Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Влияние дождевых червей на физико-химические свойства почв ... 10
1.1. Влияние дождевых червей на морфологические и физические свойства почв 10
1.2. Влияние дождевых червей на химические свойства почв 19
1.3. Модификация дождевыми червями органических субстратов при вермикомпостировании 22
Глава 2. Влияние дождевых червей на микробный комплекс почв 25
2.1. Модификация состава и активности микроорганизмов в почвах в результате жизнедеятельности дождевых червей 25
2.2. Участие дождевых червей в переносе микроорганизмов в почвах 26
2.3. Влияние дождевых червей на микробную трансформацию азотных соединений в почвах 28
2.4. Микробное сообщество копролитов дождевых червей 31
2.5. Микробное сообщество в стенках нор дождевых червей 35
Глава 3. Трофическая деятельность дождевых червей в регуляции микробного комплекса почв 36
3.1. Микроорганизмы как источник питания дождевых червей 36
3.2. Механизмы модификации микробного сообщества в пищеварительном тракте дождевых червей 40
3.3. Микробные сообщества, ассоциированные с пищеварительным трактом дождевых червей 43
Глава 4. Объекты и методы исследования 47
4.1. Почва и компост 47
4.2. Дождевые черви 48
4.3. Получение копролитов и препарирование червей 49
4.4. Получение пищеварительной жидкости A. caliginosa 49
4.5. Определение биомассы микроорганизмов 50
4.6. Определение таксономического состава грибного сообщества 50
4.7. Идентификация грибов 51
4.7. Определение группового состава микроорганизмов, колонизирующих копролиты 53
4.8. Оценка физиологического состояния грибов по Хаттори 53
4.9. Оценка метаболической активности и функционального разнообразия методом МСТ 54
4.10. Оценка реакции грибов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей 55
4.11. Определение активности процессов трансформации азота в почвах и копролитах 56
4.12. Оценка роли грибов в водоустойчивости копролитов 57
Результаты и обсуждение 58
Глава 5. Модификация численности и биомассы грибов при прохождении почвы через пищеварительный тракт дождевых червей 58
Глава 6. Изменение видовой структуры грибного сообщества при прохождении почвы через дождевых червей 62
Глава 7. Выявление видов грибов, устойчивых к условиям пищеварительного тракта дождевых червей 73
Глава 8. Функциональная характеристика грибных популяций в местообитаниях, связанных с дождевыми червями 76
8.1. Доказательство соответствия распределению Пуассона появления колоний грибов на твердых питательных средах 77
8.2. Физиологическое состояние грибных популяций в местообитаниях, связанных с дождевыми червями 79
8.3. Метаболическая активность грибных популяций в местообитаниях, связанных с дождевыми червями 81
Глава 9. Механизмы модификации состава, биомассы и активности грибов при прохождении почвы через пищеварительный тракт дождевых червей... 84
Глава 10. Влияние развития грибов в копролитах на интенсивность газообразных потерь азота и их водоустойчивость 89
10.1. Активность трансформации азота и динамика микробной биомассы в свежих копролитах Aporrectodea caliginosa 89
10.2. Участие грибов в формировании водопрочных агрегатов из копролитов дождевых червей 100
Выводы 103
Список литературы 105
- Влияние дождевых червей на морфологические и физические свойства почв
- Модификация состава и активности микроорганизмов в почвах в результате жизнедеятельности дождевых червей
- Механизмы модификации микробного сообщества в пищеварительном тракте дождевых червей
- Получение копролитов и препарирование червей
Введение к работе
