Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Образование водорода микроорганизмами в природе 8
1.2. Целлюлоза и целлюлозолитические микроорганизмы 13
1.2.1. Разложение целлюлозы в природе 17
1.2.2. Целлюлозолитические ферментные системы 23
1.2.3. Регуляция синтеза целлюлазных комплексов 27
1.3. Получение водорода из различных видов целлюлозосодержащего сырья 28
1.4. Предобработка целлюлозосодержащего сырья 30
1.5. Микроорганизмы применяемые для получения водорода 34
1.6. Конверсия микробного водорода в электроэнергию 39
1.6.1. Топливные элементы 39
1.6.2. Биологические топливные элементы 41
1.7. Заключение 57
2. Материалы и методы 60
2.1.1. Отбор образцов 60
2.1.2. Культивирование микроорганизмов 60
2.2. Выделение чистых культур микроорганизмов 62
2.2.1. Культивирование на чашках Петри 62
2.2.2. Культивирование в трубках Бурри 62
2.3. Изучение морфологии клеток 63
2.4. Изучение состава сообществ методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) 63
2.5. Аналитические методы 66
2.6. Предобработка фильтровальной бумаги . 68
2.7. Определение гидрогеназной активности по выделению водорода в бесклеточных экстрактах . 68
2.8. Подготовка водородного и кислородного электродов для работы в среде ферментации . 69
2.8.1. Кислородный электрод . 69
2.8.2. Водородный электрод 70
2.9. Электрохимические измерения 71
2.10. Статистическая обработка данных 71
3. Результаты 72
3.1. Поиск и выделение термофильных микроорганизмов-продуцентов водорода, способных эффективно разлагать целлюлозосодержащее органическое сырье в анаэробных условиях 72
3.2. Изучение морфологии выделенных сообществ 75
3.3. Исследование состава отобранных сообществ с помощью метода ДГГЭ 77
3.4. Выделение чистых культур водородобразующих микроорганизмов 81
3.5. Определение гидрогеназной активности в бесклеточном экстракте ЧК1 83
3.6. Оценка скорости разложения целлюлозы и выделения водорода 84
3.7. Предобработка целлюлозы 85
3.8. Изучение роста и образования водорода выделенными сообществами при использовании различных целлюлозосодержащих отходов 87
3.9. Культивирование отобранных микроорганизмов в режиме рН -статирования 92
3.10. Изучение операционной стабильности ферментного электрода в модельных условиях 94
3.11. Исследование операционной стабильности ферментного эдектрода в среде культивирования микроорганизмов 96
3.12. Разработка биореакторной топливной ячейки для процесса конверсии микробного водорода в электроэнергию 100
3.13. Испытание прототипа проточной системы 106
4. Обсуждение результатов 114
5. Выводы 119
6. Список литературы 120
- Целлюлоза и целлюлозолитические микроорганизмы
- Изучение состава сообществ методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ)
- Исследование состава отобранных сообществ с помощью метода ДГГЭ
- Изучение роста и образования водорода выделенными сообществами при использовании различных целлюлозосодержащих отходов
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие методов переработки органических отходов и поиск новых перспективных энергоносителей - одни из основных задач стоящих перед современным обществом.
Эффективная переработка органического сырья (в том числе отходов
деревообрабатывающей, пищевой, сельскохозяйственной промышленности,
муниципальных отходов) - чрезвычайно сложная научно-техническая и социально-экономическая задача. Утилизация отходов путем захоронения на свалках, рециклинга и сжигания повышает удельную нагрузку на почву, приводит к сокращению природных площадей, значительному загрязнению окружающей среды токсичными веществами и невозможности обеспечить окупаемость экологических мероприятий. Несмотря на это количество отходов, антропогенного происхождения, постоянно увеличивается.
