Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa и методы его выявления 14
1.2 Применение моноклональных и поликлональных антител для терапии синегнойной инфекции 24
1.3 Применение моноклональных антител для диагностики синегнойной инфекции 30
1.4 Заключение 35
Глава 2 Материалы и методы 36
2.1 Оборудование и материалы 36
2.1.1 Бактериальные штаммы и клеточные линии 36
2.1.2 Лабораторные животные 38
2.1.3 Антигены и антитела 38
2.1.4 Оборудование 38
2.1.5 Реактивы 39
2.2 Методы 40
2.2.1 Получение рекомбинантных вариантов экзотоксина А 40
2.2.2 Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли 41
2.2.3 Иммуноблоттинг 42
2.2.4 Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител 42
2.2.5 Замораживание гибридных клеток 43
2.2.6 Культивирование гибридных клеток in vivo 43
2.2.7 Иммуноферментный анализ 44
2.2.8 Цитотоксический тест 46
2.2.9 Реакция нейтрализации цитотоксичности 47
2.2.10 Иммунодот вариант иммуноферментного анализа 47
2.2.11 Выращивание Pseudomonas aeruginosa (штамм PA 103) на питательных средах различного состава 48
2.2.12 Культивирование и хранение штаммов P. aeruginosa 48
2.2.13 Хроматографическая очистка моноклональных антител 50
2.2.14 Иммунизация животных 50
2.2.15 Конъюгирование антител с пероксидазой хрена 51
2.2.16 Выявление ЭТА в полимеразной цепной реакции 52
2.2.17 Статистические методы 53
Основная часть 54
Глава 3 Получение и оценка свойств моноклональных антител к ЭТА Pseudomonas aeruginosa 54
3.1 Получение рекомбинантных форм ЭТА 54
3.2 Получение первичных гибридных культур-продуцентов антител к экзотоксину А P. aeruginosa 56
3.3 Тестирование и отбор первичных гибридных культур 58
3.4 Тестирование МА в иммунодот варианте иммуноферментного анализа. 62
3.5 Изучение цитотоксичности рекомбинантных вариантов ЭТА 64
3.6 Определение токсиннейтрализующей активности моноклональных антител 66
3.7 Заключение 71
Глава 4 Применение моноклональных антител для выявления ЭТА 74
4.1 Взаимодействие моноклональных антител с растворённым антигеном 74
4.2 Сравнительная характеристика токсинообразования P. aeruginosa при культивировании на различных питательных средах . 76
4.3 Выявление экзотоксина А у клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa в тестах на культуре клеток 79
4.4 Применение МА для выявления ЭТА P. aeruginosa в иммуноферментном анализе 83
4.5 Выявление ЭТА P. aeruginosa в полимеразной цепной реакции 89
4.6 Сравнительная характеристика методов выявления ЭТА P. aeruginosa93
Заключение 97
Список литературы 102
- Применение моноклональных и поликлональных антител для терапии синегнойной инфекции
- Получение рекомбинантных вариантов экзотоксина
- Тестирование и отбор первичных гибридных культур
- Сравнительная характеристика токсинообразования P. aeruginosa при культивировании на различных питательных средах
Применение моноклональных и поликлональных антител для терапии синегнойной инфекции
Известно, что поглощение железа является одним из важнейших процессов для P. aeruginosa, определяющих способность возбудителя колонизировать организм хозяина. Для этого бактерии производят сидерофоры, такие как пиовердин, хелатирующие ионы железа [44]. Известно, что ограничение количества ионов железа стимулирует синтез ЭТА. Последние данные показывают, что существует связь синтеза ЭТА с метаболизмом глюкозы. Начальная стадия метаболизма глюкозы происходит в периплазме и включает в себя окисление глюкозы в 2-кетоглюконат, который поступает в цитоплазму и в дальнейшем метаболизируется. 2-кетоглюконат способен связываться с репрессором транскрипции белка PtxS. В отсутствии 2-кетоглюконата две молекулы PtxS связаны с димером регулятора PtxR, который, в свою очередь, связыватся с -35 регионом промотора и тем самым ингибирует транскрипцию ЭТА. Как только поступает 2-кетоглюконат, PtxS диссоциирует из комплекса PtxR/ДНК и РНК-полимераза может прикрепляться к промотору и cтимулировать транскрипцию матричной РНК [47] (Рисунок 3). После цитоплазматической экспрессии белок-предшественник ЭТА, состоящий из 638 аминокислотных остатков, транспортируется в периплазму с использованием Sec механизма. Во время транслокации через внутреннюю мембрану N-концевой сигнальный пептид (25 аминокислотных остатков) отщепляется и ЭТА поступает в периплазматическое пространство. В гидрофильной среде периплазмы ЭТА сворачивается таким образом, что распознаётся компонентами II типа секреции (T2SS) и секретируется в межклеточную среду [63].
