Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .20
1.1.Характеристика анаммокс-бактерий 20
1.1.1. Особенности строения клеток анаммокс-бактерий .20
1.1.1.1.Морфология 20
1.1.1.2. Ультраструктурная организация клеток анаммокс-бактерий 21
1.1.1.3. Особенности строения клеточных мембран .22
1.1.3. Метаболизм анаммокс-бактерий .23
1.1.4.Ассимиляция углерода
1.1.5. Физиология анаммокс-бактерий .27
1.1.6. Разнообразие анаммокс-бактерий 31
1.1.6.1.Статус Candidatus для прокариот, не существующих в виде чистых
культур, и порядок его присвоения 31
1.1.6.2. Филогенетическое положение анаммокс-бактерий среди представителей филума Planctomycetes .32
1.2. Экология анаммокс-бактерий 35
1.2.1. Роль анаммокс-бактерий в глобальном цикле азота 35
1.2.1.1. Сосуществование и образование молекулярного азота анаммокс-бактериями и денитрификаторами .36
1.2.1.2. Процессы «неклассической» денитрификации и нитратредукции 37
1.2.1.3. Процесс нитрификации 38
1.2.1.4. Диссмиляционная нитратредукция 39
1.2.1.4. Азотфиксация 39
1.2.2. Экологические особенности анаммокс-бактерий .39
1.2.3. Распространение анаммокс-бактерий, принадлежащих к разным родам, и динамика состава анаммокс-сообществ во времени 40
1.2.4. Анаммокс-бактерии природных мест обитания .44
1.2.4.1. Анаммокс-бактерии в почве и болотах 44
1.2.4.2. Морские анаммокс-бактерии 45
1.2.4.3 Анаммокс-бактерии в пресноводных сообществах 47
1.2.5 Анаммокс-бактерии антропогенных мест обитания .48
1.2.5.1. Роль анаммокс-бактерий в искусственных болотах (constructed wetlands) и рисовых чеках .48
1.2.5.2. Анаммокс-бактерии в составе сообществ биореакторов по очистке сточных вод 50
1.2.6. Микроорганизмы, сопутствующие анаммокс-бактериям в различных сообществах, и взаимоотношения с ними .53
1.2.6.1. Нитрифицирующие микроорганизмы 56
1.2.6.2. Денитрифицирующие микроорганизмы .59
1.2.6.3. Микроорганизмы трихомной морфологии .60
1.2.6.4. Метаногены .64
2.3. Биоплёнки анаммокс-бактерий и их спутников .64
1.3.1. Типы биоплёнок .65
1.3.1.1. Тонкослойные биоплёнки 65
1.3.1.2. Гранулы 66
1.3.1.3. Флоккулы .72
1.3.2. Формирование биоплёнок .73
1.4. Применение анаммокс-бактерий в биотехнологии 75
1.4.1. Технологии очистки сточных вод, основанные на использовании биоплёнок
анаммокс-бактерий .75
1.4.2. Использование анаммокс-бактерий для очистки иловых вод 81
ГЛАВА 2. Материалы и методы 83
2. 1. Объект исследования .83
2.2.Использованные среды 83
2.3. Культуральные методы 84
2.3.1. Проточное культивирование анаммокс-сообщества в лабораторном биореакторе 84
2.3.2. Определение скорости потребления субстратов 85
2.3.3. Определение скорости роста .86
2.4. Химические анализы .86
2.4.1.Отбор проб .86
2.4.2. Определение значения рН 86
2.4.3. Определение концентрации ионов аммония, нитрата и нитрита .86
2.4.4. Методики определения газообразных продуктов 87
2.3.5. Исследование липидного состава мембран клеток анаммокс-бактерий..87
2.5. Предобработка образцов биомассы для микроскопических и молекулярно генетических исследований 88
2.5.1. Фиксация образцов 88
2.5.2. Обработка образцов ультразвуком .88
2.5.3. Приготовление ультратонких срезов 88
2.5.4. Окрашивание 89
2.5.5. Нефлуоресцирующие красители 89
2.5.6. Флуоресцирующие красители 89
2.6. Микроскопия .89
2.6.1. Фазово-контрастная и эпифлуоресцентная микроскопия 89
2.6.1. Электронная микроскопия 90
2.6.2. Атомно-силовая микроскопия 90
2.6.3. Конфокальная микроскопия 92
2.7. Молекулярно-генетические исследования .92
2.7.1. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 92
2.7.2.Секвенирование гена 16S рРНК 93
2.7.2.1.Выделение и очистка ДНК 93
2.7.2.2. Амплификация фрагментов генов 98
2.7.2.3. Молекулярное клонирование .100
2.7.2.4. Секвенирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей .101
2.7.2.5. Построение филогенетических дендрограмм 102
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение .103
3.1. Получение и описание новой монокультуры анаммокс-бактерии Candidatus Jettenia asiatica ecosi, активной в широком диапазоне концентраций азотных субстратов и рН 103
3.1.1. Автоселекция микробного сообщества, осуществляющего процесс анаммокс, при длительном культивировании в лабораторном up-flow биореакторе .103
3.1.2 Изменение филогенетического состава анаммокс-сообщества биореактора в ходе длительного культивирования 106
3.1.3.Описание монокультуры анаммокс-бактерий Candidatus Jettenia asiatica ecosi .110
3.1.3.1. Морфология и ультраструктура .110
3.1.3.2. Скорость роста .112
3.1.3.3. Потребление субстратов при периодическом культивировании .113
3.1.3.4. Липидный состав клеточных мембран 115
3.1.3.5. Описание филотипа Candidatus Jettenia asiatica ecosi 117
3.2. Разнообразие микроорганизмов, сопутствующих анаммокс-бактериям в сообществе биореактора 117
3.2.1. Состав микроорганизмов-спутников по данным секвенирования последовательностей генов 16S рРНК .117
3.2.2. Состав сообщества микроорганизмов-спутников по данным микроскопических исследований и FISH 122
3.3. Биоплёнки, сформированные сообществом биореактора в проточных условиях 127
3.3.1. Два типа биоплёнок, сформированных в ходе длительного проточного культивирования 127
3.3.2.1. Строение сферических биоплёнок (гранул) по результатам электронной и конфокальной микроскопии 128
3.3.2.2. Строение тонкослойных биоплёнок 132
