Введение к работе
Актуальность темы. Холера, 7-я пандемия которой продолжается более 35 лет, дала толчок к изучению биологических особенностей возбудителя, разработке, совершенствованию и внедрению методов лабораторной диагностики не только холеры, но и заболеваний, вызываемых другими видами вибрионов, поскольку эти исследования по рекомендации ВОЗ входят в глобальную программу борьбы с диареями (Хроника ВОЗ, 1978; D. Taylor, 1993). Пандемия прошла несколько периодов и распространялась в различных регионах в виде заносных вспышек и (или) формирования природных очагов (А.С. Марамович, М.И. Наркевич, 1993). В системе эпиднадзора за холерой значительная роль принадлежит лабораторной диагностике, поскольку только выделение и идентификация возбудителя дает возможность своевременно проводить противоэпидемические мероприятия, а изучение биологических свойств - использовать фенотипичес-кне и гснотипические признаки в качестве маркеров эпидемического процесса. Сложности лабораторной диагностики диарей, вызванных вибрионами, в значительной степени обусловлены сходством их биологических свойств, что нашло отражение в классификации и выделении семейства Vibrionaceae, включающего в настоящее время 34 вида (М. Veron, 1974; Р. Baumann el al., 1984; J.G. Holt et a!., 1994). Исследовались биологические свойства V. cholerae поп 01, V. albensis, V. parahemolyticus, V. alginolyti-cus, V. fluvialis, V. anguillarum, V. aesturianus и др. ( A.E. Либинзон, Г.В. Гальцсва, 1985; А.Б. Хайтович, 1986; Е.Б. Даиилкнна, 1995; Л.Г. Воронежская, 1995, A. Furniss ct.al., 1977; D. Brenner ct.al., 1978, 1986; F. Hickman et.al., 1982; С Tackct ct.al., 1982; D.Tison, R. Seidler, 1983; M. Schieweet.al., 1987 и др.). Среди различных видов рода Vibrio наиболее изучены холерные вибрионы 01 и паратемолитическис вибрионы. Однако, некоторые проблемы, касающиеся биологии возбудителей, их идентификации, требуют уточнения и углубленного изучения в соответствии с современным методическим уровнем естествознания.
Изменчивость биологических свойств V. cholerae 01 касается различных фспошлпчеекпх признаков, происходи г под влиянием разнообразных факторов внешней среды и затрагивает разные таксономические уровни. Более подробно описана изменчивость морфологических признаков (Е.И. Коробкова, 1959). Выявление других фспопшических признаков (биохимических, серологических, фагочувствитсльпостн и т.д.) в значительной степени затруднено, поскольку в ходе бактериологического исследования из выросших субкультур для дальнейшего изучения отбираются наиболее типичные (М.С. Дрожевкина, В.Н. Милютин, 1975).
Вирулентность, одно из важнейших биологических свойств V. cholerae 01, является стержневой проблемой в эпидемиологии холеры, поскольку
2 в зависимости от наличия или отсутствия у них vct-гена, осуществляется дифференцированный комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий. Использование молекулярно-биологических методов позволяет проводить детекцию участков ДНК, детерминирующих синтез холерного токсина, в штаммах V. cholerae 01 (Е.В. Четина и др., 1993). Генотипические признаки, в отличие от фенотипических, в меньшей степени подвержены влиянию условий внешней среды и поэтому более стабильны (И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, 1975). Применение метода молекулярного зондирования и ПЦР является способом реального выявления потенциальной способности V. cholerae Ol к токсинообразованию и выявлению некультивируемых форм возбудителя.
Антибиотикочувствительность холерных вибрионов 01 - важный маркер, позволяющий своевременно установить антибиотикорезистентность с целью выбора наиболее эффективных препаратов для лечения и профилактики вибриогенных диарей.
Фаготипирование холерных вибрионов 01 также имеет определенное эпидемиологическое значение. Однообразие фаговаров позволяет выявлять групповые заболевания, объединенные общим источником инфекции, пути распространения инфекции, выяснять возможности сохранения холерной инфекции в эндемических, очагах (Ю.М. Ломов и др., 1990).