Актуальность темы. Грибы и дождевые черви являются важнейшими компонентами почвенной биоты. Грибы представляют ведущий по биомассе и активности блок редуцентов, дождевые черви - консументов почвенных микроорганизмов. Причем грибы считаются одним из главных пищевых источников для дождевых червей (Cooke, ; Edwards, Fletcher, ). Дождевые черви - типичные представители функциональной группы средообразователей или экосистемных инженеров (Brussaard, ; Lavelle and Spain, ; Wardle, ). Модифицируя физико-химические условия в почве, перемешивая и измельчая растительные остатки, создавая новые местообитания, они влияют на активность и состав почвенных бактерий и грибов (Стриганова, ; Loquet et al., ; Bouche, ; Lee, и др.). Дождевые черви повышают скорость минерализации, нитрификации и эмиссии диокисида углерода из почв. В их присутствии разложение органического вещества возрастает на - %, что определяется как прямым воздействием, так и стимуляцией микробиологической активности в экскретах (Satchell, ). Дождевые черви распространяют фитопатогенные (Hampson and Coombes, ) и микоризные грибы (Mcllveen and Cole, ; Reddel and Spain, ; Gange, ), путем поглощения спор в одном месте и выбрасывания с экскрементами в другом. Показано, что в присутствии дождевых червей возрастает микотрофность растений (Ydrogo, ; Patron et al., ). Черви, нарушая мицелиальную сеть, могут оказывать и отрицательное влияние на развитие микоризы у растений (Pattinson et al, ; Tuffen et al, ; Lawrence et al., ). Есть сведения, что при пассаже через пищеварительный тракт Aporrectodea caliginosa и Lumhricus terrestris меняется биомасса и таксономический состав грибов и бактерий (Schonholzer et al., ; Tiunov, Scheu, ), выявлены различия в структуре сообществ грибов в почве, дрилосфере и в копролитах L. terrestris (Tiunov, Dobrovolskaya, ; Orazova et al, ).
Несмотря на значительный объем накопленных данных (Piearce, ; Cooke, ; Вызов, ; Тиунов, ), представления о влиянии дождевых червей на почвенную микобиоту весьма неполны и часто противоречивы. Следует подчеркнуть, что большинство данных получено на основе методов посева, и они не дают полного представления об изменении биомассы грибов и бактерий при прохождении почвы через кишечник червей. Неизвестно существуют ли виды грибов, способные обитать в пищеварительном тракте дождевых червей или устойчивые к условиям этого местообитания. Крайне мало информации о динамике развития микобиоты в свежих копролитах червей. Нет экспериментальных данных, которые вскрывают механизмы, обусловливающие изменения состава и активности грибов при пассаже почвы через кишечник. Предполагают, что абразивное воздействие почвенных частиц в пищеварительном тракте может стимулировать прорастание спор некоторых видов грибов (Moody et al., ).
Прохождение почвы через дождевых червей, несомненно, представляет важный феномен, играющий роль как в модификации состава и структуры микробного комплекса почв, так и активности биологических процессов в ассоциированных с червями местообитаниях. Об этом говорят многие факты. В слое почвы площадью 1 м при плотности популяции дождевых червей особей суммарный пищеварительный тракт червей, своеобразный "биореактор" с повышенным содержанием легкодоступного органического вещества достигает значительной величины - 1 литра (Drake, Home, ). Годовая продукция копролитов червей в почвах умеренной зоны составляет - т/га, а в тропических почвах - до т/га (Barois et al., ; Makeschin, ). В копролиты с экскретами и выделениями дождевых червей поступают легкодоступные соединения углерода и азота (мочевина, мукопротеины, белки, свободные аминокислоты, аминосахара). Количество экскретируемого червями азота достигает нескольких десятков килограмм на гектар в год (Makeshin, ).
Целью работы было выяснение влияния пассажа почвы через пищеварительный тракт дождевых червей на грибы для понимания особенностей их состава и активности в местообитаниях, ассоциированных с этими животными.
Поставленная цель достигалась путем решения следующих задач.
1. Оценка изменений биомассы, разнообразия и физиологического состояния микроскопических грибов, происходящих в почвах / компосте при прохождении через пищеварительный тракт дождевых червей.
2. Установление видов микроскопических грибов, которые могли бы быть тесно ассоциированными или устойчивыми к условиям пищеварительного тракта дождевых червей.
3. Выяснение механизмов действия дождевых червей на микобиоту при пассаже почвы через пищеварительный тракт червей.
4. Исследование влияния иммобилизации азота (N) в грибной биомассе на интенсивность процессов N цикла в свежих копролитах и его потери при денитрификации.
