Введение к работе
Актуальность проблемі. В настоящее время для профилактики менингококковой.ішфекцші Дм/ разработаны эффективные полисаха-риднне /TIG/ вакцини соротрупп А, С, У и .4 135 ( С.т.д. БОЗ Ш58, 1983; В.И.Кувакипа, 1939; Qotschlich et аХ ., 1969;Farquhar et el., 1977; Griffiss ct al ., 1981). Однако полного контроля за заболеваемостью Ш осуществить пока не удается из-за того, что отсутствует эффективная вакцина против менингококков серогруппы В. Между тем, на долю этой инфогапш во многих странах мира, включая и нашу страну, приходится более половини всох случаев заболеваемости Ш ( В.И.Покровский, А.А.Демина, 1987; П.В.Мартинов, 1991; Predriksen et al ., 1991 ). Решение этой проблемы осложняется сом, что капсульний В-ПС оказался неиммуногеннш для людей (Brandt et al.,I972; Wyle et al ., 1972 ). В качесгае антигенов, пригодных для конструирования Е-вакцинн, наиболее вероятными рассматри -ваются белки наружной мембраны / БНМ / а липояолисахарид / ЖС /, антитела к которым обладают бактерицидной активностью ( Jrasch et al ., 1972 /ІУ/; Zollinger et al., 1972, 1974 ).
Можно выделить два основных направления исследований, определивших поиск оптимального варианта В-вакцинн в течение послед -них 20 лет. Первое'направление включало разработка вакцинного препарата на основе БНМ, выделенных из штаммов определенных серотипов, с преимущественным содержанием серотиловых белков. Вакцины такого типа были приготовлены в США, Норвегии и на Кубе ( Zollinger et al ., I987;Campa et al ., 1990; Frasch et al ., 1990; Fredriksen et al., 1991 \ Изучение их эффективности в условиях эпидемии показало, что БНМ-вакцшш формируют слабую и непродолжительную защиту строго серотиповой специфичности, а это требует постоянного слежения за потенциально-эпидемическими штамілами менингококка (Rosenqvlst
et al., 1988, 1991: Boslego et al ., 1990; Costa et al., 1991 ; Sierra et al., 1991).
Второе направление исследований базировалось на представлении, что включение в состав менингококковой" вакцины серогруппы В общего для всей серогруппы антигена,, каким является капсульний В-ПС, придаст вакцине болео широкий диапазон иммунологической защиты ( Moreno et al., 1985, 1986; Lifely a. Wang , 1988). Сообщалось, что слабая ишуноген. їсть очищенного В-ПС вызвана тем, что дртерминанта иммунологической специфичности В-ПС является информационной и сохраняется в таком виде лишь в микробной клетке, где
В-ПС находится в, комплексе с другими биологически активными соединениями наружной мембраны (Linden et al., I984;Lifely et al ., 1984, 1987). Вакцина на осново белково-ПС комплекса, приготовлон-ная Moreno .et al. (1985), обладала выраженной иммунологической активностью в эксперименте на мылах и в ограниченном испытании у добровольцев, однако изучение этого вида вакцины но получило дальнейшего развития и не вшло за ратаї лабораторных исследовшгпй.
В исследованиях сотрудников МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского и НЖВС им.И.И.Мечникова било показано,-что промежуточный продукт очистки В-ПС - "сырой" В-ПС - безвреден для лабораторных животных и, в отличие от полностью очнщонного В-ПС, обладает выраженной иммунологической активностью в .эксперимента на мншах (А.П.Аллилуев и соавт., 1986). Эти результаты, а также ранее полученные данные о корреляции иммуногонносги микробных ПС для мышей и людей ШШск-реыко, 1980), позволили рассматривать "сырой" В-ПС как перспективный антиген для конструирования В-вакцины.
Цель настоящей работы заключалась в разработке технологически простого метода выделения из менингококков серогруппы В иммуноло-гически активного и нетоксичного антигена белково-ПС природи в со-стоянші, близком к естественному существованию антигена в микробной клетке - натавного белково-БС комплекса /НЕПК/ и в приготовлении на ого основе менингококковой вакцины серогруппы В.
