Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Представители класса Mollicutes: особенности биологии микоплазм и проблема контроля микоплазменных инфекций 13
1.1.1. Клеточная биология микоплазм и особенности организации клеток A. laidlawii PG8 16
1.1.2. Молекулярная биология микоплазм: геном, протеом и патогенность A. laidlawii PG8 20
1.1.3. Микоплазменная контаминация клеточных культур: феноменология, диагностика и подавление 28
1.2. Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам и внеклеточные везикулы бактерий 30
1.3. Молекулярно-генетические основы адаптации к антибактериальным препаратам и резистом микроорганизмов 40
Экспериментальная часть 51
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Культивирование A. laidlawii PG8В на искусственных питательных средах 51
2 .2. Получение различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii PG8B 52
2.3. Определение численности колониеобразующих единиц A. laidlawii PG8B 53
2.4. Микроскопический анализ клеток и внеклеточных везикул 53
2.4.1. Трансмиссивная электронная микроскопия 53
2.4.2. Атомно-силовая микроскопия 54
2.4.3. Сканирующая электронная микроскопия 55
2 .5. Определение эффлюкса ципрофлоксацина 55
2.6. Определение чувствительности A. laidlawii к антибиотикам
методом серийных разведений (определение МИК) 56
2 .7. Выделение и очистка внеклеточных везикул из культур различающихся по чувствительности к АБП штаммов A. laidlawii 56
2 .8. Определение содержания АБП во внеклеточных везикулах штаммов A. laidlawii 57
2.9. Анализ внеклеточных везикул A. laidlawii на генотоксичность 58
2.10. Протеомный анализ клеток и внеклеточных везикул A. laidlawii PG8B: электрофоретическое разделение и идентификация белков с помощью 1D-LC-ESI-MS/MS 58
2 .11. Определение внутриклеточной локализации и функций белков штаммов A. laidlawii 60
2 .12. Выделение и очистка нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из клеток и внеклеточных везикул A. laidlawii 60
2 .13. Реакции обратной транскрипции и амплификации нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР 61
2 .14. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 63
2 .15. Количественная ПЦР в реальном времени 63
2 .16. Клонирование и секвенирование нуклеотидных
последовательностей генов A. laidlawii 65
2 .17. Полногеномное секвенирование штаммов A.laidlawii 66
2 .18. Статистическая обработка полученных данных 67
Глава 3. Результаты и их обсуждение 68
3 .1. Штаммы A. laidlawii, различающиеся по чувствительности к ципрофлоксацину: получение и характеристика в отношении везикуляции и эффлюкса антибиотика 68
3 .2 Сравнительный анализ состава нуклеотидных последовательностей ДНК A. laidlawii во внеклеточных везикулах у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов микоплазмы 78
3 .3. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей ДНК клеток у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A.laidlawii 83
3.4. Сравнительный анализ протеомов клеток у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii 98
3 .5. Сравнительный анализ протеомных профилей внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii 103
3 .6. Сравнительный анализ генотоксичности внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A.laidlawii 109
Заключение 113
Выводы 118
Список литературы
- Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам и внеклеточные везикулы бактерий
- Определение численности колониеобразующих единиц A. laidlawii PG8B
- Сравнительный анализ состава нуклеотидных последовательностей ДНК A. laidlawii во внеклеточных везикулах у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов микоплазмы
- Сравнительный анализ протеомных профилей внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii
Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам и внеклеточные везикулы бактерий
Согласно размерам геномов, микоплазмы ассоциируют с самыми крошечными бактериями, способными к самостоятельному воспроизведению. Внедрение технологий секвенирования в рутинную практику молекулярно-биологических исследований определило возможность получения информации о геномах разных представителей класса Mollicutes. К настоящему времени в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) представлены сведения о полных нуклеотидных последовательностях ДНК 148 видов и штаммов микоплазм.