3.3.2. Динамика формирования тонкослойных биоплёнок de novo при проточном культивировании .133
3.4. Использование активных гранул монокультуры анаммокс-бактерий для пуска нового лабораторного реактора, входящего в систему очистки иловой воды .139
3.4.1. Подготовительный запуск и вывод на рабочий режим системы реакторов частичной нитрификации-анаммокс на минеральных средах с азотными субстратами 139
3.4.1.1. Подготовительный запуск реакторов на минеральной среде 140
3.4.1.2. Работа сопряжённых реакторов на минеральной среде 141
3.4.1.2. Работа сопряжённых реакторов на иловой воде 143
3.4.2. Филогенетический состав сообществ реакторов частичной нитрификации и анаммокс 146
Заключение .148
Выводы 150
Список литературы
- Ультраструктурная организация клеток анаммокс-бактерий
- Проточное культивирование анаммокс-сообщества в лабораторном биореакторе
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
- Изменение филогенетического состава анаммокс-сообщества биореактора в ходе длительного культивирования
Введение к работе
Актуальность темы. Анаммокс-бактерии – хемолитоавтотрофные
микроорганизмы, осуществляющие процесс анаэробного окисления аммония нитритом с образованием молекулярного азота. С момента открытия анаммокс-бактерий процесс анаммокс привлёк большое внимание микробиологов и биотехнологов. В настоящее время процесс широко используется во всём мире для биологической очистки стоков, богатых азотсодержащими и бедных органическими загрязняющими веществами.
Для повышения эффективности существующих и создания новых систем очистки сточных вод важны комплексные фундаментальные исследования процесса анаммокс и анаммокс-бактерий, обнаружение новых видов анаммокс-бактерий, активных в широком диапазоне концентраций азотных субстратов и других условий среды, способных очищать стоки разного происхождения, с различной концентрацией азотсодержащих загрязняющих веществ и при меняющихся абиотических условиях. Процесс анаммокс во всём мире находит наибольшее применение для очистки стоков с высокой концентрацией азота и низким содержанием органических веществ, в частности, иловых вод метантенков, стоков предприятий, выпускающих минеральные удобрения, стоков птицефабрик, и др. (Van Hulle et al., 2010; Ножевникова и др., 2011; Lackner et al., 2014). Кроме того, разработаны эффективные технологические схемы, предполагающие использование поступающих на очистку вод для получения энергии с помощью микробных топливных элементов. Процесс анаммокс в таких схемах используется для эффективной доочистки стоков от азотсодержащих веществ, находящихся в них в низкой концентрации (Kuenen et al., 2011; Wu et al., 2015).
В естественных природных и антропогенных местах обитания все анаммокс-бактерии функционируют в составе сообществ. Такие сообщества могут состоять из сотен и даже тысяч видов микроорганизмов, связанных между собой взаимоотношениями на основе протокооперации или конкуренции, которые чрезвычайно важны для эффективности функционирования сообщества, для поддержания его стабильности в течение длительного времени на фоне меняющихся условий среды (Guo et al., 2016; Speth et al., 2016).
Анаммокс-бактерии имеют ярко выраженную тенденцию к прикреплённому
росту и формированию биоплёнок. Эти биоплёнки являются мультивидовыми и
включают, помимо анаммокс-бактерий, разнообразных микроорганизмов-
спутников. Слабо исследованными остаются такие аспекты, как микробный состав,
структура и динамика формирования мультивидовых микробных биоплёнок. Изучение их представляет как фундаментальный, так и практический интерес, поскольку на использовании мультивидовых биоплёнок анаммокс-бактерий основаны эффективные методы биологической очистки сточных вод (Tsushima et al., 2007; Persson et al., 2013).
Сообщество анаммокс-бактерий и микробных спутников, ставшее объектом исследования в настоящей работе, получено в результате длительного культивирования на минеральной среде в вертикальном проточном лабораторном биореакторе с подачей среды снизу (up-flow). Реактор был инокулирован активным илом из реактора-денитрификатора станции очистки сточных вод в долине р. Мзымта (Сочи), где процесс анаммокс впервые в мире был применен для глубокой очистки от азота низко-концентрированных хозяйственно-бытовых сточных вод. Биотехнология и станции комплексной очистки стоков (КОС) были разработаны Компанией «ЭКОС» и ИНМИ РАН специально для поселков строителей объектов зимней олимпиады Сочи-2014. К моменту начала настоящей работы лабораторный реактор функционировал при нагрузке 0,25 г N/л сут. Особенность работы реактора заключается в том, что свежая среда поступает в реактор не постоянно, а циклами по 6-8 минут каждые полтора часа. Таким образом, в реакторе формируются стратифицированные условия, при которых в нижней части реактора, выше концентрация субстратов и ниже рН, что доказывают многолетние измерения. Не все виды микроорганизмов, могут с одинаковой эффективностью функционировать в столь различающихся условиях. Это позволило предположить возможность сосуществования в верхней и нижней частях биореактора, разных видов или штаммов анаммокс-бактерий, адаптированных к различным уровням содержания нитрита и аммония и активных при разных значениях рН, или развития анаммокс-бактерии, способной расти в достаточно широком диапазоне концентраций субстратов и кислотной реакции среды.
