Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практическое значение Кудрякова, Татьяна Александровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Большой фактический материал, накопленный в последние три десятилетия, свидетельствует о широком >аспространении патогенных для человека вибрионов. Наиболее зна-іимьши в патологии человека являются холерные и парагемолитичес-сие вибрионы. На фоне седьмой пандемии холеры ежегодно во всех :транах мира, особенно в Юзном, Юго-Восточном и Юго-Западном резонах с жарким и умеренным климатом регистрируются спорадичес-ше или групповые заболевания, обусловленные холерными вибриона-ш не 01 группы и парагемолитическики вибрионами. Исходя из это-'о. актуальна разработка дополнительных методов диагностики этих їаболеваний, в том числе основанных на применении фагов (Адаїюв LK. и соавт.. 1971, 1974; Быстрый Н.Ф. и соавт., 1971,. 1974. [981. 1984; Дрожевкина М.С. и соавт., 1970. 1973, 1974. 1979, 980. 1984; Остроумова Н.М. и соавт.. 1971, 1972. 1978, 1980, :983, 1985. 1986, 1988. 1993; Сомова А.Г. и соавт., 1968, 1974; Sukerjee S. etal.. 1957. 1959, 1960-1962, 1984).

Особого внимания заслуживают умеренные фаги- холерных вибри- . >нов, продуцентами которых являются лизогенные штаммы, выделяете от больных людей и объектов внешней среды. Установлено, что гвление лизогении тесно связано с вирулентностью холерных вибри-)нов. Лизогенные свойства сделали бактериальные клетки чрезвы-іайно удобным тест-объектом для решения многих актуальных задач іиологии и медицины (Bhaskaran К. .1959: Groman И., Eaton М., 955; Ogima К. et al., 1973; Strockblne N.. et al.. 1986).

Генетические исследования, имеющие фундаментальное значене, были выполнены благодаря использованию системы фаг-бакте->ия. Например, определение локализации генов и создание генети-іеских карт микроорганизмов, а такге других общих и частных воп-IOCOB генетики (Гончарова Н.С. и соавт., 1972; Gerdes J., Roraig 1.. 1975; Jacob F., Monod J., 1961; Ohashi M. et al., 1981; Ta-ilguchi H. et al., 1984; Weston L. et al., 1973).

Однако до настоящего времени не выяснены все механизмы ин-имного взаимоотношения умеренного холерного фага и клетки-хазяїна. В дальнейшей разработке нуадаются вопросы, связанные с вы-

делением новых видоспецифическия фагов. Кало изучен вопрос і использовании фагов как показателей контаминации водоешв сточных вод патагеннши для человека вибрионами. В литерату имеются сведения о роли фагов в изменчивости вибрионов (Гончар ва Н.С. и соавт., 1988; Ершзнко Г.А. и соавт.. 1988; Царе С.А., Остроумова И.М., 1978; Ogg J. etal.,1981; ТІшга Т. і чаї.„1980). Однако недостаточно изучены шюгиа вопросы лязогек зации и транедукфш. Нам не удалось обнарутать работы, посвяца ные лизогении Л-фзри колерных вибрионов (Лаюз D.lt и соавт 1977; Прозоровский СВ. к соавт.. 1976). Сохраняет актуальное проблема использования специфических фагов для диффараяцнац разнообразной группы холерных вибрионов не 03 (Агапова 3. IL соавт., 1982; Голковсккй Г.LL и соавт., 1984; Зиника 0. С. и о авт.. 1988; Остроумова H.IL и соавт., 1980. 1933. 1985. 193 Хгйтозич А.Б., Голкозский Г. П., 1924). В связи с зтку кзобходк дальнейшее изучение кх лизогеннах систем и свойств продуцируем фагов. Учитывая эпидемическую опасность холерних вибр.ззюз ном 0139 серогрупги (Rasasutrthy Т. et al.. 1993; Shlnada Т. et al, 1993), обнаружение сп2ці;$:!ческойч5їтгаі в виде іизогенности і фагу определенного серологического варианта ваза для разрабоп іетодоз их фагодиагностики.

В ряде работ представлену свєдзиіія о фотах V. albansii Вместе с тем необходима разработка индикаторной систем и ізи доз Бэделекля агов с последусрйі шучении бг:ологическ! свойств (Адаьэв А.К. и соавт.. 1974; Воронежская Л.Г. г; езопт. 1884; ГальцеваГ.В. к соавт., 1834. 1995; Ерізльєза 3. В., 192І Либшзон А.Е., ГальцеваГ.В.. 1835; Хайтсзич А.Б. и соавт. 1982).