Нуклеоид микоплазм, как и у большинства других бактерий, представляет собой двунитевую кольцевую молекулу ДНК. Размер геномов у молликут колеблется от 564 т.п.о. для M. parvum до более чем 2000 т.п.о. для некоторых представителей Spiroplasma ssp (Razin, Hayflick, 2010; Nascimento et al., 2013). Представители таксонов Acholeplasma и Spiroplasma, которых считают наиболее древними микоплазмами, обладают более крупными геномами, по сравнению с Mycoplasma и Ureaplasma. Как уже отмечалось, существующие представители класса Mollicutes сформировались в результате совместной эволюции с организмом-хозяином, в процессе которой редуцировалась часть генетической информации, связанная с рядом метаболических путей. По данным биоинформационного анализа геномов, метаболизм микоплазм направлен главным образом на получение энергии и ряда компонентов извне, а не на самостоятельный биосинтез. Все известные на сегодняшний день микоплазмы имеют усеченные дыхательные пути (Борхсениус с соавт., 2016). Они лишены полного цикла трикарбоновых кислот и не имеют хинонов и цитохромов, что ограничивает использование окислительного фосфорилирования в качестве механизма получения АТФ. В целом энергетический потенциал микоплазм достаточно низок. При этом в процессе жизненного цикла микоплазм образуется большое количество конечных продуктов, токсичных для клетки хозяина (Razin, Hayflick, 2010). Несмотря на редукцию значительного количества генетической информации, связанной с биосинтетическими путями, в геноме микоплазм имеется достаточно информации как для паразитического образа жизни, так и выживания в экстремальных условиях среды (Liu et al., 2012). Поскольку A. laidlawii является уникальной микоплазмой с точки зрения адаптивности, исследования генома этой бактерии представляют особый интерес.
Геном A. laidlawii PG-8A соответствует 1496992 п.о. Количество Г+Ц пар в ДНК A. laidlawii составляет 31.9%, что несколько выше показателей у большинства представителей класса Mollicutes (21-31 мол%). Генетический код A. laidlawii PG8 не отклоняется от универсального – терминальный кодон УГА является стоп-кодоном, тогда как у других Mollicutes (Mycoplasmatales и Entomoplasmatales) этот кодон прочитывается как триптофан (Lazarev et al., 2011). ДНК A. laidlawii содержит как метилированные аденины (m6AP), так и цитозины (m5C) (Razin, 1980; Sladek, Maniloff, 1987), то есть модифицированные основания, характерные и для других микоплазм (Lluch-Senar et al., 2013), а также для про- и эукариот. Присутствие модифицированных оснований у микоплазм обусловлено сайт-специфичной метилируюшей активностью системы рестрикции и модификации. Это характерно не только для микоплазм, но и ряда других бактерий, в том числе патогенных для человека (Salmonella enterica, Escherichia coli O157:H7, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Yersinia enterocolitica, Haemophilus influenza, Campylobacter jejuni, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Streptococcus mutans, Mycobacterium tuberculosis), животных и птиц (Pasteurella multocida, Brucella abortus), а также рыб, рептилий и амфибий (Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda) (Marinus, Casadesus, 2009; Sanchez-Romero et al., 2015). Полная нуклеотидная последовательность генома A. laidlawii PG-8А была определена в 2007 году, опубликована в 2011 (Lazarev et al., 2011), а последние коррективы в аннотацию внесены в 2015 году. Согласно представленным в базе данным (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010163.1), геном A. laidlawii PG-8А включает 1433 гена, которые кодируют 1380 белков (96% кодирования), в том числе 6 генов рРНК-оперона (16S-23S-5S), 34 – тРНК, 6 – рРНК, организованных в 2 оперона: rrnA и rrnB.
У A. laidlawii, как и у других микоплазм, регистрируется усечение генетической информации в отношении некоторых значимых путей биосинтеза. У этой микоплазмы отсутствуют гены полного цикла трикарбоновых кислот. Она получает энергию при гидролизе сахаров (в основном, глюкозы) путем гликолиза. В качестве альтернативного способа превращения глюкозы микоплазма может использовать путь Энтнера – Дудорова, а также и пентозофосфатный путь, гены всех ферментов которого в геноме A. laidlawii, в отличие от других молликут, идентифицированы.