Основные задачи исследования:
-
Выделение ННІК из жидкой микробной культуры с помощьп це-тавлонового метода Gotaohlloh et al. (1969) и выяснение его химических, физико-химических и биологических свойств (иммуногошгости и токсичности).
-
Определенно оптимальных условий выделения КЭШ.
-
Разработка способа изготовления лиофилизированной вакцины на основе НБПК.
-
Изучение химического состава КЕПК и В-вакщшы, состава белковых компонентов, молекулярной формы В-ПС в НБПК и определение физико-химических критериев, пригодных для стандартизации НЕПК и готовой В-вакцины.
-
Изучение антигенной активности белковых компонентов В-вакцины методом иммуноблоттанга.
Научная новизна работа.
Разработан метод получения, из менингококков сорогруппн В гемуно-логически активного и нетоксичного комплексного белково-ПС антигена. Ыегод основан, на использовании ряда щадящих препаративних приемов и позволяет сохранить нативную структуру,антигена, о чом свидетельствуют высокие молекулярные параметри /мол.параметри/ В-ПС в составе комплекса и выраженная активность белковых компонентов в иммуноблоттинго.
Разработанный метод получения НШК прост и технологичен п может служить основой производственного метода изготовления коммерческого препарата мешшгококковой вакцины серогруппи В. Получены авторские свидетельства на "Штамм бактерий. Neisseria meningitidis серогруппы В - продуцент капсульного полисахарида и полисахаридао-белкового кошлекса" М708846 от I октября 1991 г. и на "Способ получения полисахаридно-белковой вакцины, против Neisseria meningitidis серогрупщ В" М750639 от I апреля 1992 г.
На основа изучения .химического состава и белкового спектра обоснованы критерии стандартизации мешшгококковой вакцины серогрун-пи 3 и отработаны методи контроля ее качества.
Впервые установлена прямая коррелятивная связь между иммунологической активностью НЕПК и молекулярной формой В-ПС в составе комплекса, а также между иммунологической активностью НШК и количественным соотношением белок/ЇІС в комплексе.
Получены новые данные по иммунохишческой характеристике белковых компонентов разработанного варианта, менингококковой вакцины серогруппи В при исследовании сивороток привитых вшмуноблоттинге.
Практическая значимость' работа состоит в разработке на основе НШК менингококков серогруппи В-вакцинного препарат для профилактики Щ серогруппы В.
Внедрение результатов исследования в практику. На основе полученных данних составлены:
-
Инструкция по изготовлению и контролю менингококковой вакцини серогруппи В, утверждена Ученим сбветом МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского (протокол ЯЭ от 20 октября 1986 г.). л. Ученым советом ЦНИИВС им.И.И.Мечникова (і.^отокол И4 от 31 октября.1986 г.).
-
Отчет о проведении испытания.менингококковой вакцины евро-группы В на добровольцах для оценки раактогонности и иммунологичес-
кой эффективности препарата.
Материалы исследований' использованы такке при составлении проектов нормативно-технической документации на менпнгококковую вакшшу серогруппы В: ВФС, ЭПР, инструкции по применению вакцини.
Апробация работ;; и публикации. Материалы диссертации доложены на УШ-ой научно-практической конференции молодих специалистов Ленинградского ордена Трудового Красного Зн&меші научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Пастора (г.Ле-нинград, I9S6), рабочем совещании участников комплексной республиканской программы "Бактериальная вакцина" (г.Оренбург, 1987), конференции молодых ученых МВЖЭМ ид.Г.Н.Габричевского (г.Москва, 1988} ІУ-оіі Всесоюзной конференции по ыекингококковой инфекции и гнойным менингитам (г.Новосибирск, 1990).
Диссертация апробирована на заседании секции" Ученого совета "Иммунология и медицинская биотехнология" МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского 20 июля 1993 г.
По теме диссертации опубликовало 12 научных работ, в том числе 2 авторских свидетельства.
Структура и объем работы. Работа написана но обычному плану и включает следующие разделы: "Введение", "Обзор литературы" (3 главы); "Собственные исследования" (4 главы); "Заключение", "Выводы" (8), "Список литературы" (fS источника^). Работа иллюстрирована /? рисунками и /У таблицами. Обідай объем диссертации /43 страница/ .