Для идентификации холерных вибрионов перспективны фаговые методы, позволяющие определить вид, биовар, фаговар, серогруппу, серо-вар, вирулентность. Изучение биологических свойств парагемолитическнх вибрионов (Г;М. Шикалов, 1978; А.Б. Хайтович, 1986) показало, что для идентификации этих микробов перспективным направлением является использование диагностического фага. Однако недостаточный набор фагов затрудняет создание фаговых препаратов для выявления V. parahac-molyticus и V. alginolyticus (N. Nakanishi el al., 1966; Г.М. Голковскпй и др., 1984; T.A. Кудряковаи др., 1992).
Биологическая характеристика возбудителя холеры является основой для разработки новых и усовершенствования существующих методических и организационных подходов к лабораторной диагностике вибрионов разных видов.
Связь работы с научными программами, планами, темами. Выбранное направление исследований осуществлялось в соответствии с государственными темами по проблеме "Холера", тематикой отраслевых научно-исследовательских работ по микробиологии и диагностике патогенных вибрионов, а также с планом НИР кафедры микробиологии и ЦНИЛ Крымского медицинского института, регистрационный номер 01.91.0009707.
Цель и задачи исследования. Цель - характеристика биологических свойств вибрионов, в первую очередь, холерных 01 разного происхождения, выделенных в 7-ю пандемию в Украине, создание банка данных и
оценка их фенотипических и генотипических признаков, разработка новых и усовершенствование существующих методических и организационных подходов в диагностике заболеваний, вызванных вибрионами разных видов.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
анализ эколого-географического распространения холерных вибрионов 01, обнаруженных п 7-ю пандемию холеры в Украине от людей и из окружающей среды;
создание банка данных и разработка системы мониторинга биологической характеристики холерных вибрионов 01 (БХВ), циркулирующих в Украине по результатам определения признаков штаммов, выделенных из разных экосистем, в различные годы и в различных регионах;
установление диапазона изменчивости у холерных вибрионов 01 разного происхождения по основным феногипическим признакам, а также вирулентности, фаговаров, чувствительности к антибиотикам;
сравнительная оценка результатов изучения вирулентности методами in vitro;
создание препаратов из выделенных фагов для идентификации и фаго-тппирования галофильпых вибрионов на основе изучения их биологических свойств;
разработка новых методических подходов по созданию микрообъемных способов идентификации вибрионов;
оценка эпидемической значимости водоемов на основании изучения возможности циркуляции в них нскультивируемых форм холерных вибрионов 01;
разработка организационных принципов идентификации и проведение массовых исследований на холеру.
Научная новизна полученных результатов.
Впервые выявлены особенности биологических свойств V. cholerae 01, циркулирующих в Украине в 7-ю пандемию, по фенотипическим свойствам, вирулентности, антибиотикочувствительности, циркуляции различных фаговаров.
Впервые создан функционирующий компьютерный банк данных, обеспечивающий накопление, хранение, возможность анализа информации по 90 признакам, и на этой основе разработана система мониторинга биологической характеристики возбудителя на примере холерного вибриона 01.
Впервые приведена систематическая оценка динамики изменчивости биологических свойсів возбудителя, циркулирующего в Украине, и установлено, что подавляющее число фенотипических признаков изменчивы, особенно чувствительность к холерным фагам и способность агглютинироваться холерными сыворотками.
Впервые в Украине молекулярным зондированием в ПЦР проанали-
4 зирована вирулентность штаммов V. cholerae Ol, выделенных из разных источников; признак потенциальной эпидемиологической опасности использован для районирования территории; выявлены нскультивирусмые токсигенные формы в водных системах и оценена их эпидемическая значимость.
Показано, что наиболее достоверный метод in vitro определения ток-сигенных свойств у холерных вибрионов 01 - обнаружение, vet-гена, другие методы имеют ограничения в использовании.
Впервые выявлена динамика изменения чувствительности холерных вибрионов 01, выделенных от людей и из окружающей среды: повышение резистентности к некоторым антибиотикам (стрептомицину, левомицети-ну) и формирование полирезистентности у большинства циркулирующих в 90-е годы культур.
Впервые разработано устройство для идентификации микроорганизмов микрометодом, защищенное патентом на изобретение.
Впервые сформулированы организационные принципы проведения массовых исследований на холеру, получила дальнейшее развитие система идентификации возбудителя, обеспечивающая своевременную постановку бактериологического диагноза и определение важнейших биологических свойств V. cholerae 01.