После секреции во внеклеточную среду, экзотоксин расщепляется карбоксипептидазой, в результате чего удаляется С-концевой остаток лизина и становится доступной терминальная аминокислотная последовательность REDL [71]. Впоследствии ЭТА связывается с 2-макроглобулиновым рецептором, СD91 (LRP1 или LRP1b) и попадает в клетки клатрин-зависимым (посредством клатрин-окаймлённых пузырьков) и клатрин-независимым механизмами (посредством кальвеосом) [152]. В эндосоме полипептидный каркас между А и В фрагментами расщепляется фуриновой эндопротеазой (КФ 3.4.21.75), циркулирующей между плазматической мембраной и транс-гольджи сетью, в богатой аргинином петле в начале домена II (между 279 и 280 аминокислотными остатками) [59, 121].
Если расщепления не происходит (в результате дефектов в структуре токсина и т.п.), токсин попадает в лизосому, где происходит его деградация, так например, линии, дефицитные по фурину, более устойчивы к действию токсина, а токсин, предварительно обработанный фурином, более активен в проявлении цитотоксического эффекта [110]. После расщепления полипептидного каркаса белок, однако, не распадается до тех пор, пока также не будет разрушена дисульфидная связь между цистеинами 265 и 287, что происходит благодаря действию протеин-дисульфидной изомеразы и ЭТА разделяется на 2 фрагмента с молекулярной массой 28 (субъединица В) и 37 кДа (III домен, субъединица А) [168].
Если происходит эффективное расщепление, фрагмент токсина с молекулярной массой 37 кДа оказывается в комплексе Гольджи, используя Rab9 зависимый путь, где контактирует с KDEL рецепторами, распознающими RDEL последовательность, что служит сигналом для его транспортировки в эндоплазматический ретикулум (ЭПР) ретроградным транспортом.
Также существует альтернативный путь попадания ЭТА в эндоплазматический ретикулюм липид-зависимым путём. Этот путь осуществляется за счёт связывания ЭТА с CD91 при помощи детергент-резистентных микродоменов. Комплекс рецептора с токсином транспортируется с помощью кальвеосом в ранние эндосомы Rab5-зависимым способом. После расщепления фрагмент с молекулярной массой 37 кДа попадает в комплекс Гольджи Rab9-независимым путём, а затем липид-зависимым Rab6 путём в ЭР [152] (Рисунок 3 [107]).
Исследования, проведённые на печени крыс, показали, что ассоциация с плазматическими мембранами клеток происходит уже через 5-10 мин, интернализация внутрь эндосом – через 15-60 мин (по другим данным через 10 мин), а транслокация в цитозоль – через 30-90 мин [65, 120]. Фрагмент А после расщепления транспортируется в цитозоль посредством Sec61p транслокона. Имеется альтернативное предположение, что ЭТА транслоцируется непосредственно из кислых внутриклеточных везикул в цитозоль, подобно дифтерийному токсину [105, 113] (Рисунок 3).