Цель работы – охарактеризовать сообщество анаммокс-бактерий и их
спутников, сформировавшееся в лабораторном проточном вертикальном up-flow
биореакторе со стратифицированными условиями, при увеличении концентрации
азотных субстратов, используя комплекс микробиологических, биотехнологических
и молекулярно-генетических методов; идентифицировать ведущую форму
анаммокс-бактерий, а также исследовать возможность применения
отселекционированного анаммокс-сообщества для очистки стоков с высоким содержанием азотных загрязнений.
Задачи:
1. Идентифицировать и описать ведущую форму анаммокс-бактерий
микробного сообщества биореактора, функционировавшего в течение длительного
времени (более 5 лет) на минеральной среде в условиях повышающейся нагрузки по
азотсодержащим субстратам (аммонию и нитриту).
-
Определить состав сообщества микроорганизмов-спутников анаммокс-бактерий и определить их возможные функции в микробном сообществе биореактора.
-
Описать строение, структуру и динамику формирования биоплёнок микробным сообществом биореактора.
4. Определить эффективность использования сообщества анаммокс-бактерий
для очистки модельной и реальной иловой воды в лабораторной установке,
включающей аэробные реакторы частичной нитрификации и анаэробный анаммокс-
реактор.
Научная новизна.
Проведён длительный (более 5 лет) эксперимент по культивированию
микробного сообщества анаммокс-бактерий и их спутников в проточном
лабораторном up-flow анаэробном биореакторе при повышении нагрузки по
субстратам (аммонию и нитриту). Получено сообщество, представленное, в
основном, анаммокс-бактериями, с высокой эффективностью осуществляющее
процесс анаэробного окисления аммония нитритом и стабильно функционирующее
в условиях постепенного повышения концентрации основных субстратов в течение
длительного времени. Проведён мониторинг динамики состава сообщества
анаммокс-бактерий, исследовано, как он менялся во времени. К 5 году в реакторе
получена монокультура анаммокс-бактерии Candidatus 'Jettenia asiatica'
филотипecosi, которая по визуальной оценке различными микроскопическими методами составляла более 80% биомассы реактора. Исследована морфология и ультраструктура клеток анаммокс-бактерий биореактора, а также определён липидный состав мембран и время удвоения в проточных условиях. Показано, что монокультура активна в широком диапазоне концентраций субстратов и рН. Проведено описание морфологии, ультраструктуры клеток анаммокс-бактерий этого филотипа, липидного состава их мембран, определение скорости роста, филогении. Впервые исследована динамика формирования биоплёнок de novo сообществом анаммокс-бактерий и их спутников в условиях проточного анаэробного биореактора
с использованием авторской модификации метода «стёкол обрастания». Выяснено, что анаммокс-бактерии вместе с другими микроорганизмами активно вовлечены в формирование биоплёнок уже на ранних этапах. Биоплёнки, сформированные сообществом в проточных условиях, изучали с применением комплексного подхода, включающего современные культуральные, аналитические, микроскопические и молекулярно-биологические методы, что позволило получить достаточно полную картину развития, строения и структуры биоплёнок.
Получены важные сведения, касающиеся состава микроорганизмов-спутников, сосуществующих с анаммокс-бактериями в биореакторе, их морфологии и ультраструктуры. Выяснено, что спутники принадлежат к филумам Proteobacteria, Chloroflexi, Chlorobi и другим
Теоретическая и практическая значимость.
В ходе проведения работы получены ценные теоретические данные о
филогенетическом составе микробного сообщества биореактора, структуре и
динамике формирования биоплёнок анаммокс-бактериями и их спутниками в
проточных условиях. Показано, что сообщество анаммокс-бактерий и их спутников
может стабильно функционировать в течение длительного времени в
стратифицированных условиях, с высокой эффективностью удаляя азотсодержащие
загрязняющие вещества как в высокой (до 8,5 г N/л), так и в низкой (до 0,1 г N/л)
концентрации, что существенно для очистки реальных стоков различного состава, в
частности, хозяйственно-бытовых и городских сточных вод, а также
концентрированных стоков, в частности, иловых вод метантенков. Эти сведения станут основой новых рекомендаций, которые позволят усовершенствовать уже имеющиеся и разработать новые эффективные системы очистки стоков с различной концентрацией азотсодержащих загрязняющих веществ, основанных на применении биоплёнок анаммокс-бактерий. Продемонстрировано, что микробное сообщество, накопленное в биореакторе, может быть успешно использовано для запуска нового лабораторного реактора, являющегося частью системы реакторов с частичной нитрификацией-анаммокс для очистки иловой воды.
Личный вклад соискателя. Соискатель лично принимал участие во всех этапах работы: разработке и апробации экспериментальных методов, проведении экспериментов, обработке и обобщении полученных результатов, написании статей и тезисов конференций.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту.
1. В ходе длительного культивирования в анаэробном проточном лабораторном
биореакторе со стратификацией условий получено микробное сообщество с
доминирующим филотипом анаммокс-бактерий - Candidatus ‘Jettenia asiatica’ ecosi,
активным в широком диапазоне концентраций субстратов и рН.
-
Помимо анаммокс-бактерий, в состав сообщества входит большое количество микроорганизмов спутников, относящихся к различным филогенетическим и физиологическим группам: нитрифицирующие, денитрифицирующие микроорганизмы, нитчатые бактерии филума Chloroflexi и др.
-
Анаммокс-бактерии имеют тенденцию к прикреплённому росту. В условиях биореактора сообщество формирует 2 типа биоплёнок (в виде гранул и тонких слоев), которые имеют сходный филогенетический состав и структуру. Анаммокс-бактерии, наряду с нитчатыми формами, участвуют в формировании тонкослойных биоплёнок de novo уже на ранних этапах.