ПзрспектнЕш&1 направление!! в идентнфжации napare-зллтичеі ких вибрионов, типичных прздетазителай рода Vibrio (Лнбинзг А.Е. и соавт.. 1974, 1977, 1994; Еккулоз В.А. и соавт.. 198! Addiss D. et al.,1939; FuJIno et al.. 1951). шляется разрабоп препарата днагкоспічзсїтго фага (Голковскнй Г. 11. и соавт. .19 Либинзон А.Е. и соавт., 1984, 1995; KalcanisM Н. et al.. 1986] До настоящего времени не предложена cxeija фаготипировгния V. р; rafiaesolyticus и V.alglnolyticus. так как отсутствуют типирущі фаги. Оуществукря при Центре патогенных вибрионов коллекці культур нуждается в дополнении соответствущиш фагами. Зто диг

.тует необходимость разработки усовершенствованных ыетодов их сохранения - криоконсервации и лиофилизации.

Изучение перечисленных вопросов позволит разработать новые и усоверЕенствовать суцестаушдае методы лабораторной диагностики холеры, острых килечных инфекции, обусловленных холерными вибрионами не 01 группы, светящимися и парагемолитическими вибрионами.

Цель и задачи исследования. Основной цельп исследования явилась характеристика лигогении холерных вибрионов 01 н не 01 групп, светящихся, парагеїюлнтических и алгинолитических вибрионов и усоверпенстЕование методов их фагодиагностаки.

Для достизения этой цели предстояло решить следуЕГ5!а задачи:

изучить распространение лизогении среди холерных вибрионов 01 и не 01 групп, светящихся, парагешлитическия и. алгинолитических вибрионов, выделенных в разные годы в насей стране и за рубеаои;

выделить вибриофаги и охарактеризовать их биологические свойства;

исследовать возмоаность профаготкпирования холерных, светящихся и парагемолитических вибрионов;

осуществить дифференциация vet* и vet" штампов холерных вибрионов по типу переносимых умеренных фагов;

выявить участие фагов в изменении биологических свойств вибрионов;

предложить систему тест-культур для идентификации холерных фагов, выделяемых из объектов внедаёй среды;

разработать способ дифференциация вирулентных и ааирулентных холерных вибрионов эльтор с использованиеы фаговых иетодов;

усоверзпенствовать фагсщиагностику V.cholerae поп 01 и V.alben-sis;

г сконструировать препараты фагов для идентификации и дифференциации парагемолитических вибрионов;

- разработать способ криоконсервироеания и усовершенствовать
способ лиофилизации фагов холерных вибрионов 01 и не 01 серо-

' групп.

- є -

Научная новизна.

і. Установлены особенности лизогении галерных вибрионов 01 и на 01 серогрупп. светящихся и галофильша вибрионов - V.paraaae-Eolyticus и V.alglnolytiais. .Выявлены умеренные фага со строгой антигенной специфичностью.

2. Показано, что вирулентдае ападешческие вгамш холерных вибрионов, выделенные в очагах холеры, продуцируют умеренные фа-гн второго серологического типа, третьего иммунотипа. Лнзоге-ния холерных вибрионов по фагаа XI н XII серотипов является маркером неэпидемических (vet"} итамйов.

8. Первые установлены VIII и XII имаунотипы холерных фатов, продуцируема усГ-втгашами холерных вибрионов альтер.

і. Показано приобретение признака гшгментообразовання и ауксот-рофности в результате лнзагенизацкн н возможность транедукци-окной передачи генов his н arg.

1. Впервые обнаружена лнзагения V. cholera 037, 039. 042 серогрупп я показано, что вибриона каждого из них обладают специфическим профагом. Предложена система тест-культур для определения серологической принадлежности микроорганизмов вида V. cholerae методом профаготипирования.

2. Впервые установлено, что холерные вибрионы новой эпидемически значимой 0139 серогруппы. продуцирует фаги, характерные дли эпидемических втаммов холерных вибрионов 01 серогруппы.

3. Создана система тест-культур, позволяющая идентифицировать обнаруживаемые во внеяней среде фаги как показатели загрязнения холерными вибрионами 0І серогруппы, с определением их эпидемической значимости.

4. Впервые обнаружена лнзагения V.albensis и разработан способ идентификации светящихся вибрионов по типу переносимых фагов к чувствительности к ним.

5. Сконструирован диагностический поливалентный фаг галофильных вибрионов и составлен набор фагов для титрования парагемоли-тических и алгкнолитических вибрионов.

10. Создана коллекция охарактеризованных фагов V. cholerae 01 и
не 01 групп, V.albensis. V.parahaeaolytlcus и V.alginolyti
cus, разработан способ криококсервкрования и усоверЕЗнствовги

' режим лиофилнзации.