А. laidlawii, как и многие другие микоплазмы, способна катаболизировать не только глюкозу, но и D-фрукто-1-фосфат, производные маннозы, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилманнозамин, галактозу и другие сахара и аминосахара. Кроме того, в геноме А. laidlawii PG-8А присутствуют гены ферментов, определяющих возможность расщепления крахмала до глюкозы-6-фосфата и метаболизации конечных продуктов гликолиза - гликоген-фосфорилаза и альфа-амилаза (Lazarev et al., 2011). Гены, определяющие этот путь, а также способность использовать крахмал в качестве источника углерода, в геномах других микоплазм не обнаружены.
Клетки A. laidlawii способны синтезировать de novo каротиноиды используя ацетил-КоА и ацетоацетил-КоА - все гены соответствующих ферментов этого метаболического пути были аннотированы в геноме микоплазмы. Каротиноиды могут частично выполнять функции холестерина при его отсутствии в среде, поддерживая вязкость и текучесть плазматической мембраны A. laidlawii. Весьма неожиданным оказалось присутствие в геноме A. laidlawii генов ферментов, обеспечивающих биосинтез ундекапренилфосфата, встречающегося в клеточных стенках эубактерий (Lazarev et al., 2011). Наличие соответствующих генов у A. laidlawii представляет значительный интерес с точки зрения особенностей филогении микоплазмы, функциональной значимости соответствующих ферментов у бесстеночной бактерии, а также горизонтального переноса генов и взаимосвязи бактерий в микробиоценозе (Борхсениус с соавт., 2016).
Определение численности колониеобразующих единиц A. laidlawii PG8B
Амплификацию, клонирование и сиквенс ампликонов нуклеотидных последовательностей ряда генов проводили согласно описанному ранее протоколу (Chernov et al., 2012). Наработанные фрагменты ДНК исследуемых нуклеотидных последовательностей генов были очищены от компонентов ПЦР смеси с использованием коммерческого набора NucleoSpin Gel and PCR Clean up (MACHEREY-NAGEL, Германия). Клонирование ампликонов проводили в плазмиде pGEM Easy Vector (Promega, США), согласно инструкции фирмы изготовителя. Реакцию лигирования осуществляли согласно pGEM and pGEM T Easy Vector Systems Technical Manual. Для трансформации были использованы компетентные клетки штамма E. coli NovaBlue, подготовленные согласно Маниатис с использованием DMSO (Маниатис с соавт., 1984). К размороженным во льду непосредственно перед трансформацией компетентным клеткам добавляли 4 мкл ДНК, перемешивали и инкубировали во льду 15 мин. Тепловой шок проводили прогреванием клеток при 42С в течение 30 секунд. Клетки охлаждали во льду в течение 2 мин, добавляли 5 V SOC (2% пептон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкозы) и инкубировали при 37С в течение 60 мин. Образование трансформантов контролировали путем высева 100 мкл смеси на агаризованную LB-среду (1% пептон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) с добавлением 12.5 мг/мл тетрациклина (Tet), 100 мкг/мл ампициллина (Amp) и отбором устойчивых к Tс и Ap колоний после инкубации при 37С в течение ночи. Вставку фрагмента ДНК в плазмиде pGEM детектировали с помощью ПЦР с использованием специфичных к нуклеотидной последовательности вставки праймеров. Плазмидная ДНК была выделена согласно Li (Li et al., 2002). Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США). Секвенирование проводили с использованием набора BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, США), согласно инструкции фирмы изготовителя, как описано ранее (Чернов с соавт., 2013). Нуклеотидные последовательности ДНК определяли с помощью ДНК-анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили в программе Sequencing Analysis 5.3.1 (Applied Biosystems, США) и пакете программ Informax Vector NTI Suite 9, а также с использованием базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) и алгоритма Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Секвенирование геномов различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii PG8В проводили на ДНК-секвенаторе нового поколения GS Junior (Roche Diagnostics, Швейцария) как описано (Margulies et al., 2005). Выделенная из клеток микоплазмы ДНК фрагментировалась с помощью небулизатора (Invitrogen) при давлении азота 30 psi в течение 1 минуты. Полученные фрагменты были очищены на колонках MiniElutePCR Purification kit (Qiagen, Германия). Лигирование адапторов и фрагментов хромосомной ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы изготовителя. Качество полученных библиотек оценивали с помощью чипов прибора 2100 Bioanalyzer (Agilent, Англия). Концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen) и при необходимости разводили до рабочей концентрации 1x107 молекул/мкл. Эмульсионную ПЦР с библиотекой ДНК (из расчета 1-2 молекулы ДНК на 1 бусину) проводили в следующем режиме: 94 С – 4 мин, 50 циклов (94 С – 30с, 58 С – 270с, 68 С – 30с), материал хранили при 10 С. Сбор эмульсии, отмывка и отбор насыщенных частиц осуществлялись согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (Roche, Швейцария). На завершающем этапе проводили отжиг праймера для секвенирования на полученные обогащенные бусины, количество которых оценивали с помощью счетчика частиц (Roche, Швейцария). На пластину для секвенирования наносили 500 тыс. обогащенных бусин. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили в программе Sequencing Analysis 5.3.1 (Applied Biosystems, США), а также с использованием базы данных NCBI (National Center for Biotechnology Information). Сборка ДНК последовательностей de novo выполняли с использованием программного пакета Newbler (Roche Diagnostics, Швейцария), выравнивание нуклеотидных последовательностей – с использованием Bowtie2 (http://bowtie bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml), а поиск и аннотация однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) – с использованием Samtools (http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml) и SnpEff (http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff. html) соответственно.