4. Гранулы анаммокс-бактерий сформированные в лабораторном биореакторе,
использованы в качестве инокулята для запуска нового анаммокс-реактора
являющегося частью лабораторной установки для очистки иловой воды с
эффективным удалением азота, включающей также реактор частичной
нитрификации.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были изложены на Международной молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 29-31 октября 2012 г., 27-30 октября 2015 г. и 1-2 ноября 2016 г. (г. Москва, Россия); Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 19-22 марта 2013 г. и 17-20 марта 2015 г. (г. Москва, Россия); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», 8-13 апреля 2013 г. и 13-17 апреля 2015 г. (г. Москва, Россия); Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни», 18-20 марта 2014 г. (г. Москва, Россия); Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 55-летию Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и 80-летию со дня рождения акад. Ю.А. Овчинникова, 15-19 сентября 2014 г. (г. Москва, Россия); XXVII Зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 9-12 февраля 2015 г. (г. Москва, Россия); 19-й
Международной пущинской молодёжной школе-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века», 20-24 апреля 2015 г. (г. Пущино, Россия); Международном конгрессе 6th Congress of European Microbiologists FEMS, 7-11 июня 2015 г., (г. Маастрихт, Нидерланды).
Публикации. По теме работы опубликовано 17 печатных работ, в том числе, 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в зарубежном журнале, цитируемом в Sсopus, 1 патент, 12 тезисов докладов.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы, и список литературы, включающий 252 наименования, в том числе, 8 на русском и 244 на английском языке. Работа изложена на 182 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 40 рисунков.
Ультраструктурная организация клеток анаммокс-бактерий
Температура. Рост анаммокс-бактерий в естественных условиях установлен в довольно широком интервале температур. В природных сообществах психрофильные виды из прибрежных вод Гренландии растут при температуре от 1-2 градусов с оптимумом 15C (Engstrom et al., 2005), в Охотском море анаммокс-бактерии активны при 3С (Shao et al., 2014). По данным молекулярно-генетических и радиоизотопных экспериментов, активные анаммокс-бактерии обнаружены и в горячих источниках Невады и Калифорнии при температуре до 52 C (Jaeschke et al., 2008; Russ et al., 2013), и в сообществах глубоководных гидротерм, где температура достигает 100C (Byrne et al., 2011). Возможно, среди них есть виды, эндемичные для этих экстремальных экотопов. Приспособление анаммокс-бактерий к термофильным условиям может быть связано с возможностью модификаций липидов в составе мембран — у живущих при более высоких температурах наблюдается увеличение количества длинноцепочечных жирных кислот в ладдеральных липидах (Jaeschke et al., 2008).
Для бактерий из очистных сооружений рост наблюдается при достаточно широком диапазоне температур 10-40 C, с оптимумом при 25-35 C (Strous et al., 1999b; Ножевникова и др., 2012; Hendrickx et al., 2012; Lotti et al., 2014a). В последнее время активно ведётся поиск психрофильных и психротолерантных видов анаммокс-бактерий, а также попытки адаптировать сообщества анаммокс-бактерий и их спутников к функционированию при пониженных температурах, что имеет большое практическое значение. Использование таких сообществ в полномасштабных установках по очистке сточных вод позволило бы существенно снизить затраты на поддержание нужной температуры, особенно в условиях холодного климата. В настоящее время показано, что анаммокс-сообщество лабораторного реактора способно адаптироваться к температуре до 13C и стабильно функционировать в этих условиях в течение нескольких месяцев (Persson et al., 2014; Zekker et al., 2015; Николаев с соавт., 2016). При температуре 10C активность процесса анаммокс существенно снижается, однако не ингибируется до конца (Lotti et al., 2014b). Отмечается факт изменения стехиометрии анаммокс-реакции при пониженных температурах. При температуре ниже 19C соотношение между потребляемым нитритом и аммонием становится 1,05 вместо 1,38, наблюдаемого в норме при 20-40C (Dosta et al., 2008). Свет . Было обнаружено, что анаммокс-бактерии чувствительны к свету (van de Graaf et al., 1996; Lotti et al., 2014a). Поэтому культивирование анаммокс-бактерий следует вести в реакторах, изолированных от света.
Ингибиторы. Процесс анаммокс ингибируется органическими веществами, такими как спирты, альдегиды, фенол. Добавление фенола в концентрации 300 мг/л сокращает эффективность процесса анаммокс примерно в два раза, однако после удаления фенола активность сообщества восстанавливается уже через 45 дней (Pereira et al., 2014). Метанол также оказывает ингибирующее действие на анаммокс-процесс (Gven et al., 2004). Добавление даже небольших порций метанола способно полностью остановить реакцию. При добавлении метанола в концентрации 0,5 мМ реакция останавливается мгновенно и необратимо. Ингибирующее действие метанола на анаммокс бактерии, вероятно, можно объяснить тем, что ферменты метаболизма анаммокс бактерий быстро осуществляют превращение метанола в формальдегид, который, в свою очередь, блокирует действие некоторых клеточных ферментов, связываясь с их пептидными цепями. Выяснение ингибирующего действия метанола на анаммокс бактерии имеет важнейшее значение в прикладном аспекте, поскольку именно метанол часто используется в биореакторах для выравнивания значения рН, снижающегося в ходе частичной нитрификации. Для Ca. Jettenia asiatica показано отсутствие ингибирования роста в присутствии ацетата в концентрации до 120 мг/л и пропионата — 200 мг/л (Huang et al., 2014).