В цитозоле ЭТА опосредует необратимую инактивацию eEF2, катализирующего координированное движение растущей полипептидной цепи вдоль рибосомы, переносом АДФ-рибозильной группы, полученной от НАД+, на остаток дифтамида, что приводит к остановке белкового синтеза вплоть до клеточной гибели. АДФ-рибозильный остаток переносится на n3 атом остатка дифтамида с использованием Sn1 механизма [165].
Получение рекомбинантных вариантов экзотоксина
Агар-агар бактериологический («Difco», Кат. № 214010.0454), cреда Лурия-Бертани LB («Amresco», Am-J106-2,0), изопропил--D-галактопиранозид (ИПТГ) («Thermo scientific», кат. № R0393), мочевина («Amresco», кат. № Am-O378-5.0), Ni-сефароза («GE Healthcare»), ПЭГ 4000 («Sigma», кат. № 95904), питательная среда ДМЕМ («ПанЭко», кат. № С415), сыворотка плода коровы («ПанЭко», кат. № К061м), CNBr-4Br (GE Healthcare, кат. № 17-0430-01), RPMI 1640 («ПанЭко», кат. № С363), ДМСО («Amresco», кат. № Am-O231-0.1), Pristane («Sigma» кат. № P2870), PBS («Amresco», кат. № Е404-200), Tween-20 («Promega», кат. № H5151), антивидовые антитела к иммуноглобулинам G, M и А мыши меченые пероксидазой хрена («Имтек», кат. № P-RAM Iss), ТМБ (НПО «Био Тест Системы»), обезжиренное молоко («AppliChem», кат. № 271-045-3), имидазол («Quagen», кат. № 1000658), нитроцеллюлозная мембрана («Bio-Rad», кат 162-0147), кроличьи антитела против ЭТА Pseudomonas aeruginosa («Sigma» P2318); питательный агар- ГРМ-агар (ПА) («ФБУН ГНЦ ПМБ»), мясо-пептонный бульон (МПБ) («ФБУН ГНЦ ПМБ»), RPMI 1640 (ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова»), белковый весовой маркер #SM0671 («Fermentas»), Taq-полимераза («Fermentas»), набор для выделения геномной ДНК Thermo Scientific «GeneJET Genomic DNA Purification Kit #K0722», дНТФ (концентрация 10 мМ/мкл, «Promega»), Taq-ДНК-полимераза («Fermentas»).
Рекомбинантный ЭТА (ToxA) и его атоксичные формы (aTox1— состоящий из домена I ЭТА, aTox2— состоящий из доменов I и II, aTox3— состоящий из доменов I, II и III с делецией 106 аминокислотных остатков получали в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории протективных антигенов «ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова» [10] c некоторыми модификациями: единичной колонией штамма-продуцента (E. coli BL-21) соответствующего рекомбинантного белка, взятой с плотной питательной среды LB (15 г агар-агара бактериологического «Difco» на 1 л LB «Amresco» инокулировали 5 мл жидкой среды LB (в пробирках объемом 10 мл), с содержанием канамицина – 25 мкг/мл, и выращивали в термостатируемом шейкере при температуре 37 С и скорости перемешивания 250 об./мин в течение 5 ч. Затем культуру пересевали на больший объём (100 мл в конической колбе объёмом 500 мл) предварительно нагретой до 37 С среды с антибиотиком в соотношении 1/100 суспензии к свежей среде и выращивали в течение 18–20 ч при тех же условиях. Полученную культуру пересевали в 10 л LB среды и выращивали в ферментёре до достижения оптической плотности значения 0,6 при длине волны 600 нм (А600), после чего добавляли ИПТГ («Thermo scientific») и продолжали культивирование ещё 3 ч. По истечении времени бактериальную массу концентрировали методом микрофильтрации до объема 1,5 л с использованием фильтрационной мембраны УПМ-20Ф и осаждали центрифугированием с ускорением 5000 g.