Статистическую обработку данных выполняли с помощью программного обеспечения MS Excel (Microsoft) и Origin 8.0, используя средние и стандартные отклонения (М±s). Сравнение средних значений проводили по критерию Стьюдента. При сравнении количества клеток в классах использовали критерий (p). Достоверность различий оценивали с помощью 95% доверительного интервала для генерального значения частоты, который вычисляли с помощью точной формулы с использованием F-распределения (Животовский, 1991). Достоверным считали различия при р 0,05. При множественных сравнениях применяли поправку Бонферрони (Гланц, 1999). Статистически значимыми считали результаты меньше порогового уровня значимости, определенного с учетом поправки Бонферрони (р 0,01).
Сравнительный анализ состава нуклеотидных последовательностей ДНК A. laidlawii во внеклеточных везикулах у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов микоплазмы
В везикулах A. laidlawii PG8ВCIP+ были обнаружены белки универсального каскада стрессового ответа бактерий – SOS-ответа (RecA), деления клетки (FtsZ), метаболизма АФК (Cdr), электрон-транспортной цепи (NtpB1) и Fe-S кластера (SufB), которые не были выявлены в ВВ A. laidlawii PG8BCIP-; в везикулах A. laidlawii PG8SCIP- были обнаружены белки метаболизма АФК (Cdr) и электрон-транспортной цепи (NtpB1). В везикулах A. laidlawii PG8R10CIP+ белки стрессового ответа бактерий не обнаружены. Полученные данные могут указывать на существенные различия стресс-реактивности штаммов A. laidlawii PG8B и A. laidlawii PG8R10, ассоциированной с везикулярным трафиком.
Среди белков, идентифицированных в везикулах A. laidlawii PG8R10CIP+ и A. laidlawii PG8SCIP-, два белка - пептидаза U35 (ACL_0611), связывающая белки капсида вирусов (Cheng et al., 2004) и ComEC-подобный белок (ACL_0895), определяющий генетическую трансформацию у бактерий (Friedrich et al., 2001), представляют особый интерес с точки зрения возможности вовлечения генетической трансформации, горизонтального переноса генов в механизмы адаптации микоплазмы к стрессорам (Chattopadhyay, Jagannadham, 2015).
