Введение к работе
Актуальность исследования. Еще в начале XX века российский ученый И.И. Мечников впервые начал активно пропагандировать использование молочнокислых бактерий (lactic acid bacteria, LAB) в лечебно-профилактических целях. Он создал предпосылки для формирования нового научного направления, включающего изучение межмикробного антагонизма и оценку влияния LAB на организм хозяина, сформулировал основные постулаты для зарождающейся в наши дни научной дисциплины «пробиотической микробиологии» [Нынь И.В.и Королюк А.М., 2008]. Несмотря на длительное и достаточно успешное использование пробиотических пищевых продуктов и препаратов, их активное, но часто бесконтрольное применение в последние десятилетия привело к возникновению ряда серьезных проблем. Среди них можно указать: низкую эффективность действия некоторых препаратов, угнетение собственной микрофлоры хозяина, развитие инфекционной патологии при введении пробиотиков ослабленным больным [Lebenthal E., Lebenthal Y., 2003; Land M.H. et al., 2005]. Становится очевидным, что для увеличения эффективности лечебно-профилактического использования и предотвращения развития побочных эффектов LAB должны вводиться с учетом индивидуальных характеристик пациента и по назначению врача. Именно поэтому в настоящий момент как никогда остро встал вопрос о необходимости серьезных комплексных научных исследований особенностей действия молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микробиоту.
К числу LAB относят два рода бактерий, явившихся предметом настоящего исследования,- Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.. [Axelsson L., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Эти микроорганизмы представляют особый научный и практический интерес, так как являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных, широко распространены во внешней среде, входят в состав многих пробиотических препаратов и продуктов. Известно, что энтерококки и лактобациллы могут оказывать разностороннее влияние на биохимические, физиологические, нейрогуморальные и иммунные процессы в организмах человека и животных [Шендеров Б.А., 2005; Goldin B.R. and Gorbach S.L., 1984; Maldonado G. et al., 2007; Preter V. et al., 2007]. Эти бактерии участвуют в поддержании колонизационной резистентности и гомеостаза, нормализуют содержание в организме углеводов, желчных кислот, холестерина, осуществляют синтез витаминов и других биологически активных соединений [Gibson G.R. et al., 1995; Доронин А.Ф.и Шендеров Б.А., 2002]. Некоторые штаммы энтерококков и лактобацилл способны продуцировать в окружающую среду такие продукты, как перекись водорода, лизоцим, бактериоцины и бактериоциноподобные субстанции, конкурировать с патогенными микроорганизмами за пищевые субстраты и сайты прикрепления к клеткам [Reid G., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Основным требованием, предъявляемым к пробиотическим штаммам LAB, является наличие выраженной антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам [Reid G., 2008]. Это позволяет использовать пробиотики для усиления или коррекции эффектов антибиотиков, а в ряде случаев - как их альтернативу. На основании большого числа клинических наблюдений можно полагать, что пробиотики практически незаменимы при терапии дисбиотических состояний, болезни Крона, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Ткаченко Е.И. и Успенский Ю.П., 2006]. Кроме того, LAB активно используются при терапии сахарного диабета, аллергических заболеваний [Prescott S. and Bjrkstn B., 2009], ишемической болезни сердца, коррекции нарушений липидного и минерального обменов [Гриневич В.Б. и др., 2004]. Наряду с пероральным введением молочнокислых бактерий целесообразно их местное использование при вагинитах, тонзиллитах и стоматитах [Reid G. et al., 2004; Elmer G.W., 2001; Maldonado G. et al., 2007].
Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении LAB, многое до сих пор остается неясным. Неизвестно, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, какое действие они оказывают на отдельные ткани состояние отдельных систем и макроорганизм в целом. Обнаружены существенные различия в спектрах антибактериального действия различных штаммов молочнокислых бактерий, а также в их способности влиять на систему иммунитета и метаболические процессы, происходящие в организме человека и животных. Возможность соматической патологии пациента и особенности собственной микрофлоры хозяина делают необходимым индивидуальный подбор пробиотиков. Отсутствие стандартных методов исследования пробиотиков затрудняет сравнительный анализ различных штаммов молочнокислых бактерий и их паспортизацию. В связи с этим разработка методологии сравнительного исследования пробиотических культур, а также изучение особенностей их действия в системах in vitro и in vivo, являются актуальной проблемой современной микробиологии.
Целью настоящей работы является изучение особенностей влияния молочнокислых бактерий на микробиоту и макроорганизм, а также разработка стратегии максимально эффективного использования пробиотических штаммов LAB для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных стрептококками и другими патогенными микроорганизмами.
1. Разработать комплекс методических подходов для исследования влияния LAB на
патогенные микроорганизмы, нормальную микрофлору и макроорганизм.
2. Провести сравнительное исследование антагонистической активности культур LAB в отношении различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, грибов родов Candida и Cryptococcus, а также вирусов простого герпеса.
3. Исследовать геномы LAB, обладающих антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий и грибов, на наличие известных генов бактериоциногенности.