5. Определение участия грибов в формирование водопрочных агрегатов из копролитов дождевых червей.
Научная новизна. Впервые дана комплексная оценка изменениям в видовой структуре, биомассе, физиологическом состоянии и метаболической активности, происходящим с сообществом микроскопических грибов при прохождении почвы/компоста через пищеварительный тракт дождевых червей. Установлено, что реакция грибов на выдерживание в кишечной жидкости варьировала от гибели мицелия и резкого снижения прорастания спор до отсутствия изменений в жизнеспособности грибных пропагул и стимуляции прорастания спор и повышения радиальной скорости роста у отдельных представителей. Гибель мицелия и ингибирование прорастания спор обнаружены уже при их кратковременной инкубации в кишечной жидкости, что обусловлено ее острым токсическим действием. Установлены виды грибов, способные долгое время сохранять жизнеспособность в условиях пищеварительного тракта дождевых червей. Показана возможность применения подхода Хаттори для выяснения физиологического состояния грибных популяций в различных местообитаниях. Установлено подавление жизнеспособности грибов в пищеварительном тракте дождевых червей. В копролитах дождевых червей происходит активный рост грибов и они проявляют в них более высокую метаболическую активность, чем в окружающей почве. Интенсивное развитие мицелия грибов в копролитах Aporrectodea caliginosa играет существенную роль в повышении водоустойчивости формирующихся из них агрегатов и иммобилизации азота, что снижает эмиссию его газообразных форм из почв.
Практическая значимость. Создана коллекция микроскопических грибов, которая может быть использована в работах по скринингу микроорганизмов для биотехнологических производств. Разработаны приемы по выделению микромицетов из кишечного тракта дождевых червей, которые могут быть применены при изучении взаимоотношений грибов с другими группами почвенных беспозвоночных. Сведения о модификации микобиоты при прохождении компоста через пищеварительный тракт червей представляют интерес при разработке приемов вермикомпостирования. Данные о значимом эффекте от иммобилизации азота грибами на денитрификацию в копролитах позволяют рекомендовать проведение полевых опытов по проверке влияния внесения растительных остатков на размеры эмиссии газообразного N из почв с высокой численностью дождевых червей. Результаты работы используются в лекционных курсах по экологии почвенных микроорганизмов и почвенной зоологии.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на XIV конгрессе европейских микологов (Кацивели, Украина, ), международной конференции «Eurosoil » (Австрия, Вена, ), на международной конференции «Вермикомпостирование и верми-культивирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы, достижения» (Минск, ), на V Всероссийском съезде почвоведов им. В.В. Докучаева (Ростов-на-Дону, ) и на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.
Публикации. По результатам исследования опубликовано работ, из них 3 экспериментальные статьи в рецензируемых журналах («Микробиология», «Почвоведение», «European Journal of Soil Biology»), 7 статей и тезисов в материалах международных и российских конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах, содержит таблиц и рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 6 глав экспериментальных результатов, выводов, списка литературы ( источников, из которых английских).
Выражаю искреннюю благодарность за помощь и постоянную поддержку д.б.н. А.В. Куракову, д.б.н. Б.А. Бызову, заведующему кафедрой биологии почв профессору Д.Г. Звягинцеву и всем сотрудникам кафедры биологии почв, а также Т.Ю. Нечитайло и П.Н. Голышину (Биотехнологический центр, Брауншвейг, Германия) за идентификацию ряда культур.
Влияние дождевых червей на морфологические и физические свойства почв
Обитающие в разных горизонтах почвы животные из группы мезо- и макрофауны активно перемешивают органические остатки с минеральными частицами, т.е. создают экониши, в которых к почвенным обитателям интродуцируются эпифитные, "подстилочные" виды. Естественно, таким образом, животные оказывают влияние на состав, структуру и активность микробиоты почв. Существенный вклад в этот процесс вносят дождевые черви.