Сконструирован диагностический поливалентный фаг и составлен набор фагов для типирования галофильных вибрионов.
Практическое значение полученных результатов.
-
Выявлена изменчивость биологических свойств холерных вибрионов Ol разного происхождения во времени, в разных экосистемах и различных регионах в 7-ю пандемию холеры в Украине. Установлена фе-нотипическая изменчивость холерных вибрионов 01 по способности агглютинироваться холерными видо- и типоспецифическими сыворотками, лизироваться холерными биовароспецифическими фагами, по биохимическим свойствам.
-
Обнаружена неоднородность популяции холерных вибрионов Ol по потенциальной способности продуцировать холерный токсин, а также временная, экосистемная и региональная зависимости в выявлении токсиген-ных штаммов, выделенных от людей и из окружающей среды, что позволяет использовать эти результаты для районирования территории по типам эпидемической опасности. Обнаружение в водоемах Украины некуль-тивируемых форм токсигенных холерных вибрионов 01 позволяет оцепить происхождение циркулирующих культур, эпидемическое значение водоемов и прогнозировать ситуацию.
-
Выявлена коррелятивная связь между наличием vet-гена, отсутствием гемолитической активности по Грейгу и способностью окисления ман-нита более чем через 5 часов. Последние два метода целесообразно испо-
5 льзовать в качестве ориентировочных, а применение комплексного метода определения вирулентности - только для культур, чувствительных к холерному фагу eltor.
-
Установлены временные, экосистемные и региональные особенности в антибиотикочувствительности V. cholerae Ol, проявляющиеся в увеличении резистентности, числа устойчивых культур и в формировании полирезистентности, что можно использовать для эпидемиологических и клинических целей.
-
Разработана система мониторинга за биологической характеристикой V. cholerae 01 для отслеживания и оценки динамических процессов в изменчивости фенотипических и генотипических свойств, для проведения адекватных и своевременных профилактических, противоэпидемических мероприятий, лечения выделителей, для прогнозирования эпидситуации. Показано, что в качестве маркеров эпидемического процесса могут использоваться биологические свойства возбудителя и некультивируемые формы.
-
Создана коллекция фагов галофильных вибрионов и отобраны штаммы для конструирования препаратов. Из семи фагов, переданных в коллекцию Ростовского НИПЧИ, №№ 227,507 и 536 депонированы соответственно под №№ ФК-47, ФК-48, ФК-49, а тест-штамм V. parahaemolyticus ІЗ - в музее Российского НИПЧИ "Микроб" № КМ-97 и в Ростовском НИПЧИ № Р-14706. Лабораторно-экспериментальные серии поливалентного диагностического фага и типирующие галофильных вибрионов использованы в лабораториях, проводящих исследования на эти микроорганизмы.
-
На основании патента № 2070932, выданного Роспатентом "Устройство для идентификации микроорганизмов", разработана система Micro Identification Vibrio, включающая микрообъемные тесты для биохимической идентификации патогенных вибрионов. Лабораторно-экспериментальные серии изготовлены по оригинальной технологии и использованы в практических лабораториях Украины. Для выделения патогенных вибрионов разработана унифицированная схема бактериологического исследования.
-
Разработаны система организационно-методических подходов к идентификации патогенных вибрионов по уровням лабораторий Украины и принципы проведения массовых исследований на холеру, обеспечивающие своевременную постановку бактериологического диагноза и определение важнейших биологических свойств возбудителя.
Внедрение результатов исследования:
"Методические рекомендации по выделению фагов парагемолити-ческих вибрионов", утвержденные Ростовским НИИПЧИ (1991);
"Ведомственная инструкция по микрообъемному методу серологического типирования холерных вибрионов не Ol", утвержденная МОЗ Украины (1991);
' ' " ..6 . . .
"Ведомственная инструкция по организации идентификации патогенных вибрионов и использованию микрометодов*', утвержденная МОЗ Украины (1992^
"Ведомственная инструкция по микрообъемной биохимической идентификации патогенных вибрионов", утвержденная МОЗ Украины (1992);
"Временные методические рекомендации по взятию материала от людей для исследования на холеру", утвержденные МЗ Крыма (1995);
"Методические рекомендации по созданию, ведению и пользованию компьютерными базами данных по характеристике возбудителей холеры Vibrio cholerae 01", утвержденные Начальником Крымской противочумной станции (1996).