Усилия современных исследователей сосредоточены на решении задачи, переработки широкого спектра отходов в целом и органических отходов в частности. Целлюлозосодержащее сырье занимает здесь особое место, поскольку представляет собой субстрат тяжёлый для биодеструкции. Многие микроорганизмы всё же способны вполне активно гидролизовать целлюлозу. В тоже время одним из основных продуктов микробной переработки целлюлозы является водород. Водород можно использовать в качестве топлива, так например теплота сгорания водорода в несколько раз превышает теплоту сгорания бензина. Примерно половина водорода, производимого в мире сегодня, извлекается из природного газа в ходе его переработки, методом парового риформинга (Padro et al.,1999). Этот метод имеет два недостатка. Во-первых, в качестве побочного продукта выделяется углекислый газ, загрязняющий атмосферу и, во-вторых, сырьё для производства водорода является исчерпаемым ресурсом. Поэтому развитие технологий получения микробного водорода носит первостепенный характер в секторе биотопливной энергетики. Однако на сегодняшний день, пока ещё не существует ни одной коммерчески эффективной технологии производства водорода из возобновляемого сырья. До сих пор не решены проблемы хранения, транспортировки и очистки водорода.
Большинство этих проблем можно было бы решить путём использования технологии водород-кислородных топливных элементов (ТЭ). Окисление водорода в ТЭ происходит на платиновом катализаторе. Платина, в свою очередь, необратимо ингибируется серосодержащими соединениями, которые в значительной степени присутствуют в водороде микробиологического происхождения.
Группой учёных химического факультета МГУ был разработан водородный электрод, который осуществляет реакцию окисления водорода с помощью фермента
гидрогеназы иммобилизованной на графитовом носителе (Morozov et al., 2002). Применение этой технологии для конструирования водород-кислородных ТЭ работающих в среде ферментации микроорганизмов позволило бы в значительной степени продвинуться на пути развития водородной энергетики.
Исследования проведены при финансовой поддержке федеральной целевой программы Министерства образования и науки Российской Федерации «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы в рамках реализации проекта «Проведение поисковых научно-исследовательских работ по направлению «Производство топлив и энергии из органического сырья» ГК № 558, а также при поддержке европейского гранта FP6 «HYVOLUTION» SES-6 019825.
Цель работы. Микробная переработка целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию через промежуточное образование водорода с использованием ферментного электрода, погружённого в среду ферментации.
Достижение данной цели предполагало решение следующих задач:
выделение и отбор анаэробных термофильных целлюлозолитических водородобразующих сообществ микроорганизмов из природных биотопов;
оптимизация условий культивирования отобранных сообществ микроорганизмов;
определение таксономического состава отобранных сообществ микроорганизмов;
изучение электрохимических характеристик ферментного электрода в среде ферментации;
разработка технологии переработки целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию.
Научная новизна.
В работе:
впервые было предложено использование ферментного электрода на основе гидрогеназы для окисления водорода, выделяемого термофильным целлюлозолитическим сообществом микроорганизмов;
впервые была создана установка, предназначенная для переработки целлюлозы анаэробными термофильными микроорганизмами в электроэнергию.
Практическая значимость работы.
Полученные в рамках проведённых исследований результаты, могут быть применены в дальнейшем для разработки промышленных установок предназначенных для
переработки органических отходов в топливный водород, который может быть окислен непосредственно в среде ферментации с образованием электроэнергии, в системе ферментного ТЭ.
Предложенная в работе технология биореакторного ТЭ может найти широкое применение для производства электроэнергии в процессе микробной утилизации органических отходов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях: Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009 г.), 11-ой научной конференции «Экосистемы, организмы, инновации - 11» (Москва, 2009 г.), 3-ей международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2009 г.), 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009 г.), международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010 г.), международных конференциях EurAsiaBio-2010 (Москва, 2010 г.), «Permea-2010» (Словакия, 2010 г.), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 8 тезисов докладов на международных и российских конференциях.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (214 литературных источников, из которых 31 отечественный и 183 иностранных). Работа изложена на 136 страницах, содержит 5 таблиц и 53 рисунка.