Концентрация кислорода в среде оказывает значительное влияние на удаление азота в процессе анаммокс, так как анаммокс-бактерии являются анаэробами. Было показано, что процесс анаммокс ингибируется при очень низких концентрациях кислорода, менее 1 мкмоль (0.25–2% растворенного) (Jetten et al., 2001). Суспензионные культуры анаммокс-бактерий всегда выращиваются в условиях строгого анаэробиоза (Lotti et al., 2014a). Однако ингибирование анаммокс-бактерий кислородом обычно обратимо при создании анаэробиоза, в частности за счет его использования аэробными бактериями-спутниками анаммокс-бактерий в биоплёнках (Almstrand et al., 2014). Даже при начальных концентрациях до 18% кислорода в газовой фазе, после использовании кислорода присутствующими в системе аэробными бактериями активность анаммокс-бактерий восстанавливалась (Egli et al., 2001). Это создаёт возможность сосуществования в одном реакторе анаэробов и аэробов. На смене аэробных и анаэробных условий основан процесс CANON (Strous et al, 1997; Persson et al., 2014; Chu et al., 2015). В нем процесс аэробной частичной нитрификации (нитритации), осуществляемой аэробными аммоний окисляющими бактериями (АОБ, нитритирующие бактерии, нитрификаторы первой ступени), и анаэробный процесс анаммокс происходят в одном реакторе при периодической смене аэробных и анаэробных условий. При применении процесса CANON особо важно поддерживать такую концентрацию растворённого кислорода, чтобы его хватало для жизнедеятельности нитрификаторов, но при этом не допускать ингибирования анаммокс-процесса. При нарушении этого баланса, когда в среду поступает избыток кислорода, рост анаммокс-бактерий подавляется, и в сообществе начинают превалировать нитрификаторы второй ступени, окисляющие нитрит до нитрата и предпочитающие условия более интенсивной аэрации, чем нитрификаторы первой ступени и анаммокс-бактерии (Zhang et al., 2008).
Ингибирующее действие на процесс анаммокс оказывают и некоторые ионы солей, например, сульфиды и фосфаты, соли железа и цинка, которые могут присутствовать как в сточных водах, так и в составе питательной среды для культивирования анаммокс-бактерий в лабораторных условиях. При проточном культивировании сульфид, который восстанавливается из сульфата в анаэробных условиях, ингибирует процесс в концентрации 9,6 мг S/л (Dapena-Mora et al.,2007), а фосфат при концентрации выше 620 мг Р/л (Egli et al., 2001). Фосфаты, соли кальция, железа, цинка могут аккумулироваться на поверхностях биоплёнок анаммокс-бактерий, что может снизить активность процесса в 10 раз (Trigo et al.,2006).
Проточное культивирование анаммокс-сообщества в лабораторном биореакторе
Эксперимент по определению скорости потребления биомассой анаммокс-бактерий азотных субстратов при их разной начальной концентрации в среде проводили в стеклянных флаконах объёмом 30 мл с резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками. Жидкая фаза составляла 10 мл, газовая фаза – 20 мл. Состав использованной минеральной среды для анаммокс-бактерий был такой же, как в среде для культивирования, которая подавалась в биореактор. Содержание аммонийного и нитритного азота для экспериментов с низкой, средней и высокой начальной концентрацией азотных субстратов составляли 45 мг N-NH4+/л и 80 мг N-NO2- , 190 мг N-NH4+/л и 215 мг N-NO2- , 330 мг N-NH4+/л и 350 мг N-NO2-соответственно.
Флаконы со средой продували аргоном, закрывали пробками и стерилизовали при 1 ати 30 мин. Эксперименты с каждой концентрацией азотных субстратов ставили в 3-х повторностях. Во флаконы вносили по 1 г сырой биомассы (32 мг ОВ) из проточного анаммокс-реактора и под током аргона закрывали резиновыми пробками и металлическими колпачками. Инкубирование флаконов проводили при 30С. 2.3.3. Определение скорости роста.
Для определения скорости роста анаммокс-бактерий биореактора в проточных условиях пользовались ранее описанным методом (Николаев и др., 2015). Скорость роста определяли в условиях отсутствия лимитирования по субстратам. Большая часть биомассы (70%) была отобрана из работающего реактора и помещена в новый реактор. На оставшейся части биомассы был поставлен эксперимент по определению скорости роста. Нагрузку по азоту в реакторе начинали с 800 мг N л сутки и поддерживали в течение эксперимента на уровне, превышающем скорость потребления азота примерно в 2-2.5 раза. Таким образом, скорость роста анаммокс-бактерий не лимитировалась. Культивирование продолжалось в течение 40 суток при температуре 29–31C и рН исходной среды 7.7–7.9.
Пробы для анализов отбирали непосредственно перед проведением анализов. В случае стационарного культивирования, пробы среды для определения рН и концентрации ионов отбирали с помощью стерильного одноразового шприца без вскрытия сосуда. В случае проточного культивирования, пробы отбирали через пробоотборники, открывая зажимы на резиновых шлангах пробоотборников.
Определение значения рН производилось не реже 1 раза в неделю и осуществлялось с помощью лабораторного рН-метра HANNA рН-211 (Германия).
Определение концентрации ионов аммония, нитртата и нитрита проводилось колориметрически с помощью спектрофотометра Hach Lange DR 5000 (Германия) по стандартным методикам, записанным в памяти прибора, с использованием коммерческих наборов реактивов Hach Lange для определения соответствующих ионов: LCK303, LCK302 и методом с реактивом Несслера для определения аммония, NitraVer5 для определения нитрата, NitriVer2 для определения нитрита. 2.4.4. Методики определения газообразных продуктов
Хроматограф Кристалл 5000.2 (ЗАО ХРОМАТЕК г. Йошкар-Ола) с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), детектором по теплопроводности (ДТП) и метанатором использовали для измерения концентраций Н2, СН4, СO2, O2, N2 и N2O в газовой фазе. В качестве сорбента для определения Н2, СН4, O2 и N2 использовали цеолит NaX 60/80 меш. Длина стальной колонки составляла 3 м, внутренний диаметр - 2 мм, температура колонки - 40С, температура испарителя - 200С, ДТП – 200С, метанатора – 350оС, ПИД –300С, расход водорода - 25 мл мин-1, расход воздуха - 250 мл мин-1, расход газа-носителя аргона – 25 мл мин-1, объем исследуемой пробы - 500 мкл. Разделенные на цеолите компоненты детектировались последовательно сначала на ДТП, затем на ПИД с метанатором.