"Інструкція по організації та проведенню протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери" (розділи: "Лабораторна діагностика" та "Організація лабораторних досліджень на холеру"), утвержденная МОЗ Украины (1997),
Результаты исследования представлены на семинарах, циклах подготовки для врачей-бактериологов и эпидемиологов, проводимых в областях Украины. ..,^,
По результатам изучения фенотипических свойств, вирулентности, ан-тибиотикочувствительиости, определения фаговаров у культур, прошедших идентификацию в Крымской ПЧС, составлены информационные письма "Характеристика холерных вибрионов 01, циркулирующих в Украине" в 1990, 1991,1992, 1993,1995 гг.", направленные в различные регионы.
Разработанные методические подходы по использованию биохимической идентификации и единой схемы лабораторной диагностики патогенных вибрионов позволяют качественно улучшить диагностику: стандартизировать, ускорить, увеличить достоверность, уменьшить материальные затраты. Предложенные методические и организационные приемы, новые диагностические препараты внедрены рядом лабораторий научно-исследовательских и учебных институтов, противочумных учреждений и санитарно-эпидемиологических станций.
Личный вклад соискателя.
Основной объем исследований был выполнен лично автором и заключался в исследованиях всех культур холерных вибрионов 01 (2429 штаммов), поступавших на Крымскую противочумную станцию, начиная с 1974 года, по комплексу биологических свойств; автором самостоятельно проведена разработка системы мониторинга биологической характеристики возбудителя холеры, создание компьютерной базы данных и анализ всего фактического материала, его статистическая обработка. Автором выделено 57 фагов галофильных вибрионов, у семи из которых совместно с другими специалистами подробно изучены свойства и сконструированы фаговые препараты для диагностики. Определение vet-гена у культивиру-
7 емых и некультивируемых холерних вибрионов проводили в последние годы самостоятельно. Автором разработаны и внедрены в практику методические и организационные подходы к проведению лабораторных работ в повседневной практике, а также в период массовых исследований; разработаны микрообъемные методы биохимической и серологической идентификации вибрионов разных видов, устройство для идентификации вибрионов. Автор провел сравнительное изучение разнообразных методов определения вирулентности холерных вибрионов 01 in vitro и на основе корреляционного анализа дает их оценку. Все положения и выводы диссертационной работы принадлежат автору. Автор написал все печатные материалы и принимал непосредственное участие в их оформлении.
Апробация результатов диссертации.
Доклады по материалам диссертации были сделаны на Республиканском совещании-семинаре бактериологов Украины, г. Тернополь, 1987; Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры", г. Ростов-на-Дону, 1988; Всероссийской научной конференции по проблеме "Холера", г. Ростов-на-Дону, 1992; Республиканском совещании врачей-бактериологов и зоологов Украины, г. Симферополь, 1992, Международной научной конференции "Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней", г.Харьков, 1993; Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера", г. Ростов-на-Дону, 1995; Украинской научно-практической конференции по вопросам диагностики, лечению, эпидемиологии и профилактики холеры, г. Одесса, 1995; Международной научной конференции, посвященной 150 летию И.И. Мечникова "Идеи Мечникова и развитие современного естествознания", г. Харьков, 1995; Украинском семинаре бактериологов, г.Львов, 1995; заседании Крымского республиканского филиала Украинского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, г. Симферополь, 1996; совещании-семинаре врачей-бактериологов отделов ООИ Украины по актуальным проблемам организации и проведения лабораторной диагностики холеры и других особо опасных инфекций, г. Донецк, 1997; научно-практической конференции "Санитарная охрана территории Украины и профилактика особо опасных инфекций", г. Одесса, 1997; юбилейной конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной эпидемиологии", посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии ХИУВ, г. Харьков, 1997.
Публикации, По теме диссертации опубликована 40 работ, в том числе: 1 монография, 20 статей в научных журналах, 18 публикаций в материалах и тезисах конференций и 1 патент на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; десяти глав, включающих обзор литературы по теме и выбора направлений исследований, описания методики и основных методов, результатов про-
-. 8
веденных теоретических и экспериментальных собственных исследований, анализа, обобщений и их обсуждения; выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 355 страницах компьютерного текста, содержит 69 таблиця 14рисунков. Библиографический указатель включает361 источник литературы.