Целлюлоза и целлюлозолитические микроорганизмы
Большая часть используемых бактериями, грибами и животными органических субстратов - это полимеры растительного происхождения. Таким образом, основные органические субстраты представляют собой макромолекулы, не способные проникать через плазматическую мембрану бактерий, и первый этап их разложения состоит в расщеплении до олигомеров и мономеров под действием выделяемых бактериями экзоферментов, главным образом, гидролаз, связанных с наружной поверхностью клеток или экскретируемых в растворимой форме. Водорастворимые олигомерные и мономерные соединения, проникают в клетку и подвергаются дальнейшему расщеплению (Пиневич, 2007). Целлюлоза - основной углевод растительных клеток, входит наряду с другими полимерами, гемицеллюлозой и лигнином, в состав клеточных стенок. Синтезировать целлюлозу способны также некоторые бактерии, например Acetobacter xylinum (Ленглер и др, 2005). Из всех органических субстратов целлюлоза присутствует в природе в наибольшем количестве. Так, содержание целлюлозы в волосках семян хлопчатника 97— 98%, в стеблях лубяных растений (лён, рами, джут) 75—90%, в древесине 40—50%, камыше, злаках, подсолнечнике 30—40% (Лобанок и др., 1988). Ежегодно синтезируется около 4 10" тонн целлюлозы. Из целлюлозы производят бумагу и картон. Так, по данным «Продовольственной и сельскохозяйственной организации при ООН», в 2009 году в мире было произведено 3,7 108 тонн бумаги и картона (http://www.fao.org/). Лидерами в этой сфере производства являются КНР и США. Кроме того, природные волокна из целлюлозы (хлопковое, лубяное), а также искусственные волокна широко используются в текстильной промышленности. Микрокристаллическую целлюлозу используют в качестве наполнителя при изготовлении лекарственных препаратов как сорбент для аналитической и препаративной хроматографии (Пиневич, 2007).
Целлюлоза - очень прочное соединение, способное в естественных условиях сохраняться без изменения очень долго. Важная особенность целлюлозы, в основном не свойственная другим полисахаридам - это возможность образования кристаллической структуры. Кристаллическая целлюлоза отличается высокой степенью упорядоченности, при которой элементарные микрофибриллы плотно прилегают друг к другу (Синицын и др., 1995; Lynd et al., 1999). В результате создаётся мощная структурная упаковка. Поэтому целлюлоза не растворяется в воде даже при кипячении. Структурная организация целлюлозы настолько сложна, что молекулы воды с трудом проникают внутрь полимера. В то же время, при определённых условиях, целлюлоза способна поглощать большое количество воды. Так очищенный хлопок впитывает до 0,4 г воды на 1 г целлюлозы (Лобанок и др., 1988).
Молекула целлюлозы представляет собой линейный полимер, содержащий примерно от 100 до 14000 остатков глюкозы, соединённых Р-1,4-связью; эта связь обеспечивает высокую прочность молекулы целлюлозы, как и других структурных полисахаридов (рис. 1; Лобанок и др. 1988). В полимерной цепи целлюлозы, каждый остаток глюкозы повёрнут относительно соседнего на 180. Такую повторяющуюся пару остатков в составе целлюлозы называют целлобиозой (рис. 2). Несмотря на то, что целлюлоза состоит из остатков глюкозы, наличие Р-1,4-связей между этими остатками заставляет считать, что основным повторяющимся структурным элементом полисахарида является дисахарид целлобиоза. Также интересно отметить, что именно целлобиоза является главным промежуточным продуктом расщепления целлюлозы целлюлолитическими ферментными системами (Ленглер и др., 2005; Пиневич, 2007).
Целлюлозные цепи, связанные между собой многочисленными межмолекулярными водородными связями и силами Ван дер Ваальса, формируют ригидные и нерастворимые в воде фибриллы. По мнению исследователей, нерастворимость в воде обусловлена наличием водородных связей между целлюлозными молекулами. Такие водородные связи в целлюлозе имеются между глюкозными остатками в самой цепи глюкана и между соседними цепями. Однако в случае замещения полярных групп, например карбоксиметилом, происходит нарушение молекулярной регулярности - такая замена способствует возникновению множества водородных связей с водой и делает целлюлозу растворимой (Lynd et al., 1999; Ленглер и др., 2005; Пиневич, 2007).
Одним из основных факторов, определяющих свойства целлюлозы, является надмолекулярная структура. Цепи молекул целлюлозы объединяются в пучки - мицеллы. Максимальный диаметр одной молекулы целлюлозы - 0,8 нм. Эти молекулы образуют элементарные мицеллы с максимальным диаметром 10 нм. Элементарные мицеллы объединяются в пучки, называемые микрофибриллами. Тяжи последних имеют ширину 25 нм и содержат до 2000 молекул целлюлозы. Микрофибриллы объединяются в волокна - макрофибриллы шириной 0,4 мкм, они содержат около 500000 молекул целлюлозы (Лобанок и др., 1988).