Теоретическое и практическое значение работы.

1. С поїщьп лизогенных тест-систец подтверэдено. что холерные вибрионы 01, не 01 серогрупп и светящиеся вибрионы шгут быть вклзчены в один вид V.cholerae, а парагешлитические и алги-нолитические вибрионы в вид V. parahaesolytlcus.

2. Показано, что зпвдеїшческне атака холерных вибрганов лизо-генны по фагам второго серологического типа, III кимунотипа.

'Лизогения авирулентных отаняв эльтор вибрионов, выделенных из внешней среда, обусловлена разными типами прсфагов. Впервые установлены VIII и XII кяиунотЕПы фагов.

3. Предложены дкагностичеспсие зг?і для иденпфзсщии холерных
в'лбрксноз 037, 039, 012 серогрупп.

Л. Предложен дсполяїтелькгЗ '*2тод вдот^псгіпм Ч. аісшзіз по

кссгггальстзу Ссгоз и чувстпителыззспг к юм. 5. Ргзргботгна техкопоп-я пр'тотсэлзпл препарата гта для ш'Ь-

. ^ергицнацші vet* и vet" голеркых вябргг-ксэ элътср. '3. Л^ораторко-зксперіп^зггальк.'З csp;nt лтгппдаепкес-гго (tera га-

лс*:ц-=них ш:бр"скоз и типфу^яя псрзгєіялчт?!чесл.гх ?гсз ре-

ісс^нлогзни к прн'гнк-пп в престачеези лгбораторгкх, ппего- лп^нл пссхэдспснпл <:а с;:бргхзОлору.

7. Пргллсгеї'Пі пр:*!.-й получает пол слппкпзи С?гоз їгсїсєкеїз-ог:
птелгзз яблэрных зибрпсксэ. усотрггсюії плйпг^гсгцн:! лпгеггн-

. ,к*.~; атаїазв, а тгнгз Ег"пг:тч:!п &тоз, " rcrirrLtr^a с*„:$тий-' ігпсть гксперікеятальк'-пс ксслелсвзпД.

8. Рс:<сі*.2нло2гна схега прс^сгапхЕгрсзгнпя сссбуліггеля голвра н .других патогЕккнх представіггалзя вила У.сінзіегаа с спраделэ-ьтлвп серологической гліотдлгз-ззста пзрепста^х ігусгаір:*.;5чгс-іаи умеренных фзтоз.

9. Создгн кріесбаяя гюлэрнкя и парагеиолггпіческих #агоз длп сбес-печенія иаучко-пргхтїмєскнх исследований по проблзіз "Холера и патогенные вибрионы".

Дспсннрозаш в коллекции цузея ззшух культур шстгггута "ІЗзсроб" 29 пта^таз V. choleras н V. paraftaerslytlcus, характеристика которых приведена з диссертгфи. Получено 24 удостоверения на ргцкокаліізатарские предложения, кгегщ^єсл получения и прї^е-нения фатов. Результаты исследований, прадстазлекнка в диссертации использованы при составлении 10-ти ійгтоднчгских рекомендаций, утверздекных Ученьгл Совете*! Ростовсксго-на-Дсну противочуи-

ного института. Составлены три инструкции по изготовлению, контролю и применению: холерного фага для идентификации авирулентных штаммов, холерных вибрионов; диагностических парагешлитаческих фагоз для идентификации.и типирования V. parahemolyticus и V.al-ginolyticus (Утверждены Ученым Советом Ростовского-на-Дону противочумного института Пр. N17 от 30.32.92г. и Пр. N9 от 23.08.ь'5 г.).Фаги внедрены в Одесской , Крымской, Причерноморской ПЧС.

Способ лиофилизации холерных фагоз внедрен в Рос. НИПЧИ "Микроб" (акт о внедрении от 29.05.90 г.) ив Ростовском НИПЧИ (акт о внедрении от 11.03.91 г.).

Разработанные методы применяются при выполнении научно-исследовательских и производственных работ в Ростовском-на-Дону, Иркутском и Казахском противочумных институтах и в Крымской, Одесской, Причерноморской ПЧС.

Результаты исследований нашли отракение в 14 авторских свидетельствах на изобретения: №1578189 от 15.03.1990г.; №1533331 от 8.08.1989г.; №704180 от 21.03.1979г.; №940520 от 23.02.1982г.; №982345 от 16.08.1992г.; ' №1030410 от 22.03.1983.; №1296578 от 5.11.1986г.; №1623205 от 22.09.1990г.; №1387413 от 8.12.1987г.; №1391090 от 22.12.1987г.; №1405298 от 22.02.1988г; №1307848 от 3.01.1987г.; №1636446 от 2. И. 1990г.; №1778188 от 1.08.1992г.