Ежегодно черви перемешивают на 1 га около 3-5 т подстилки с минеральными горизонтами, образуя так называемый гумус типа мулль. Такие же масштабы отмечены для перемешивания навоза на пастбищах. Рассчитано, что в регионах с умеренным климатом за 50-100 лет верхние горизонты пахотных почв пропускаются через пищеварительный тракт дождевых червей (Barois et al., 1993; Makeschin, 1997).
В ненарушенных лесных и в меньшей степени в пахотных почвах дождевые черви влияют на дифференциацию почвенного профиля. Это происходит за счет оборота и перемещения почвы, увеличения аэрации, порозности и дренажа, дезинтеграции и инкорпорации подстилки. Активность червей приводит к расширению корнеобитаемой зоны (Makeschin, 1997).
Образование копролитов
Огромную роль в улучшении физических свойств почвы играет образование дождевыми червями копролитов. Копролиты червей состоят из почвы, смешанной с органическими остатками. Они откладываются как внутри ходов червей, так PI на поверхности почвы. Эпигейные (обитающие в поверхностных слоях почвы и в подстилке) черви откладывают экскременты на поверхности почвы, а обитающие в почве — в ходах или в других макропорах. Годовая продукция копролитов червей в почвах умеренной зоны составляет 75-250 т/га год (в среднем - 40-50 т/га год), а в тропических почвах— до 400 т/га (Barois et al., 1993; Makeschin, 1997).
Копролиты содержат больше глинистых и илистых частиц, органического материала и меньше песка, чем окружающая почва, поскольку дождевые черви избирательно поглощают более мелкие частицы и органические остатки. Средний размер минеральных частиц, обнаруживаемых в пищеварительном тракте дождевых червей, меньше, чем в почве и составляет 100 - 500 мкм. Считается, что черви не способны измельчать минеральные частицы, но они перетирают растительные остатки и частицы, содержащие органоминеральные комплексы. Это один из важнейших факторов воздействия червей на процесс разложения органического вещества (Lee, 1985).
Копролиты червей являются почвенными агрегатами размером несколько мм. Форма и повышенная прочность копролитов положительно сказывается на аэрации, инфильтрации воды, водоудерживающей способности почвы и увеличивает ее удельную поверхность. Агрегатное состояние в свою очередь определяет возможность проникновения корней растений, количество микрозон с доступными для растений питательными элементами, микробную активность и плодородие почвы.
Копролиты червей составляют значительную часть почвенных агрегатов. Например, в почвах с подстилкой типа мулль практически все агрегаты в горизонте At представлены копролитами. Продукция копролитов, которую можно учесть (копролиты, откладываемые на поверхность почвы), сильно варьирует в зависимости от вида червя и типа экосистемы и составляет от 0,25 до почти 30 кг/м . В почвах тропиков черви за год способны пропустить через пищеварительный тракт до 25 % от массы всего горизонта Ah (Lee, 1985). В черноземах под байрачными лесами верхний слой целиком состоит из копролитов. Копролитовая структура гумусового горизонта этой почвы отличает ее от соответствующего горизонта обычного чернозема (Карпачевский, 1983). Содержание копролитовых структурных агрегатов в черноземе обыкновенном в горизонте А] достигает 51 % (на комковатые агрегаты приходится 30 % , на зернистые - 19 %), а в Ад их доля достигает 84 % (Манаенков и др., 1997).
Многочисленные исследования показали, что почва, содержащая много дождевых червей, за счет копролитизации имеет следующие физические свойства: большую порозность за счет перемешивания частиц и склеивания их слизистыми выделениями червей; выровненный агрегатный состав с преобладанием средних и мелких агрегатов за счет перетирания почвы и склеивания в кишечнике червей; большую водоудерживающую способность за счет увеличения удельной поверхности в копролитах; в 2-10 раз большую скорость инфильтрации за счет ходов червей; большее количество водопрочных агрегатов; меньшее поверхностное растрескивание за счет разрыхления червями (Lee, 1985).