Фибриллы целлюлозы содержат в своём составе как высокоупорядоченные кристаллические структуры, так и аморфные, рыхлые участки (10-40%). Кристаллические участки, в отличие от аморфных, устойчивы к действию гидролитических ферментов. Только аморфные участки целлюлозы могут набирать влагу и набухать. При этом число гликозидных связей доступных действию целлюлозолитических ферментов в большей степени зависит от степени набухания аморфных участков целлюлозы. Это объясняется тем, что ферменты способны действовать только на поверхности целлюлозы, а при набухании аморфных участков, площадь поверхности участка целлюлозы увеличивается. Увеличение степени набухания достигается за счёт механической или физической предобработки, такой как пропаривание, размалывание, обработка ультразвуком. Минеральные кислоты и щёлочи в высоких концентрациях увеличивают набухание всего волокна, так как они способны разрывать водородные связи и проникать в кристаллические участки. Модифицированная таким образом целлюлоза имеет более открытую структуру и поэтому в большей степени доступна действию ферментов (Lynd et al., 2008; Vrije et al., 2009). Вопрос о фазовом соотношении аморфных и кристаллических участков окончательно не решён. Переход аморфной фазы в кристаллическую происходит скачкообразно. Интересно, что при обработке целлюлозы водой даже при низких температурах происходит повышение её плотности. Присутствие воды обеспечивает кристаллизацию целлюлозы благодаря перераспределению водородных связей. Повышение температуры также ускоряет повышение плотности и степени упорядоченности (Лобанок и др. 1988).
Изучение состава сообществ методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ)
Выделение ДНК. ДНК из накопительных культур выделяли стандартным методом (Маниатис и др., 1984), при необходимости используя различные его модификации (Tsai and Olson, 1991; Mori et al., 1994). Для выделения ДНК из накопительных культур культуральную жидкость центрифугировали при 13000 g, в течение 20 минут. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл (или более) лизирующего буфера (0,15 М NaCl, 0,1 М Na2EDTA [рН 8.0]), содержащего 15 мг/мл лизоцима, после чего инкубировали на водяной бане при 37С 30 минут или более, тщательно встряхивая лизат каждые 10 минут. Затем добавляли аналогичное количество (200 мкл или более) буфера, содержащего 0,1 М NaCl и 0,5 М Tris-HCl (рН 8.0) и добавляли додецилсульфат натрия до конечной концентрации 0,5%. Дальнейшее разрушение клеток осуществляли с помощью протеиназы К, которую добавляли до конечной концентрации 100 мкг/мл, после чего лизат инкубировали в течении 30 минут или более на водяной бане при 37С. Перед добавлением протеиназы К клетки разрушали с помощью стеклянных шариков (0,1 мм в диаметре) на приборе Mini-Beadbeater-1 (BioSpec Products, США) на максимальной скорости в течении 5 минут. Эффективность лизиса определялась подсчетом клеток на световом микроскопе с фазово-контрастным устройством. Затем к лизату добавлялся равный объем смеси фенол-хлороформ [фенол был насыщен 0,1 М Tris-HCl (рН 8.0); хлороформ представлял собой смесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношени 24:1]. Полученную смесь аккуратно перемешивали в течение 10-20 минут, при этом образовывалась эмульсия. Смесь центрифугировали при 13000 g. в течение 8 минут. Затем отбирали супернатант, который еще 2 раза (или более) аналогичным образом обрабатывали хлороформом. К получившемуся объему супернатанта добавляли 0,1 часть 3 М ацетата натрия (рН 5.2) и 3 части 96% спирта. Для осаждения ДНК данную смесь инкубировали при -20С в течение 2 часов или ночи. Затем ДНК осаждали центрифугированием при 13000 g. в течение 20 минут. Осадок последовательно промывали и центрифугировали при 13000 g. в течение 8 минут сначала в 70% спирте, затем в 96% спирте, после чего супернатант удаляли, полученный осадок тщательно высушивали и растворяли в 30-50 мкл ТЕ буфера [10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA (рН 8.0)]. При необходимости получившейся раствор ДНК очищали от примесей РНК путем инкубации с РНКазой А (конечная концентрация 0,2 мг/мл) в течении 2 часов при 37С. Также при необходимости более тщательной очистки ДНК, проводили электрофорез в 1% агарозном геле. Затем полоски геля вырезали и чистили с помощью набора для очистки ДНК из геля в реакционной смеси (Цитокин, Россия).