Значительная часть белков, выявленных в везикулах у штаммов микоплазмы, представляют факторы вирулентности (38%, 50%, 41%, 74%, 50% у A.laidlawii PG8ВCIP-, A.laidlawii PG8ВCIP+, A.laidlawii PG8R10CIP+, A.laidlawii PG8R10CIP-, A.laidlawii PG8SCIP- соответственно (Приложение 8)). При этом в везикулах штаммов A. laidlawii PG8BCIP-, A. laidlawii PG8R10CIP-, а также A. laidlawii PG8SCIP регистрируется глобальный регулятор вирулентности – полирибонуклеотид-нуклеотидилтрансфераза (PNPase) (Carpousis, 2002), тогда как в везикулах A. laidlawii PG8R10CIP+ и A. laidlawii PG8BCIP+ этот белок не обнаруживается. PNPase участвует в инвазии бактериальных патогенов и их внутриклеточной репликации (Clements et al., 2002). Отсутсвие соответсвующего белка в везикулах указанных штаммов может отражать изменение стратегии патогенов в присутствии АБП. Снижение вирулентного потенциала при адаптации к АБП показано для ряда микроорганизмов (Martnez, Baquero, 2002; Beceiro et al., 2013). Так ли это для A. laidlalwii, еще предстоит выяснить.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что протеомные профили везикул штаммов A.laidlawii PG8ВCIP-, A.laidlawii PG8ВCIP+, A.laidlawii PG8R10CIP+, A.laidlawii PG8R10CIP-, A.laidlawii PG8SCIP- различаются как в количественном, так и качественном отношении. Значительная доля везикулярных белков у всех штаммов микоплазмы связана с факторами бактериальной вирулентности, и различия в их спектре могут определять дифференциальность патогенного потенциала соответствующих инфектов.
Сравнительный анализ генотоксичности внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii Ранее было установлено, что A. laidlawii обладает токсигенным и мутагенным потенциалом (Chernov et al., 2011а; Chernov et al., 2014). При этом везикулы микоплазмы (A. laidlawii PG8BCIP-) могут проявлять мутагенный эффект в отношении лимфоцитов периферической крови человека in vitro (Chernov et al., 2011а). Однако сведения о генотоксичных свойствах ВВ бактериальных штаммов с дифференциальной чувствительностью к АБП в литературе отсутствуют. В этой связи сравнительный анализ генотоксичности внеклеточных везикул, продуцируемых клетками различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A.laidlawii, явился задачей нашей работы. Важным показателем при оценке генотоксичности различных соединений может служить пролиферативная активность клеток (Прохорова с соавт., 2003). Наличие митотоксичного или митозостимулирующего действия ВВ, продуцируемых клетками штаммов A. laidlawii, в нашей работе оценивали по уровню митотической активности лимфоцитов периферической крови человека – митотическому индексу (МИ), который показывает соотношение числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу проанализированных клеток изучаемой ткани, а в случае лимфоцитов – способности к трансформации их до бластов и делению, а мутагенное действие везикул микоплазмы – по частоте хромосомных и геномных нарушений в метафазных пластинках лимфоцитов периферической крови человека (см. главу 2 Материалы и Методы).
В результате проведения соответствующих исследований нами было обнаружено, что ВВ A. laidlawii PG8В, A. laidlawii PG8R10 и A. laidlawii PG8S могут проявлять генотоксичные свойства в отношении лимфоцитов периферической крови человека – индуцировать геномные нарушения (гипоплоидия) и подавление митотической активности клеток эукариот (Рисунок 3.6.1, 3.6.2, Приложение 9). Однако степень вирулентных свойств у штаммов различается. Развитие устойчивости к ципрофлоксацину у микоплазмы сопровождается повышением митотоксичности и снижением мутагенности.
Сравнительный анализ протеомных профилей внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii
Большой интерес, проявляемый сегодня к представителям класса Mollicutes, в значительной мере обусловлен уникальностью мельчайших прокариот в отношении адаптивных свойств, определяющих широкое распространение этих бактерий в природе, успешное преодоление защитных механизмов высших эукариот и выживание в экстремальных условиях (Борхсениус с соавт., 2016; Liu et al., 2012). Внедрение омикс-технологий в практику биологических исследований обеспечило новые возможности определения молекулярных основ адаптации микроорганизмов. В результате комплексного подхода, основанного на использовании классических и современных методов физико-химической биологии, впервые был выполнен сравнительный анализ штаммов A.laidlawii, проявляющих дифференциальную чувствительность к ципрофлоксацину – широко используемому для подавления микоплазм АМП группы фторхинолонов. Полученные нами результаты свидетельствуют, что A.laidlawii – высокопластичная бактерия, оперативно и стресс-специфично отвечающая на вызовы извне. Это соответствует представлениям о тахителичности микоплазм, отличающихся повышенным мутационным темпом, и ответных реакциях бактерий на стрессоры: стрессор – ДНК-повреждения, вызванные АФК, – индукция SOS-репарации, обусловливающая задержку деления клеток (связывание FtsZ белков), мутагенез и горизонтальный перенос генов, важным посредником которого являются внеклеточные везикулы.