Модификация состава и активности микроорганизмов в почвах в результате жизнедеятельности дождевых червей
Дождевые черви могут ускорять колонизацию поступающего на поверхность почвы растительного опада почвенными грибами, и также способствовать проникновению подстилочных грибов глубоко в почвенные горизонты. L. terrestris сооружает вертикальные норы глубиной до 2 м., при этом он заглатывает и выносит на поверхность большие массы минеральной почвы, а на стенках нор оставляет копролиты с проглоченным на поверхности почвы опадом и ассоциированными микроорганизмами. Весьма вероятно, что в экосистемах умеренного климата масштабная форическая деятельность L. terrestris и других норных дождевых червей не дублируется никакими другими механизмами (Тиунов, 2007). Можно предположить, что результатом этой деятельности является общее повышение таксономического и функционального разнообразия сапротрофных грибов, заселяющих лесную подстилку. Имеются основания полагать, что это, в свою очередь, отражается на динамике деструкции растительных остатков (Setala and McLean, 2004; Tiunov and Scheu, 2005).
Существуют данные, что в случае высокого обилия дождевых червей в почве грибное сообщество может претерпевать существенные изменения. Инвазия европейского подстилочного червя Dendrobaena octaedra в сосновый лес в провинции Альберта, Канада (численность червей при этом достигала 3300 экз. на кв. метр) привела к увеличению относительного обилия быстрорастущих видов, таких как Trichoderma polysporum, и снижению обилия Oidiodendron echimdatum. Кроме того, в почве с высокой численностью червей было меньше обилие зигомицетов {Mortierella spp., Mucor spp.). Мицелий зигомицетов имеет мало септ, и эти грибы, видимо, особенно страдают от механических повреждений (McLean and Parkinson, 2000).
При прохождении почвенных бактерий через пищеварительный тракт червей их обилие в экскрементах может значительно меняться (Furlong et al., 2002). В экспериментах с червями Е. fetida показано, что если в корме — компосте животных доминируют грамотрицательные аэробные бактерии (в основном, рода Pseadomonas), а актиномицеты и бациллы, представляют минорные компоненты, то в копролитах - основе вермикомпоста доля грамотрицательных аэробов стала еще выше, а актиномицетов уменьшалась (Вызов, 2005).
Следует отметить, что хотя имеются работы, в которых сообщается об изменении численности, состава и активности микроорганизмов в почве или компосте в результате присутствия в них дождевых червей, однако они во многих аспектах не дают пока ясной картины.
Дождевые черви могут быть важными агентами распространения грибов и других микроорганизмов в почве. Этот вопрос исследовался экспериментально (Reddell and Spain, 1991; Pattinson et al., 1997), в частности в связи с возможностью распространения дождевыми червями патогенных и генетически модифицированных микроорганизмов (Thorpe et al., 1996; Joergensen et al., 1998). Предполагают, что дождевые черви могут распространять и споры фитопатогенов, например, таких как Pythium (Baweja, 1939) и Fusarium (Khambata, Bhatt, 1957). С другой стороны, считают, что норные черви могут препятствовать распространению фитопатогенных грибов путем потребления и погребения зараженной ими опавшей листвы (Hirst and Stedman, 1962; Niklas and Kennel, 1981 и др.). Присутствие в почве эндогейных червей {Aporrectodea spp.) существенно снижало зараженность растений Rhizoctonia solani, одним из самых распространенных фитопатогенов. Механизмы этого воздействия не выяснены (Stephens et al., 1993, 1994).
Черви могут принимать участие и в распространении спор арбускулярной микоризы. Арбускулярная микориза (AM, эндомикориза) играет исключительно важную роль в жизни растений и организации растительных сообществ (Smith and Read, 1997; van der Heijden, 2001). Образующие арбускулярпую микоризу грибы не формируют плодовых тел, а их крупные споры, образующиеся в почве, имеют ограниченные возможности для распространения. В копролитах нескольких видов дождевых червей обнаружены жизнеспособные споры и фрагменты мицелия AM грибов, причем их обилие часто было выше, чем в окружающей почве, поскольку черви предпочитают питаться в ризосфере растений (Reddel and Spain, 1991; Gange, 1993). Увеличение доли заселенных микоризой корней в присутствии дождевых червей было показано в некоторых экспериментах (Ydrogo, 1994; Patron et al., 1999). Однако это наблюдается далеко не всегда (Brown et al., 2000; Wurst et al., 2004). Одним из механизмов отрицательного влияния дождевых червей на AM грибы может быть механическое нарушение мицелия. На это указывают как лабораторные (Pattinson et al., 1997; Tuffen et al., 2002), так и полевые наблюдения (Lawrence et al., 2003).