Электрофорез в агарозном геле. Для проведения электрофореза готовили 1-2% агарозный гель с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. ДНК, полученную в результате амплификации или после выделения, в объеме 5-10 мкл (или более) смешивали со стандартным красителем (бромфенолблау в глицерине) в соотношении 1:6, и полученную смесь наносили в лунки агарозного геля; в качестве маркера использовали маркеры фирмы “Fermentas” GeneRuler 100 bp DNA Ladder и Lambda DNA/EcoRI+Hindlll. Затем гель помещали в электрофорезный буфер ТАЕ и ДНК разделяли в соответствии с размером в токе электрического поля при 4 В/см. Для визуализации сигналов использовали УФ-трансиллюминатор с длиной волны 310 нм или 470 нм.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР амплификацию проводили с использованием системы универсальных праймеров 515 Univ F - 907 В act R, в 20 мкл смеси, содержащей однократный реакционный буфер фирмы «Evrogen», 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеотид-трифосфата; соответствующее количество каждого праймера, 1 ед. активности Taq ДНК полимеразы (Evrogen, Россия) и 1 мкл раствора матричной ДНК в концентрации 1-10 нг. Температурную программу подбирали экспериментально, основываясь на стандартном протоколе ПЦР. Перед проведением анализа ДГТЭ к полученным ампликонам добавляли участок, богатый Г+Ц нуклеотидами, для чего проводили реамплификацию с аналогичными праймерами (518 GC Univ F - 907 Bact R), содержащими так называемый Г+Ц-кламп, состоящий из 40 нуклеотидов. В качестве одного из отрицательных контролей использовали реакцию без добавления ДНК. Амплификацию проводили на многоканальном ДНК-амплификаторе Терцик ("ДНК-технология", Россия). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле.
ДГТЭ. Полученные с помощью ПЦР ампликоны разделяли на основании характеристики их плавления в 8% (по объему) полиакриламидном геле с относительным градиентом концентрации денатурирующих агентов от 30% до 70%. Для приготовления геля использовали два раствора. Раствор А (относительное содержание денатурирующих агентов - 0%) в количестве 50 мл готовили смешиванием 10 мл 40% акриламид-г4,г4 -метиленбисакриламида и 0,5 мл 50хТАЕ (до конечного объема смесь доводили бидистиллированной водой). Раствор В (относительное содержание денатурирующих агентов - 100%) готовили в количестве 50 мл смешиванием 10 мл 40% акриламид-г4,г4 -метиленбисакриламида, 0,5 мл 50хТАЕ, 20 мл 40% деионизированного формамида и 21 г мочевины (до конечного объема смесь доводили бидистиллированной водой). Формамид перед использованием деионизировали с помощью смолы (AG501-X8 mixed-bed resin, Bio-Rad) в течение 1 часа при периодическом помешивании. Для приготовления 15 мл рабочих растворов, относительное содержание денатурирующих агентов в которых было 30% или 70% смешивали 10,5 мл раствора А и 4,5 мл раствора В (для получения 30%) или 4,5 мл раствора А и 10,5 мл раствора В (для полчения 70%), 130 мкл 10% APS (аммоний персульфат) и 7,5 мкл TEMED. Рабочие растворы с помощью устройства, формирующего градиент, заливали в собранную рамку для денатурирующего градиентного гель-электрофореза. В данной работе использовали прибор TV400-DGGE (SCIE-PLAS, Англия). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 70 В и температуре 60С в течение 20 часов. После электрофореза гель промывали бидистиллированной водой и затем окрашивали SYBR Gold (Molecular probes, Лейден, Нидерланды) в течение 40 мин. в темноте. После окрашивания гель визуализировали на транс иллюминаторе при длинне волны 470 нм, и нужные полосы вырезали для дальнейшего анализа. Полосы из геля помещали в пробирки, содержащие 20 мкл дистиллированной воды, и оставляли в холодильнике на ночь для элюирования ДНК из геля. Элюат в количесве 1 мкл использовался в качестве матрицы для провдения ПЦР с соответствующими праймерами, продукты реамплификации чистили электрофорезом в 1,5% агарозном геле (см. пункт 2.3.2) из которого ДНК вырезали и очищали с помощью набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей (Цитокин, Россия). Сиквенс ДНК проводили в компании «Евроген» (Москва). Полученные хроматограммы расшифровывали с помощью программы Chromas Lite (Technelysium Pty Ltd). Идентификацию проводили путём сравнения полученных последовательностей нуклеотидов с базой данной NCBI.