4. Изучить влияние антимикробных пептидов, продуцируемых LAB, а также искусственно синтезированных аналогов бактериоцинов на рост и морфофизиологические особенности патогенных микроорганизмов.
5. Провести анализ экспрессии генов бактериоциногенности LAB и исследовать влияние специфических пептидных индукторов на антибактериальную активность молочнокислых бактерий.
6. Исследовать в модельных условиях воздействие штаммов LAB и аутопробиотических энтерококков на клинические симптомы, метаболические процессы, иммунитет и микробиоту кишечника лабораторных животных при дисбиозе, вызванном приемом антибиотиков, а также при терапии урогенитальных инфекций.
Предложен комплекс методов (микробиологических, биохимических, генетических, иммунологических, гистологических, электронно-микроскопических) для разностороннего изучения воздействия LAB на макроорганизм и заселяющую его микрофлору.
Проведено сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников. Благодаря введению нового количественного показателя удалось охарактеризовать степень антагонистической активности различных штаммов энтерококков и лактобацилл в отношении широкого круга индикаторных микроорганизмов (грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, а также грибов рода Candida и Cryptococcus). Впервые выявлена способность метаболитов лактобацилл и энтерококков угнетать рост микоплазм и репродукцию вирусов простого герпеса в системе in vitro.
Разработаны новые модели экспериментального дисбиоза и бактериального вагинита. При их использовании впервые установлены особенности влияния различных культур LAB на клинические симптомы, микробиоту, показатели иммунитета, тонкие морфологические изменения в тканях животных.
Впервые исследована степень влияния пробиотических штаммов, в частности, молочнокислых бактерий, на метаболические процессы, происходящие в разных отделах желудочно-кишечного тракта.
Впервые на биологической модели доказана эффективность использования индигенных (аутопробиотических) энтерококков для коррекции дисбиозов у животных.
Впервые выявлено действие искусственно синтезированного энтероцина В и его аналога на грамотрицательные бактерии, проявляющееся в ингибировании роста E. coli и повреждении их цитоплазматических мембран.
Выявлены штаммовые особенности действия метаболитов энтерококков и лактобацилл на морфологию S. pyogenes.
Теоретическое значение работы заключается в том, что диссертантом предложен новый подход для исследования влияния LAB на организм млекопитающих и их микрофлору. В результате удалось значительно дополнить имеющиеся представления об особенностях распространения молочнокислых бактерий в организме и возможности колонизации ими слизистых оболочек урогенитального и желудочно-кишечного трактов.
Установлено, что воздействие пробиотиков на организм сопровождается существенными сдвигами, как в сторону стимуляции, так и в сторону ингибирования реакций иммунной системы, а также пристеночного и просветного пищеварения на разных уровнях желудочно-кишечного тракта. Характер влияния вводимых пробиотических культур зависит от их индивидуальных особенностей, а также от наличия или отсутствия инфекционной патологии. Эти данные имеют большое значение для понимания сложного комплекса взаимодействий макроорганизма и его микробиоты, а также выбора пробиотика в зависимости от клинического диагноза и этиологии заболевания.
Полученные результаты важны для развития медицинской, а также ветеринарной микробиологии, открывают перспективы широкого практического использования и дальнейшего изучения LAB.
Прикладными аспектами исследования являются разработанные на основе экспериментальных данных: 1) метод двухслойного агара с количественной и качественной оценкой антимикробной активности молочнокислых бактерий in vitro; 2) комплексный подход в исследования прямого и опосредованного антимикробного действия in vivo, с учетом влияния LAB на патогенные микроорганизмы, микробиоту хозяина, метаболизм и иммунную систему макроорганизма.
В ходе сравнительного исследования клинических изолятов из урогенитального тракта выбран и идентифицирован новый штамм LAB, L. fermentum Z, предложенный для использования в составе пробиотических препаратов или пищевых продуктов [Заявка на изобретение № 2008133794 от 15.08.08]. Его отличительной особенностью является избирательное действие в отношении патогенных микроорганизмов, отсутствие влияния на другие LAB, в частности E. faecium L3. При исследовании антимикробного эффекта эти молочнокислые бактерии выступают, как синергисты и могут быть рассмотрены в качестве компонентов нового симбиотического препарата.
Исследование влияния аутопробиотических энтерококков на организм животных при дисбиозе кишечника может рассматриваться как предварительный экспериментальный этап перед комплексным исследованием перспектив применения в клинической практике собственной микрофлоры.
Результаты исследований могут быть использованы при клиническом назначении пробиотиков с целью защиты и профилактики заболеваний инфекционной природы. Применение пробиотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой, изложено в методических рекомендациях, утвержденных методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины».
Модифицированный метод двухслойного агара применяется в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И. Мечникова для изучения микробного антагонизма, на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины».
Результаты диссертационного исследования используются при чтении лекций и проведения практических занятий по микробиологии на медицинском факультете Санкт-Петербургского Государственного университета.