Судьба бактериальных популяций в почвах может также зависеть в значительной мере от наличия червей. Например, количество бактерий Aeromonas hydrophila, интродуцированной в почву, возрастало или оставалось постоянным в присутствии червей, тогда как в почве без червей численность бактерии резко снижалась (Hendriksen, 1992).
Механизмы модификации микробного сообщества в пищеварительном тракте дождевых червей
Основным объектом исследования являлась дерново-подзолистая окультуренная удобряемая почва из-под красного-клевера с подсевом злаковых трав (Почвенно-экологический центр МГУ имени М.В.Ломоносова, Чашниково, Московская обл.). В течение одной ротации четырехпольного севооборота (вико-овсяная смесь - 1990 г., озимая пшеница - 1991 г., кукуруза на зеленую массу - 1992 г., ячмень - 1993 г.) сформировали три агрофона, органический, минеральный и органо-минеральный. Для их создания за 4 года было внесено 360 т/га навоза (органический фон), 180 т/га навоза + N225P1000K1000 (органо-минеральный фон), N510P2000K2000 (минеральный фон). В 1994 году на каждом из фонов был произведен уравнительный посев ячменя, в 1995 году на сформированные фоны была наложена следующая схема опыта: 0, N, NK, NP, РК, NPK. В 1997 году под кукурузу на силос вносили Ni5oP6oKi2o в 1998 году под ячмень с подсевом трав - N60P4oK6o в 1999 году под многолетние травы (клевер, тимофеевка, костер) удобрения не вносили. На варианте, где проводили отбор образцов была органно-минеральная система удобрений, а в последние 5 лет удобрения не применяли. Химические свойства почвы следующие: рН солевой. 5.7, гидролитическая кислотность 1.9 ммоль-экв/100 г, сумма поглощенных оснований 9.7 ммоль-экв/100 г, гумус 1.84%, общий азот 0.09%, подвижный фосфор (Р205) 19.5 мг/100г, обменный калий (К20) 19.4 мг/100 г. Также в работе использовали образцы дерново-подзолистой легко суглинистой почвы из Центрального лесного государственного биосферного заповедника (Тверская область). Отбирали образцы верхних горизонтов с участков под агроценозами и биоценозами, сформировавшимися при прекращении косьбы разнотравного луга. В качестве агроценозов использовали почвы косимого луга и из-под монокультуры картофеля. Отбор образцов проводили на следующих экспериментальных площадках: 1) картофельном поле, удобряемом навозом (ежегодно осенью - 10-15 т/га), 2) косимом разнотравном лугу, который используется в этом качестве 70-80 лет (раннее была пашня), 3) зарастающий лесом (береза, ольха, ива, ель) в течение 16 лет, ранее длительно косимом лугу, 4) смешанном лесу (береза, ольха, ель, клен), возраст которого около 60 лет (ранее была пашня) и 5) зрелом ельнике-кисличнике (90-110 лет). Все образцы были взяты из верхних (Ai и Апах) горизонтов с глубины 0-20 см.
Также проводили исследования компоста, в состав которого входили конский навоз (выдержанный в течение 2-3-х месяцев) (75%), древесные опилки (15-20%), кварцевый песок (5-10%) с добавлением молотого известняка (СаСОз).
В работе использовали 3 вида дождевых червей разных эколого-трофических групп - Aporrectodea caliginosa (эндогейные), Lumbricus terrestris (норные) и Eisenia fetida (подстилочные). Основные исследования выполнены на примере характерного обитателя почв дождевого червя А. caliginosa. Червей содержали в пластмассовых ваннах с почвой/компостом при 18-20С и влажности 60-80% от ПВ.