Лизис бактериальной массы проводили в растворе, содержащем 8 М мочевины («Amresco»), 0,1 М NaH2PO4 и 0,01 М Tris (pH=8,0) в шейкере со скоростью вращения 150 об/мин в течение ночи при комнатной температуре. От клеточного дебриса избавлялись центрифугированием с ускорением 10000 g в течение 1 ч при комнатной температуре.
Очистку рекомбинантных белков проводили ионо-обменной хроматографией. К супернатанту, полученному после центрифугирования, добавляли Ni-сефарозу («GE Healthcare») и инкубировали при слабом покачивании (70–90 об./мин) в течение 18 ч при комнатной температуре. Далее сорбент поочерёдно промывали буферным раствором, содержащим 8 М мочевины, 0,1 М NaH2PO4 и 0,01 М Tris со ступенчатой сменой pH от 6,3 до 5,9 и 4,5 до полной элюции целевого продукта. Концентрацию белков определяли по формуле С=D280К, где К— коэффициент экстинкции, равный 0,8 для ToxA; 0,73 для aTox3; 0,77 для aTox2; 0,7 для аTox1.
Электрофорез осуществляли в 12 % полиакриламидном геле. Пробы готовили следующим образом: к суспензии микробов или очищеному рекомбинантному белку добавляли равный объём 2х кратного буфера для проб (100 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 200 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 % глицерин, 0,2 % бромфеноловый синий) и кипятили 5 мин.
Для приготовления концентрирующего геля смешивали 0,5 мл раствора акриламида/бисакриламида (30:1), 2,5 мл Tris-HCl pH 6,8 (Tris 3,94 г, додецилсульфата натрия 0,1 г на 100 мл воды) и 2 мл H2O. Для полимеризации добавляли 250 мкл 10 % персульфата аммония и 1,5 мкл N,N,N`,N`-тетраметилэтилендиамина.
Для приготовления разделяющего геля использовали 3,5 мл раствора акриламида/бисакриламида (30:1), 4,5 мл буфера Tris-HCl pH 8,8 (Tris 11,8 г, додецилсульфата натрия 0,2 г, на 100 мл воды), 1,5 мл H2O. Перед полимеризацией геля добавляли 225 мкл 10 % раствора персульфата аммония и N,N,N`,N`-тетраметилэтилендиамина 2,5 мкл.
Тестирование и отбор первичных гибридных культур
Полученные первичные культуры были условно разделены на 5 групп (Таблица 7):
1. культуры, синтезирующие антитела, взаимодействующие в ИФА только с полноразмерной формой ToxA и ЭТА («Sigma»): №№ 2, 12, 20, 23, 24, 31, 34, 35, 36, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 47 (Таблица 7, гр. № 1). Данный факт свидетельствует о том, что эпитопы этих антител располагаются на конце III домена, формируемого последними 105 аминокислотными остатками (508-613 аминокислотные остатки ЭТА) (Рисунок 6).
2. Культуры, синтезирующие антитела, взаимодействующие в ИФА с ToxA, ЭТА («Sigma») и делеционными формами aTox2 и aTox3, но не взаимодействующие с aTox1: №№ 3, 5, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 18, 21, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 37, 42 (Таблица 7, гр № 2). Большинство антител данной группы, вероятно, направлены к эпитопам доменов II/Ib. Однако антитела № 15, 16 и 33 активно реагировали с полноразмерными ToxA и ЭТА, и слабо – с атоксичными формами aTox3 и aTox2, Поэтому конкретизировать принадлежность их эпитопов к какому-либо домену не удалось. Тем не менее, возможно предположить, что данные антитела специфичны к последним 105 аминокислотным остаткам ЭТА, а слабое взаимодействие с aTox3 и aTox2, объясняется перекрёстной активностью (Рисунок 6).
3. Культуры, синтезирующие антитела, взаимодействующие с ToxA, ЭТА («Sigma») и делеционной формой aTox2, но не взаимодействующие с aTox3 и aTox1: № 1, 19 (Таблица 7, гр. № 3). Предположительно данные антитела направлены к домену II/Ib ЭТА. Возможно, что атоксичная форма aTox3 имеет другую, нежели нативный ЭТА, конформацию, в результате чего конкретный эпитоп данными антителами не распознаётся.