В качестве сорбента для определения СO2 и N2O использовали Porapak Q 80/100 меш. Длина стальной колонки составляла 3 м, внутренний диаметр - 2 мм, температура колонки - 40С, температура детектора и испарителя - 200С, расход газа-носителя гелия – 25 мл мин-1, объем исследуемой пробы - 500 мкл. СO2 и N2O детектировались на ДТП. Процентную концентрацию газа рассчитывали по уравнению: С (%) = S K (1) где S - площадь опытного пика на хроматограмме, мВ мин, К - градуировочный коэффициент, K= С (%) стандарта/S пика стандарта.
Определение липидного состава и обнаружение ладдеральных липидов проводили на базе Центра Коллективного Пользования РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина методом хромато-масс-спектрометрии, по ранее описанной процедуре (Hopmans et al., 2006), с некоторыми изменениями. Липиды были экстрагированы из лиофилизированной биомассы смесью метанола/дихлорметана в соотношении 2:1 и отделены от органического слоя путем испарения дихлорметана. Изолированные липиды подвергались либо метилированию с BF3/метанол, либо дериватизации триметилхлоросиланом. Затем метилированные липиды растворяли в дихлорметане и анализировали. Экстракты липидов вводили в хромато-масс-спектрометр Trace GC Ultra DSQ II (Thermo Scientific), откалиброванный по стандартными смесями (Supelco). 2.5. Предобработка образцов биомассы для микроскопических и молекулярно-генетических исследований
Для проведения молекулярно-генетических и микроскопических исследований образцов биомассы из реактора образцы предварительно подвергались предобработке, включавшей фиксацию, окрашивание, обработку ультразвуком.
Стёкла обрастания и образцы для фазово-констрастной микроскопии в некоторых случаях фиксировались в пламени горелки. Кроме того, для фиксации образцов клеток и биоплёнок использовали параформальдегид и растворы спиртов.
Образцы биомассы фиксировали в течение 2 часов по методике, описанной ранее (Ножевникова с соавт., 2012), 4%-м раствором параформальдегида в PBS буфере следующего состава (г/л): NaCl – 8.0; KCl – 0.2; Na2HPO4 – 1.44; NaH2PO4 – 0.2; вода дистиллированная – 1000 мл. рН 7.0. Стерилизация при 121 С. Фиксированные образцы хранили при -20С (Amann et al., 1990).
Стёкла обрастания фиксировали, последовательно выдерживая по 3 мин в растворах этанола возрастающей концентрации (50%, 80% и 100%).
Фиксированные образцы механически растирали в фарфоровой чашке с помощью пестика, а затем обрабатывали слабым ультразвуком в течение 10 сек при 20% мощности на установке Branson Digital Sonifier 250, Danbury, CT.
Для исследования трёхмерной структуры гранул из биореактора получали ультратонкие срезы, основываясь на описанной ранее методике (Persson et al., 2014), с некоторыми изменениями. Для приготовления ультратонких срезов фиксированных в параформальдегиде гранул анаммокс-бактерий использовался крио-ультрамикротом Leica CM1850UV-Cryostat (Германия). Отдельные гранулы обрабатывали реактивом Tissue Tek O.C.T Compound (Япония) и замораживали в жидком азоте при температуре -70 С. Срезы толщиной 15-20 мкм получали при температуре -33 с помощью крио-88 ультрамикротома. Полученные ультратонкие срезы помещали на полилизиновые предметные стёкла Thermo Scientific Polysine slides (США). Образцы на стёклах транспортировали в сухом льду. Хранили при -20С.
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
Помимо анаммокс-бактерий, сообщество биореактора включает большое количество представителей других групп микроорганизмов. Несмотря на то, что в реакторе созданы условия элективности, способствующие накоплению преимущественно анаммокс-бактерий (отсутствие органических веществ в среде при сравнительно высокой концентрации аммония и нитрита, анаэробиоз, прикреплённый рост биомассы, защита от света), филогенетический состав микроорганизмов-спутников оставался очень богатым даже к 5 году с начала культивирования. Микроорганизмы, сопутствующие анаммокс-бактериям в исследуемом сообществе, могут быть вовлечены в процессы цикла азота или могут выступать в качестве гетеротрофного компонента сообщества, потребляя органические соединения (Wang et al., 2016). Несмотря на то, что исследуемый реактор функционирует в течение более 5 лет на минеральной среде, органические вещества также могут присутствовать в реакторе в качестве компонентов внеклеточного полимерного матрикса биоплёнок, а также в результате отмирания некоторой части микробной биомассы.
По результатам секвенирования генов 16S рРНК с универсальным бактериальным праймером 11F, в сообществе обнаружены бактерии 12 филотипов (Рис.3.10). Такой филогенетический состав очень разнообразен для сообщества реактора, уже очень длительно функционирующего на минеральной среде и при высоких нагрузках по азоту. Наличие столь многочисленных и разнообразных микробных спутников на пятом году с момента запуска реактора свидетельствует о том, что между анаммокс-бактериями и спутниками существуют тесные взаимоотношения на основе симбиоза или конкуренции, прежде всего, за субстраты. Многокомпонетность сообщества, функционирующего в проточных условиях при повышающихся нагрузках по субстратам является залогом стабильной работы сообщества в течение длительного времени.
Анаммокс-бактериям сопутствуют представители таких филумов, как Bacteroidetes, Chlorobi, Chloroflexi, Betaproteobacteria. Представители этих филумов типичны для микробиоты активных илов очистных сооружений (Kragelund et al., 2007; Cho et al., 2010; Kindaichi et al., 2012; Speth et al., 2016). Большинство из них имеет низкое (менее 85%) сходство с известными бактериальными видами, поэтому нельзя сделать какие-либо выводы о том, какие процессы могут осуществляться этими группами микроорганизмов. По всей видимости, большинство из них являются олиготрофами, использующими органику от отмерших клеток или вещество внеклеточного полимерного матрикса (Kindaichi et al., 2012; Speth et al., 2016).