Материалы по фаговш методам лабораторной диагностики заболеваний.' обусловленных V.cholerae 01 и не 01 групп, V. albensis, V. paraHaecolyticus и V. alginolyticus представлены на курсах специализации и усовершенствования врачей бактериологов по особо опасным инфекциям Ростовского НИПЧИ (1993 - 1995 гг.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Специфичность лизогенных систем V. cholerae 01 и не 01 групп, светящихся и парагемолитическж вибрионов по типу переносимого фага.

2. Лизогенность эпидемических вибрионов зльтор по фагам III иммунного типа II серологического типа и неэпидемических вибрионов по фагам XI серотипа XII иммунного типа, XII серотипа X иммунного типа. ;

3. Диагностическая система тест-культур, метод и схема ее применения для определения серологической принадлежности микроор-

ганизшв вида V.cliolerae по чувствительности системы тест-культур, к умеренных фагам.

4. Тест-система для идентификации V. albensis.

5. Диагностический поливалентный фаг для идентификации парагеш-литкческах и алгинолитических вибрионов.

в. Ткпнрущие фаги парагешлитических вибрионов и схема фаготи-пирования парагенолитических и алгинолитических вибрионов.

Апробация работа.

Материалы диссертации доложены и представлены на Международной симпозиуме по Enterbbacteriaceae. Чехословакия, г.Коаица, 1975 г.; VI съезде Всесоюзного микробиологического общества , Рига, 1980 г.; VI рабочем совещании по програмне "Плазмкда", Пущнно-на-Окэ. 1981 г.: Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии*, Краснодар, 1983 г.г Всесоюзном симпозиуме, посвященном 60-летию Тбилисского НИИВС, Тбилиси, 1984г,: Всесоюзной научной конференции по актуальным вопросам молекулярной биологии, генетики и иммунологии возбудителей особо опасных инфекций. Ростов-ва-Дсиу. 1984 г.; Всесоюзной конференции Вирусы микроорганизмов и растений", г. Таикент. 1986 г.: Областной конференции "Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города", Рос-гов-на-Дану, 1987 г.: Всесоюзном семинаре "Современные проблемы ан-габиотикорезнстентности", г.Москва, 1988 г.; Всесоюзной конференции 'Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры". Ростов-на-Лону, 1988 г.: Проблемной комиссии по «элекулярному зондированию "бактериальные плазмида*. г.Нальчик, 1990 г.; Нежгосударственноа совещании по проблеме "Холера", г.Кине-isb. 1991 г.; VI йезаднародкой конференции "Успехи современной кри-ібшшгии", Украина, г. Харьков, 1992г.; Всероссийской научной конференции по проблем "Холера", г. Ростоз-ка-^сну. ISSSr; на заседз-ом Российской Проблггэгой ккяссїйгіго прсблакэ "їолгрз" при голов-. юл по пробна Рсстовсмйзна-Дону кеучзю-ксспедозательскоа проти-ючуккоа гаягйяуте в 3S33 г.; на научных конференциях PodflSPSI "йас-!сб^й. Ростазсзсого-на-,Лону Протавочуїзкого института. Всесоюзного агробиологического общества, кезахзеударственной кзучю-праэтичес-лй контракции, псезячакой 100-леткэ открытая nyta, г. СтЕшрогкца, S94 г.; Всероссийской научно-практической конференція, шсвяцзнноГі опросам разработан ьжробдалогнчгския питательных сред н тест-сис-

теи. г. Махачкала, 1995 г.; Российской научда-практичажой конфер цни по проблене "Холера". г.Рссгов-на-йзну. 1895 г.

Представленные в днссертарга «атернаяз исслэдзззний являя результатом работы по 10-ти планові теваа, выполнявэшкя в рам плана №3> по проблеме "Холера" (1975-1995 гг.): Я гос.регкстраци 01.84.0004813:016839 01.90.0; 017043 01.87.0; 81042103; 01.8 017044 ; 74013892; 75025455 ; 79037000. 031329 01.89.0; 031 01.89.0.

Публикации. По теие диссертации опублйкозано 89 работ, в числе одна шнография (в соавторстве). 1.4 авторских свидетельств изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из вае ния. пяти глав, вклэчахцих данные литературы, описание материала методов, результаты собственных экспериментов и их обсувденйэ, такте общего заключения и выводов. Текст работы изложен на страницах машнописного текста, содершт 123 таблица и 23 рисуи Библиографический указатель состоит из 229 источников отечествен и 185 зарубенной литературы.