбах Эрленмейера, помещаемых на вибростенд с круговым колебанием. Аэрация при этом не регулировалась и осуществлялась самопроизвольно.
Для отделения бактерий от культуральной жидкости, разделения слоев несме-шивающихся жидкостей и компонентов смеси, операциях, требующих отделения осадков, применяли центрифуги К-24 (MLV, ГДР), К-23 (MLV, ГДР), К-80 (MLV, ГДР), Т-62 (MLV, ГДР), Beckman L5-65 (Beckman, USA), Force 16 (Force, USA).
Растворы концентрировали на ротационном испарителе ИР-1М2 (СССР) при пониженном давлении, создаваемом водоструйным насосом, в температурном интервале 20-40 С.
Изучение гидрофобности бактериальной поверхности
Известно, что в прикреплении бактерий к корням растений помимо специфических взаимодействий, которые на разных стадиях адсорбции опосредуются поверхностно локализованными белками или полисахаридами (Michiels et al., 1991), также принимают участие неспецифические механизмы, связанные с зарядом и гидрофоб-ностью поверхности бактериальных клеток.
Показатель гидрофобности бактериальной поверхности, отражающий соотношение гидрофобных и гидрофильных компонентов в составе внешней части клеточной стенки, является, наряду с зарядом, фундаментальной физико-химической характеристической величиной, которая сравнительно мало изучена, в отличие от всесторонне исследованных электрофизических свойств микробных клеток. Необходимо отметить, что данный показатель является устойчивой характеристикой микробиологической культуры и может оказывать существенное влияние на взаимодействие микроорганизмов с объектами окружающей среды (Никовская с соавт., 1985).
В связи с этим мы сравнили относительную гидрофобность бактериальной поверхности A. brasilense Sp245 и его омегон-Кт мутантов КМ018 и КМ252. Проведенные эксперименты позволили выявить существенную редукцию гидрофобности у клеток мутантных штаммов азоспирилл, причем для КМ018 она была выражена в большей степени. Особенно наглядно об этом свидетельствуют данные, полученные при применении метода солевой агрегации (табл. 3).
Индекс гидрофобности бактериальной поверхности клеток A. brasilense КМ252 был в 1,2, а для штамма КМ018 в 1,5 раза выше, чем у бактерий штамма Sp245. Столь существенное снижение гидрофобности поверхности клеток Azospirilhim не могло не сказаться на адсорбции микроорганизмов на корнях. По данным некоторых исследователей гидрофобность поверхности азоспирилл положительно коррелирует с увеличением концентрации поверхностных белков и адгезивностью микроорганизмов (Du-frene and Rouxhet, 1996). Таким образом, мы не можем трактовать снижение активности прикрепления мутантного штамма азоспирилл только как результат изменений, произошедших в составе ЛПС.
Поэтому для более корректного анализа биологической активности ЛПС в отношении растения-хозяина нам был необходим биотест, позволяющий оценить непосредственное влияние ЛПС на макроорганизм. Мы остановили свой выбор на, так называемой, слайдовой методике Фареуса (Fahraeus, 1957), при которой очищенные препараты исследуемого соединения, воздействуя на растение, в зависимости от сво ей активности, могут в той или иной степени вызывать изменения морфологии корневых волосков. Было показано, что выделяемые с поверхности A. brasilense посредством смыва экзополисахаридные комплексы при воздействии на корни пшеницы вызывали морфологические изменения корневых волосков (Коннова с соавт., 1995). Данных о подобной активности ЛПС азоспирилл в отношении корневой системы пшеницы в литературе нами обнаружено не было. Для проведения этой серии экспериментов нам было необходимо провести выделение, очистку и анализ ЛПС.
Мы уже отмечали, что ЛПС представляют собой уникальные для грамотрица-тельных бактерий биополимеры, являющиеся конструктивными элементами клеточной оболочки, чем и обусловлено пристальное внимание, и постоянный интерес исследователей, проявляемые к ним. Они определяют иммуногенные свойства грамот-рицательных бактерий, поэтому их часто называют соматическими антигенами (Jann and Westphal, 1975). Эти макромолекулы играют ведущую роль в инфекционном процессе, поэтому их изучение может расширить наши представления о механизмах взаимоотношений растение-микроорганизм. Мы предприняли исследование ЛПС А. brasilense Sp245, КМ018 и КМ252 для детального анализа изменений данных компонентов внешней мембраны у мутантных штаммов.
Известно, что факторы среды и продолжительность роста микроорганизмов оказывают влияние на состав полисахаридсодержащих биополимеров поверхности бактерий вообще и ЛПС в частности (Бахолдина с соавт., 2001). Изменения рН и состава среды культивирования, а также объема инокулята при выращивании на жидких средах влияет на содержание полярных заместителей вплоть до их полной потери (Bhagaya Lakshmi et ah, 1989). Для A. brasilense Sp245 было установлено, что добавление в среду культивирования бактерий трис(гидроксиметил)аминометана приводило к изменению антигенных свойств ЛПС (Бурыгин с соавт., 2002).