На филогенетическом дереве, изображённом на Рис. 3.10, полученные в данном исследовании клоны объединены в 12 групп-филотипов. Количество клонов в каждой группе указано в скобках. Группа 1 включает анаммокс-бактерии Candidatus Jettenia asiatica ecosi, доминирующий филотип анаммокс-бактерий в сообществе реактора. По данным микроскопических исследований и метода FISH, эта группа бактерий является доминирующей микробной группой в сообществе реактора и составляет не менее 80% по численности от общего числа микробных клеток. По данным секвенирования с планктомицет-специфичным праймером Pla46F к данному филотипу принадлежало 47 клонов из числа 88 исследованных клонов. При анализе с помощью универсального бактериального праймера количество клонов, относящихся к Candidatus Jettenia asiatica ecosi, составило всего 4. Это объясняется определёнными трудностями в работе над молекулярно-генетическими исследованиями анаммокс-бактерий, в частности, выделением ДНК, а также известными ограничениями самого метода севенирования генов 16S рРНК.
Представители 3 группы относятся к филуму Chlorobi. Этот филотип имеет 96% сходства с Ignavibacterium album, факультативно анаэробным микроорганизмом, для которого характерна высокая степень метаболической пластичности (Liu et al., 2012). В исследуемом сообществе эта группа микроорганизмов также может метаболизировать органические вещества, а также, согласно новейшим данным метагеномного анализа сообщества анаммокс-реактора, может быть вовлечена в процессы цикла азота (Speth et al., 2016; Wang et al., 2016).
Представители 4 группы относятся к филуму Bacteroidetes. Бактерии этого филума часто встречаются в составе сообществ очистных сооружений различного масштаба, в особенности тех, биомасса которых существует в форме биоплёнок (Almstrand et al., 2014). В некоторых системах очистки стоков они являются доминирующей филогенетической группой микроорганизмов, по данным секвенирования генов 16S рРНК (Adrados et al., 2014). Нитчатая морфология многих представителей филума Bacteroidetes и их локализация в биоплёнках в толще внеклеточного полимерного матрикса, между кластерами клеток кокков и бацилл позволили предположить, что Bacteroidetes играют роль каркаса для формирования и поддержания объёмной структуры биоплёнок, а также участвуют в деградации сложных органических соединений, образующихся в ходе отмирания части микробных клеток в сообществе (Almstrand et al., 2014; McIlroy and Nielsen, 2014).
Микроорганизмы филума Proteobacteria также являются обычным компонентом микробных сообществ, подобных исследуемому. Представители группы 7 относятся к роду Denitratisoma и, вероятно, способны к денитрификации, а также к потреблению оксида азота (Fahrbach et al., 2006; Ishii et al., 2011). Несмотря на то, что элективные условия в биореакторе направлены на стимуляцию роста анаммокс-бактерий и подавление роста денитрификаторов, последние могли с высокой степенью вероятности сохраниться в составе сообщества, так как в подобных сообществах популяции анаммокс-бактерий и денитрификаторов находятся в динамическом равновесии. При смене условий в реакторе (попадание значительных порций органики в результате естественного отмирания части клеток или, наоборот, последующее выедание органики) могут превалировать как первые, так и вторые (van Hulle et al., 2010).
Группы 10-12 филогенетически наиболее близки (86-89% сходства) к филуму Chloroflexi. Представители этого филума являются обычным компонентом сообществ реакторов, очищающих стоки различного состава и происхождения (Bjornsson et al., 2002; Kragelund et al., 2007; Kindaichi et al., 2012). Предполагается, что Chloroflexi также выступают в качестве гетеротрофного компонента микробного сообщества (Kindaichi et al., 2012). Как и Chlorobi, они могут участвовать в процессах удаления азотных соединений из очищаемых стоков (Speth et al., 2016).
Что касается представителей филотипов 5, 6, 8, 9, то сказать что-либо об их роли в сообществе невозможно, так как процент сходства с известными видами с установленными функциями очень мал. Представители филумов Acidobacteria, Actinobacteria и нового филума-кандидата TM6, к которым предположительно можно отнести группы 6, 9 и 8 соответственно, нередко обнаруживаются в составе сообществ биореакторов в качестве минорного, но постоянного компонента, однако предположения о том, какие задачи они могут выполнять, до сих пор отсутствуют (Adrados et al., 2014; Speth et al., 2016).
Изменение филогенетического состава анаммокс-сообщества биореактора в ходе длительного культивирования
Анаммокс-реактор был инокулирован 13,5 г СВ ила на 1 л реактора (0,3 л анаммокс-биомассы влажностью 88,75% на 2,5 л рабочего объема реактора). Начальные концентрации азотных субстратов были такие же, как в реакторе, откуда был отобран инокулят: 400 мг N-NH4 /л и 400 мг N-NО2/л, однако затем были снижены до 200 мг/л по азоту ввиду того, что происходило ингибирование процесса. Это могло быть вызвано окислительным стрессом, которому подверглась биомасса при переносе из одно реактора в другой при засеве. Скорость прокачки среды через реактор объемом 2,5 л составлял 2,5 л/сутки в первые 133 сутки эксперимента и 3,5 л/сутки с 133 по 255 сутки эксперимента, что соответствовало HRT 1 и 0,71 сутки. Температура процесса в первые 55 суток составляла 34-35оС, а после, как и в случае с нитрификационнымм реактором, была снижена до 31оС Эффективность удаления азота неуклонно росла по мере адаптации биомассы к новым условиям, и к 90 суткам составляла в среднем 85% (Рис. 3.26). Нагрузка по азоту в период эффективного удаления азота (120-250 сутки) составляла около 600 мг N л-1 сутки-1.