Образцы свежих копролитов получали, выдерживая червей в чашках Петри на увлажненной стерильной фильтровальной бумаге при температуре 4-5С в течение нескольких часов. В опытах также использовались копролиты различного возраста, которые получали путем их выдерживания на поверхности почвы в течение 3, 5, 7 и 12 суток.
Очищение пищеварительной системы червей от почвы и растительных остатков проводилось в стаканчиках на 100 мл со стерильным песком в течение 5-7 дней (по 3-5 червей на стакан). Черви пропускали песок, освобождая кишечник от старой пищи. Просмотр пищевого тракта такого червя через световой микроскоп показал, что кишечник полностью свободен от почвенных частиц. При извлечении кишечника животных убивали в горячей воде (96С), затем замораживали на морозильном столике (-16С) и препарировали на четыре отдела: глотка и желудок, задний, средний, передний отделы кишечника, либо на целостный пищеварительный тракт.
Червей предварительно содержали либо в почве, либо в простерилизованном автоклавированием песке для выяснения влияет ли субстрат, попадающий в пищеварительный тракт, на активность пищеварительной жидкости. Для выделения пищеварительной жидкости червей умерщвляли, погружая в кипяток на 1 сек. Червь размещался на морозильном столике (элемент Пелтье), где охлаждался до минус 16 С за 20 30 сек. Далее производили вскрытие червя, и в момент размораживания извлекали кишечник и/или его содержимое. При этом не допускали повторного замораживания материала. Извлеченную массу центрифугировали при 12000 об./мин в течение 5 мин для осаждения содержимого и стерилизации. Супернатант проверяли на стерильность, высевая без разведения на R2A агар и инкубируя при 20 С в течение 7 дней. Посев не выявил бактерий и грибов. До начала тестирования кишечную жидкость хранили при минус 18С (Byzov et al., 2007).
Получение копролитов и препарирование червей
Для определения видовой принадлежности грибной культуры ее высевали на плотные питательные среды, наиболее благоприятные для образования репродуктивных структур. Идентификацию проводили на основе морфологических признаков, главным образом, на строении и способах развития репродуктивных структур по соответствующим для конкретной систематической группы определителям (Кириленко, 1977; 1978; Билай, Коваль, 1988; Barnett, Hunter, 1972; Bissett, 1991; Booth, 1977; Domsh et al., 1993; Ellis, 1971; Klich, Pitt, 1992; Raper, Fennell, 1965; Raper, Thorn, 1949; Ramirez, 1982; Rifai, 1962; Pitt, 1991; Samuels, 1996; Schipper, 1973; Simmons, 1967 и др.). Часть культур, преимущественно представленных стерильным мицелием, были определены с использованием молекулярно генетических методов в федеральном биотехнологическом центре (Брауншвейг, Германия).
Подготовка культур для ПЦР-амплификации. Изоляты грибов выращивали в 50 мкл жидкой среды Чапека в 96-и луночной микротитровальной плашке (NUNC, Denmark) при 30 С в течение 4 дней. Затем жидкая фаза отбиралась и выращенная биомасса один раз промывалась 100 мкл раствора PBS (phosphate-buffered saline) (137 mM NaCl; 2.7 тМ КС1; 10 тМ Na2HP04; 2 тМ КН2Р04). Биомассу грибов подвергали лизисной процедуре: 1) инкубация в течение 2 часов с буфером Y1 (сорбитол 1М; ЭДТА 0,1М; литиказа lOOU/мл) (RNA/DNA Mini Kit; Qiagen, Germany; 2) после отбора буфера Y1 - инкубация со 100 мкл ПЦР-лизисного раствора А (67 mM Tris-Cl (рН 8.8); 16 тМ NH4SO4; 5 цМ р-меркаптоэтанол; 6.7 тМ MgCl2; 6.7 uM EDTA (рН 8.0); 1.7 uM SDS; 50 u.g/ml протеиназа К) [17] в течение 4-8 часов при 55 С. Дезактивация протеиназы К осуществлялась прогревом лизата при 80 С в течение 10 минут.