Исследование состава отобранных сообществ с помощью метода ДГГЭ
Для понимания механизмов взаимодействия между микроорганизмами в микробном сообществе необходимо знать его состав. В состав полученных нами сообществ, теоретически, могли входить различные виды микроорганизмов, включая строгих или факультативных анаэробов, таких как: Thermoanaerobacterium spp., Clostridium spp., Thermotoga neapolitana, Enterobacter aerogens, Thermotoga elfii, Caldanaerobacter subterraneus и др. Перечисленные микроорганизмы способны в процессе своего метаболизма потреблять растворённые сахара и выделять водород. Кроме того, там могут присутствовать микроорганизмы, разрушающие сложные биополимеры (гидролитики) такие как: С. thermocellum, С. cellulosi, С. thermolacticum, С. thermocopriae, Caldicellulosiruptor saccharolyticus и др.
Для изучения состава микробных сообществ в настоящее время широкое применение нашли молекулярные методы. Основным преимуществом применения таких методов в работе с изолированными из природных биотопов сообществами микроорганизмов является изучение филогенетического состава микробного сообщества без предварительного выделения чистых культур. Как правило, трудно получить все чистые культуры составляющие сообщество микроорганизмов, кроме того, не всегда удаётся достичь абсолютной частоты полученных чистых культур, что в свою очередь исключает использование фенотипических признаков в определении их таксономической принадлежности. Современные методы определения таксономической принадлежности основаны на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов. Наиболее распространенным является анализ, основанный на вариабельных фрагментах консервативных элементов генов рРНК. Выбор именно этих генов обусловлен, прежде всего, их повсеместной распространенностью во всем живом мире, а теперь уже и доступностью огромных массивов данных о структуре генов рРНК у самых разнообразных микроорганизмов (Tsai and Olson, 1991; Head et al.,1998; Muyzer and Smalla, 1998; Spiegelman et al., 2005; Перевалова, 2006; Yang et al., 2007; Perevalova et al., 2008).
Отобранные сообщества были изучены методом ДГГЭ. Из полученных полос выделяли ДНК и подвергали её аплификации и секвенированию. Как было сказано выше, к наиболее продуктивным сообществам, относились сообщества, выделенные из следующих биотопов: 1 - зона компостирования растительных остатков (компостная куча 1), 2 - модифицированное сообщество 5, 3 - зона компостирования растительных остатков (компостная куча 2), 4 - экскременты антилопы, 5 - экскременты коровы.
Результаты анализа представлены на рисунке 22. При визуальном осмотре геля можно предположить, что в исследуемых сообществах преобладают близкие группы микроорганизмов. Сравнение сообщества, выделенного из экскрементов коровы (№ 5) с тем же сообществом, но уже прошедшим очистку в трубке Бурри (№ 2), свидетельствует о том, что ранее присутствующие полосы 6 и 7 исчезли, а полоса 3 стала более интенсивной. Это может свидетельствовать о том, что при элиминирование одного из важных для сообщества микроорганизмов, его функции берёт на себя ранее менее активный микроорганизм.
Сообщества (№ 1) и (№ 3) имеют приблизительно схожий состав, за исключением полос 17 и 18, присутствующих в №1, которые, тем не менее, выражены слабо. Вероятно, состав этих сообществ не отличается друг от друга ввиду того, что они оба были отобраны из зоны компостирования растительных остатков (две разные компостные кучи, т.е. биотопы были схожи по своим условиям). Наибольшие отличия были обнаружены в сообществе, выделенном из экскрементов антилопы гну, что, связано со специфическими условиями содержания и кормления животного (Московский зоопарк).
Clostridium sp. Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum преобладающим в сообществах. Это род Thermoanaerobacterium. В том числе микроорганизмы, близкие к видам Т. thermosaccharolyticum, Т. aotearoense.