После того, как оба реактора вышли на стабильный режим работы они были соединены между собой, как показано на Рис. 3.27. Среда, поступающая на очистку, попадала в анаммокс-реактор, затем поступала в реактор с частичной нитрификацией и на последнем этапе рециркулировалась снова в анаммокс-реактор. Таким образом, в реакторе анаммокс создавались условия для развития анаммокс-бактерий, т.к. в исходной среде присутствовал аммоний, а с рециркулируемой из нитрификатора водой поступал азот в окисленной форме, в виде нитрита и нитрата
Такая схема используется на предприятиях ООО «Компания «ЭКОС»», с очистных сооружений которой был отобран посевной материал для нашего лабораторного анаммокс-реактора (Ножевникова и др., 2012).
Для более четкого изложения эксперимента, в нем выделено 3 фазы, в которых изменялись один или несколько параметров (среда, температура, субстрат).
В описанных выше условиях, при работе на минеральной среде, удалось достичь высокой эффективности удаления аммонийного и общего азота, составлявших в среднем 82 и 76% и доходивших до 93 и 89%. (Рис.3.28, фаза 1 и 2).
При переводе системы на реальную иловую воду, разбавленную водопроводной водой в соотношении 1:2, эффективность работы реакторов значительно снизилась (фаза 3). Очевидно, снижение активность микробных процессов при переводе реакторов на иловую воду связано с содержанием в иловой воде значительных количеств органических веществ, которые могут ингибировать процессы анаммокс и нитрификации.
На станциях очистки сточных вод «ЭКОС», разработанных и построенных впервые в поселках строителей объектов Зимней Олимпиады Сочи-2014, такая схема используется для очистки низко концентрированных бытовых сточных вод. Более того, на очистку вода поступает после предварительной обработки флокулятном для осаждения взвешенных частиц. При этом удаляется не менее 40% органики, содержащейся в исходной сточной воде. В поступающей на очистку воде ХПК не превышало 140 мг/л. При этом азот в виде аммония, наоборот, переходит в растворенное состояние. Таким образом, снижается соотношение С:N и создаются условия для развития анаммокс-бактерий.
На этом этапе работы, по данным FISH с универсальными зондами на бактерий EUB 338 I, II, III, в обоих реакторах присутствовало значительное количество активных микробных клеток (Рис. 3.29).
В 5-ой фазе эксперимента система была переведена на классическую схему очистки иловой воды для двухреакторных систем Sharon-Anammox, впервые внедренную в Нидерландах в г. Роттердам-Докхавен (Van Dongen et al., 2001). Эта схема не предполагает рециркуляции среды: среда поступала сначала в реакторы частичной нитрификации, откуда вся частично нитрифицированная вода поступала в реактор анаммокс. В этих условиях удалось добиться восстановления эффективности удаления азота до 65%.
Таким образом, накопленная в анаммокс-реакторе биомасса монокульуры анаммокс-бактерии Candidatus Jettenia asiatica ecosi была успешно использована в 2-х ступенчатой технологии (двух-реакторной системе) для удаления азота из иловой воды, метантенка, сбраживающего модельную органическую фракцию ТБО, включающую пищевые отходы и комбикорм.
Нагрузка по азоту, а также общий удаленный и неудаленный азот (без учета нитратного азота) в установке частичной нитрификации-анаммокс. В фазе 1 и 2 система работала на минеральной среде с концентрацией азота 303 мг N-NH4/л и 337 мг N-NH4/л, соответственно, в фазе 3-5 — на иловой воде, разбавленной водопроводной водой в соотношении 1:2. Средняя коцентрация аммонийного азота и ХПК в разбавленной иловой воде в фазе 3 – 300 мг N-NH4/л и 950 мг O2/л, фазе 4 -290 мг N-NH4/л и 1000 мг O2/л, в фазе 5- 317 мг N-NH4/л и 917 мг O2/л.
По молекулярно-генетическим данным, к моменту перевода системы на иловую воду в составе микробного сообщества реактора с частичной нитрификацией присутствовали представители 11 филумов, в том числе нитрифицирующие бактерии филумов Proteobacteria и Nitrospinae (Рис. 3.30).
По данным секвенирования генов 16S рРНК, в сообществе реактора присутствуют микроорганизмы 26 групп (см. Приложение 2). Среди них нитрифицирующие бактерии, предположительно, принадлежат к филуму Nitrospinae (группа 12) и Proteobacteria (группы 16 и 17). Представители группы 24 относятся к роду Ralstonia, для которого недавно показана способность к денитрификации (Xiao et al., 2015), также как и для Leucobacter denitrificans, ближайшего родственника представителей группы 14 (Weon et al., 2011) и для рода Rhodoplanes, к которому можно отнести филотип 19 (Xiao et al., 2015). Представители группы 1 относятся к анаммокс-планктомицетам. Возможно, что они не являются аборигенной микробиотой биореактора, а были привнесены из анаммокс-реактора.
Однако, представители конкретно этого филотипа не были обнаружены в сообществе анаммокс-реактора, поэтому не исключено, что этот филотип изначально принадлежит к сообществу реактора частичной нитрификации. Также с циклом азота в реакторе могут быть связаны микроорганизмы групп 20, 25 и 26. Филогенетически наиболее близкие к ним бактерии способны к фиксации азота (Wang et al., 1999; Wang et al., 2016).
Прочие группы микроорганизмов могут относиться к гетеротрофному компоненту сообщества, а также обеспечивать процессы грануляции. Часть филотипов предположительно связана с удалением фосфора (группы 18, 22 и 23) (Sawayama et al., 2000; Lu et al., 2007).
Филогенетический состав сообщества анаммокс-реактора не претерпел значительных изменений с момента запуска и идентичен таковому того анаммокс-реактора, откуда был отобран посевной материал.