ПЦР-амплификация грибной 28S рДНК (D1/D2 домен). Реакция была поставлена в объеме 20 мкл. Реакционная смесь была составлена в соответствии с рекомендациями производителя (QIAGEN GmbH, Germany): деионизированная вода - 9 мкл; Q-solution - 4 мкл; 20 тМ раствор dNTPs (рН 8.0) - 4 мкл; ПЦР Буфер (10 х; содержит 15mM MgC12) - 2.0 мкл; 1.0 U Taq ДНК полимеразы; 0.12 nmol каждого праймера (NL-1 (upstream) [5 -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA-3 ] и NL-4 (downstream) [5 -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ]) и 2 мкл лизата. Условия амплификации: первоначальная денатурация при 95 С в течение 2 минут; затем 30 циклов, состоящих из 1 мин денатурации при 95 С, 1 мин отжига при 50 С и 1.5 мин амплификации при 72 С; завершающий отжиг при 72 С в течение 10 мин. Реакция была поставлена в термоциклере Eppendorf 5341 (Germany). Успешность амплификации (ПЦР-ный продукт размером около 680 нк) проверялась с помощью 2%-ного агарозного гель-электрофореза в 96-ти луночном формате (Invitrogen, Germany).
Секвенирование ампликонов и анализ полученных данных. Перед секвенированием продукты ГЩРа очищались с использованием MinElute 96 UF PCR purification kit (Qiagen, Germany). Однонаправленный секвенс был поставлен с использованием праймера NL-4 и R1492 в Eppendorf 5341 (Germany) в соответствии с протоколом BigDye Terminator vl.l Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Готовая реакционная смесь состояла из Ready Reaction Premix (2.5x) - 4 мкл; BigDye Sequencing Buffer (5.Ox) 2 мкл; праймер 10 pmol; ПЦР-продукт 200 нг; деионизированная вода -12 мкл. Условия реакции: 25 циклов, состоящих из 20 сек. при 96 С, 20 сек. при 50С и 4 мин при 60С. Полученные данные были обработаны программой BioEdit; идентификация осуществлена с использованием GenBank BLAST alignment software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul, 1997).
Копролиты дождевых червей A. caliginosa инкубировали на поверхности почвы при постоянной влажности 100% и температуре 18-20С в течение 3 суток. Именно через такой промежуток времени наблюдали интенсивное развитие грибного мицелия на копролитах. Групповой состав микроорганизмов изучали методом сканирующей электронной микроскопии и с помощью светового стереоскопического микроскопа. Препараты 3-х суточных копролитов высушивали на воздухе, затем на них напыляли смесь золота и углерода и микроскопировали на сканирующем микроскопе JSM-35-CF (JEOL) (Гузев, 1986).
Для определения состояния грибных популяций в местообитаниях, ассоциированных с дождевыми червями, анализировали расписание появления колоний на плотной питательной среде (ГПДА и R2A агаре) после посевов из водных разведений субстратов. Для этого через каждые 2-3 часа после посева учитывали количество вновь образовавшихся колоний, отмечая их маркером на обратной стороне чашки Петри. Это дало возможность по расписанию появления колоний определить такие параметры как вероятность образования колоний X, и время их появления на плотной питательной среде tr. В основе подхода лежит предположение Т. Хаттори о вероятностной природе процесса формирования колоний (Hattori, 1982; Ishikuri, 1985).
Образование колоний микроорганизмов на поверхности среды подчиняется закону редких событий Пуассона, причем вероятность появления отдельных колоний определяется уравнением (1): p=1_e-Wr) (1) Исходя из этого уравнения, число колоний на чашках Петри в любой момент t определяется уравнением (2). N(t) = N l-e" ] (t tr), (2) где N(t) - количество колоний в момент времени t; N - финальное число колоний; X - вероятность образования колоний отдельной клеткой популяции в единицу времени; tr - время задержки (включающее в себя lag-период и время до образования видимой невооруженным глазом колонии).
Зная расписание появления колоний, которое легко определить экспериментально путем подсчета через конкретный интервал времени количество вновь образовавшихся колоний, можно оценить величины параметров X и tr. Величины tr и X определяли методом наименьших квадратов по наблюдаемому в эксперименте расписанию появления колоний.