Также были идентифицированы представители рода Clostridium и, в частности, микроорганизм близкий к Clostridium cellulosi. Полученный результат был ожидаем и полностью соответствовал теоретическим представлениям о термофильном целлюлозолитическом сообществе. Так, многие представители рода Clostridium обладают мощными целлюлозолитическими ферментными системами, в то время как виды рода Thermoanaerobacter, как правило, растут на легко усваиваемых сахарах и являются хорошими продуцентами водорода. Различные представители обоих родов способны расти при высоких температурах. Так оптимум роста С. cellulosi 55С, а Т. thermosaccharolyticum - 55-60С (Ruyet et al., 1985; Cato et al., 1986; Jin et al., 1988; Yarning et al., 1991; Glazer and Nikado, 1995). Таким образом в результате исследования сообществ микроорганизмов методом ДГГЭ были идентифицированы их основные компоненты.
Возможно, что преобладающие микроорганизмы сообществ все же несколько различаются на уровне штаммов или видов. Точнее анализ может быть сделан только с помощью клонирования, хотя его применение позволит лишь детализировать картину и получить некоторые уточнения. Очевидно, что преобладающие формы уже выявлены.
Микробное сообщество представляет собой совокупность взаимодействующих между собой микроорганизмов, связанных различными, прежде всего трофическими связями. Первостепенную роль в них играют кооперативные взаимодействия, когда продукты обмена одних микроорганизмов служат субстратами для других, и т.д. Для каждой группы веществ (полисахаридов, белков, жиров) существует свой маршрут деструкции, и на каждом из них функционируют определенные группы микроорганизмов. Проследить все трофические связи зачастую не представляется возможным из-за сложной, многокомпонентной структуры сообщества. По этой же причине возникают сложности и с управлением таким сообществом. Поэтому заманчивой перспективой является возможность создания искусственных ассоциаций микроорганизмов путем совмещения чистых культур представителей гидролитиков и диссипотрофов - активных продуцентов водорода.
Изучение роста и образования водорода выделенными сообществами при использовании различных целлюлозосодержащих отходов
Изначально акцент был сделан на поиск термофильных анаэробных целлюлозолитических микроорганизмов, поскольку именно они способны в таких условиях гидролизовать целлюлозу с максимальной скоростью. Однако известные ранее целлюлозолитические микроорганизмы, метаболизируя продукты гидролиза целлюлозы, образуют водород в небольших количествах. В тоже время, в природных биотопах они взаимодействуют с так называемыми микроорганизмами-диссипиотрофами (Заварзин, 2002), которые в свою очередь способны потреблять легко усваиваемые продукты гидролиза целлюлозы и образовывать значительные количества водорода. Как правило, гидролитики и диссипиотрофы живут в условиях синтрофного взаимодействия и способны контролировать метаболитические реакции партнёра по синтрофной кооперации с помощью своего собственного метаболизма (Alfons et al., 2009). Именно на отбор такого термофильного синтрофного консорциума, способного гидролизовать целлюлозу и образовывать водород в анаэробных условиях, был направлен поиск.
Хотелось бы отметить, что большинство термофильных анаэробных сообществ, с которыми велась работа, были отобраны из биотопов, которые трудно было охарактеризовать как высокотемпературные. Но это не помешало им соответствовать всем параметрам отбора и в том числе стабильному культивированию при 60С. Это может свидетельствовать о том, что отобранные микроорганизмы обладают достаточно широкой нормой реакции.
Водород, как правило, не является конечным метаболитом целлюлозолитических сообществ в природных биотопах. Образующийся водород и другие продукты почти мгновенно потребляются метаногенами или сульфатредукторами. Поэтому при выделении важно было отсечь неприемлемую для нас стадию потребления водорода в отобранных сообществах. Мы достигли этой цели с помощью селективных условий, в которых культивировались микроорганизмы. С помощью метода ДГГЭ было показано, что в качестве основных компонентов во всех отобранных сообществах присутствуют именно микроорганизмы гидролитики (Clostridium cellulosi) и диссипиотрофы (Thermoanaerobacterium sp.). Такой компонентный состав обнаруживается и в других работах направленных на получение анаэробного целлюлозолитического водородобразующего сообщества. К примеру, в некоторых случаях основными компонентами сообществ могут быть С. thermocellum, С. stercorarium (гидролитики), а С. thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, С. tyrobutyricum (диссипиотрофы; Лобанок и др., 1988; Lin et al, 2006; Ueno et al., 2006). При этом отобранные сообщества микроорганизмов эффективно перерабатывали целлюлозу и образовывали значительные количества водорода. Всего было отобрано 5 сообществ. Для наиболее продуктивного сообщества средняя скорость разложения целлюлозы составила 0,72 г/сутки л среды, а средняя скорость образования водорода 0,3 мМН2/ч л среды при культивировании в периодической культуре.