4. Культуры, синтезирующие антитела, взаимодействующие с ToxA, ЭТА («Sigma») и всеми делеционными формами: № 4, 22. Полученные данные свидетельствуют о специфичности этих антител к эпитопам домена I ЭТА (Рисунок 6). 5. Культуры, не отнесённые к какой-либо из предыдущих групп: № 6 – взаимодействовали со всеми белками, кроме ЭТА («Sigma»), № 10 – взаимодействовали только с ToxA и aTox1, № 11 – взаимодействовали со всеми белковыми препаратами кроме aTox3, № 17 – взаимодействовали со всеми белковыми препаратами, кроме aTox2 и ЭТА («Sigma»), № 39 – взаимодействовали только с ToxA, ЭТА («Sigma») и aTox3, № 46 – взаимодействовали со всеми белковыми препаратами, кроме aTox2.
Судя по данным ИФА эпитоп, распознаваемый антителом № 39, находится на домене III ЭТА, но не включает последние 105 аминокислотных остатков (Рисунок 6). Направленность к эпитопам какого-либо домена для других моноклональных антител данной группы невозможно было определить, что, вероятно, связано с изменением конформационной структуры делеционных вариантов ЭТА.
Различно взаимодействуют с разными формами ЭТА Рисунок 6 – Специфичность антител первичных гибридных культур к доменам ЭТА. Пунктиром отмечены области, в которых предположительно находятся эпитопы полученных культур-продуцентов антител.
Тем не менее, достоверно определить направленность антител возможно только после клонирования первичных гибридных культур. Для выявления наиболее перспективных культур-продуцентов МА, с целью последующего клонирования, проведено изучение токиннейтрализующих свойств Ат (п. 3.5) и оценка направленности их к линейным или конформационным эпитопам ЭТА (п. 3.4.).
Для дополнительной характеристики полученных моноклональных антител их взаимодействие с антигенами оценили в иммунодот варианте иммуноферментного анализа, при котором определяющими адсорбцию антигена силами являются не гидрофобные взаимодействия (при сорбции на полистироле), а полярные и электростатические. В данном эксперименте также изучили стабильность эпитопов антител и сравнили взаимодействие антител с инактивированным и неинактивированным ТохА, что представляло интерес, поскольку часть антител в экспериментах получена на инактивированный температурой ToxA. Для проведения эксперимента рекомбинантный экзотоксин А (ToxA), обработанный или не обработанный додецилсульфатом натрия и 2 меркаптоэтанолом, наносили на нитроцеллюлозную мембрану (пятна B и Г, Рисунок 7), аналогичной обработке подвергали инактивированную форму ToxA (пятна А и Б, Рисунок 7).
Сравнительная характеристика токсинообразования P. aeruginosa при культивировании на различных питательных средах
Вероятно, НЦТ не происходила у остальных клинических изолятов, поскольку они либо не продуцировали ЭТА совсем, либо содержали его в низких концентрациях, и цитотоксичность супернатантов была обусловалена наличием других секретируемых факторов патогенности Pseudomonas aeruginosa, нивелирующих действие ЭТА. Не исключено, что ген токсина у некоторых штаммов мог содержать мутацию, приводящую к видоизменению эпитопа, с которым связываются МА № 33. Поэтому есть вероятность, что МА № 33 могли не распознавать эпитопы токсина у некоторых штаммов, в результате чего в реакции НЦТ были получены отрицательные результаты.
Для выяснения этого обстоятельства и преодоления низкой чувствительности и специфичности культуральных тестов, в дальнейшей работе проведены исследования по разработке более эффективных методов детекции ЭТА и, прежде всего, ИФА с использованием моноклональных антител. Для количественной оценки ЭТА в супернатантах клинических штаммов оптимизирован твердофазный иммуноферментый двухстадийный сэндвич-метод с использованием моноклональных антител.