Согласно данным сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей штаммов A.laidlawii с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину, а также штамма A.laidlawii PG-8A, геном которого был секвенирован в 2007 году (Lazarev et al., 2011), геномные профили штаммов микоплазмы весьма различаются (Рисунок 3.7.1). Мутационный паттерн относительно специфичен для каждого случая – у сравниваемых образцов имеются как уникальные, так и общие мутации. При этом существенная часть геномных отличий у штаммов затрагивает гены, продукты которых участвуют в фундаментальных клеточных процессах, включая репликацию, репарацию и рекомбинацию, а также ответные реакции бактерий на действие стрессоров (SOS ответ, ингибирование деления клеток, метаболизм АФК, активация двухкомпонентной системы трансдукции сигналов и электрон-транспортной цепи, разрушение Fe-S кластеров) и реализации вирулентности. Мутабильность соответствующих генов наряду с особенностями структуры генома микоплазмы, могут в значительной мере способствовать ремоделированию генома этой бактерии (Lazarev et al., 2011; Darmon, Leach, 2014). Мобилом штаммов A .laidlawii PG8В, A .laidlawii PG8R10 и A .laidlawii PG8S представлен двумя инсерционными последовательностями, принадлежащими к IS3/IS150/IS904 семействам, а также двумя рекомбиназами XerDC семейства.
Поскольку у микоплазмы отсутствуют CRISPRs и токсин-антитоксиновая система, мобилом A .laidlawii может быть в значительной мере связан с ВВ. У штаммов микоплазмы с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину были обнаружены существенные различия не только в клеточном, но и в везикулярном протеоме. Высокий уровень различий геномного и протеомного профилей у штаммов микоплазмы с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину указывают на то, что формирование устойчивости микроорганизмов к АБП, по-видимому, обеспечивается более сложным, чем предполагалось ранее, механизмами, которые определяют глобальные изменения клеточных процессов и патогенности микроорганизмов. При этом оказалось, что везикулы A.laidlawii транспортируют копии нуклеотидных последовательностей ряда генов микоплазмы, и мутационные события в геноме соответственно проявляются в везикулярном пуле. Опосредованный везикулами транспорт мутантных генов целевых белков фторхинолонов (Рисунок 3.2.1) может указывать на вовлечение ВВ в формирование резистентности микоплазм к АБП. Поскольку продуцирование ВВ является фундаментальным клеточным процессом, система контроля бактерий, основанная на использовании антибиотиков, представляется проблематичной. Перспективы эффективного контроля инфектов связывают сегодня с развитием CRISPRs-технологий.
В результате сравнительного анализа данных, полученных в этой работе, а также исследований реактивности A. laidlawii на разные виды стрессоров (воздействие низкой температуры, тепловой шок, голодание, окислительный стресс, совместное культивирование с другими бактериями) нами были выявлены универсальные стресс-реактивные белки и гены микоплазмы - GidA, PolC, TopA, MutL, FtsH и, соответственно, gidA, polC, topA, mutL, ftsH. Вовлечение их в адаптацию микоплазмы к разным условиям среды, ассоциированную с модуляцией геномного и протеомого профилей, определяет таргетный потенциал соответствующей батареи генов в системе CRISPRs-инструментов. Для оценки перспективности этой системы для элиминации микоплазм необходимы специальные исследования.
В таблице 3.7.1 представлены гены и белки A.laidlawii, которые, согласно анализу массива данных, полученных в нашем исследовании, с высокой сокой долей вероятности могут участвовать в развитии устойчивости микоплазмы к ципрофлоксацину. Вместе с тем, очевидно, что адаптация микоплазмы к АБП, как и у других бактерий, связана с работой генных сетей, в которые вовлечены сотни генов, обеспечивающих динамичное равновесие процессов в бактериальной клетке и оперативное репрограммирование их в различных условиях среды. Исследования этих сетей только начинаются, и перспективы их в значительной мере связаны с развитием методов высокого разрешения.