Как было выяснено, основным ингибитором процесса разложения целлюлозы и выделения водорода являлось падение рН ниже значений 4,5 - 5. Культивирование сообщества целлюлозолитических микроорганизмов в режиме рН-статирования позволило преодолеть этот ингибиторный эффект. При стабилизаци рН на уровне значения 6,5 средняя скорость разложения целлюлозы составила 1,5 г/сутки л среды (0,2 мМ/ч л среды) и уже через 10 суток в ферментёре не наблюдалось оформленного субстрата (нерастворимой целлюлозы), а количество образующегося водорода и других продуктов метаболизма резко падало (конец процесса). При этом максимальная скорость образования водорода при переработке целлюлозы составила 1 мМ Н2/ч л среды. При аналогичных условиях разложения целлюлозы (фильтровальной бумаги) в работе Desvaux (2000) была зафиксирована скорость, равная 1,139 г/сутки л среды (0,15 мМ/ч л среды).
Таким образом, работа установки в режиме рН-статирования позволяет значительно уменьшить время переработки субстрата. Ещё больше сократить это время можно в случае использования сырья предобработанного раствором 2% H2S04. Однако в последнем случае неизбежно встанут вопросы ликвидации сульфатов, что удорожает процесс или может привести к загрязнению окружающей среды. Большинство исследователей всё же применяют предобработку целлюлозосодержащих субстратов перед их внесением в среду культивирования (Kdr et al., 2004; Datar et al., 2007; Ren et al., 2008; Panagiotopoulos et al., 2009; Vrije et al., 2009).
Важно, что была показана возможность переработки не только сырья однообразного состава, такого как фильтровальная бумага. Отобранные сообщества, были способны также использовать в качестве субстратов и другие материалы, которыми представлены органические отходы (опилки, газетная и журнальная бумага, сено, дрожжи, дробина, отруби и пищевые продукты и др.). В тоже время по исследованным субстратам в литературе практически нет свединий об их микробиологической переработке в водород.
Из сообщества № 2 была выделена чистая культура, которая при росте на глюкозе, в экспоненциальной фазе роста, образует до 7,2 мМ Н2/ч л среды, в режиме рН статирования. Этот результат вполне сравним с результатами, полученными другими исследователями. Так, Caldicellulosiruptor saccharolyticus образует водород со скоростью мМ Нг/ч л среды (Kdr et al., 2004). Максимальная скорость образования водорода из глюкозы (16 мМ Н2/ч л среды) сообщается в работе Yokoyama et al. (2009).
Современное наукоёмкое производство уже не мыслит себя без использования интегрированных систем и технологий. Так, большое количество образованного при разложении целлюлозы водорода позволило нам использовать его в качестве топлива для ТЭ. Для конверсии водорода в электричество мы применили катализаторы на основе электродов с иммобилизованным ферментом-гидрогеназой. Температурный оптимум работы таких электродов находится в диапазоне высоких температур (60 - 80С), что оптимально подходит для использования их в среде ферментации термофильных микроорганизмов.
Впервые нами были разработаны системы, совмещающие ферментный ТЭ на основе гидрогеназы и термофильный анаэробный микробный биореактор. Мы показали, что ферментные электроды стабильны в присутствии всех групп соединений, выделяемых используемыми микроорганизмами. Максимальная мощность, которой удалось достичь составила 220 мкВт/см2 ферментного электрода. При этом 1 электрод площадью 1 см2 способен окислить в среднем только 30 мкМ Н2/час (Воронин, 2011). Однако можно подсчитать, что при увеличении площади водородного и кислородного электродов в 33 раза, электрическая мощность возрастёт до 7,3 мВт. Такой площади будет достаточно для непрерывного окисления водорода, образуемого сообществом № 1 со скоростью 1 мМ Н2/ч л среды.