С этой целью были приготовлены пероксидазные конъюгаты моноклональных антител № 19, 21, 33 и поликлональных антител мыши.
Иммуносорбент готовили сорбцией моноклональных (МА №№ 12, 14, 23, 21, 33, 36, 37) или поликлональных антител (направленных к aTox3) на полистирольных планшетах (Costar кат. № 2593, mediumsorp) в 10 мМ PBS, pH=7,2 в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты трижды отмывали дистиллированной водой, высушивали, запаивали в полиэтиленовые пакеты и хранили при температуре 4 С.
Схема проведения анализа: на первой стадии в лунки сенсибилизированного планшета вносили пробы ЭТА, на второй стадии вносили моноклональные или поликлональные антитела к ЭТА, меченые пероксидазой корня хрена. Иммунные комплексы выявляли по цветной реакции субстрата пероксидазы – перекиси водорода – и хромогена 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидина. После остановки реакции 1 М серной кислотой интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряли по оптическому поглощению при длине волны 450 нм (длина волны сравнения 620 нм) на планшетном спектрофотометре Multiskan Ascent (Thermo labsystems).
Одним из важных этапов оптимизации метода был подбор буфера для разведения образцов. Поскольку ЭТА определяли в культуральных жидкостях, в состав буфера для разведения ввели 10 % питательной среды для культивирования Pseudomonas aeruginosa до конечной концентрации 10 % RPMI 1640 и 0,5 % СПК. Для предотвращения гидролиза IgG эластазой, продуцирующейся большинством штаммв Pseudomonas aeruginosa, в состав буфера добавляли ЭДТА [30]. Для предотвращения неспецифического связывания конъюгата с поверхностью полистиролового планшета в буфер добавили 0,2 % БСА. В качестве консервантов использованы 0,1 % проклин-300 и 0,008 % гентамицин. На следующем этапе подобрана пара детектирующих и сенсибилизирующих антител.
Оптимальным оказался вариант с сорбированными на планшете мышиными поликлональными (ПкАт) антитоксическими антителами, полученными к аТохЗ, и конъюгатом токсиннейтрализующего моноклонального антитела № 33, меченого пероксидазой корня хрена (ПХ).
Для проведения анализа в лунки 96-луночного планшета вносили по 90 или 95 мкл буфера для разведения образцов (20 мМ ЭДТА, 10 % RPMI 1640, 0,5 % СПК, 0,2 % БСА, проклин-300 0,1 %, гентамицин 0,008 %) и 10 или 5 мкл образцов культуральных супернатантов P. aeruginosa. В дальнейшем учитывали коэффициент разведения равный 10 или 20, соотвественно.
Для количественной оценки ЭТА строили градуировочные графики. В качестве образцов в лунки планшета вносили по 100 мкл калибровочных проб— рекомбинантного ЭТА (ТохА) или ЭТА «Sigma» в различных концентрациях от 0 до 50 нг/мл в буфере для разведения проб. В качестве нулевой пробы использовали исходную питательную среду для культивирования Pseudomonas aeruginosa, разведённую в буфере для проб.
Планшет выдерживали в термостатируемом шейкере в течение 120 мин при температуре 37 С и скорости вращения 500 об./мин. Промывали планшет пятикратно раствором PBS, рН 7,2±0,2, внося в лунки по 250 мкл раствора и выдерживая раствор в лунках не менее 40 с. После промывки тщательно удаляли влагу из планшета.
На следующей стадии в лунки планшета добавляли раствор конъюгата антител № 33 с пероксидазой корня хрена в PBS с 0,2 % BSA и инкубировали 30 мин при температуре 37 С и скорости вращения 500 об./мин, далее планшет отмывали как описано выше и вносили 100 мкл раствора ТМБ. Планшет помещали в защищенное от света место на (15 + 2) мин при температуре 18-25 С. Останавливали пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 50 мкл 1М серной кислоты.