Введение к работе
Актуальность проблемы. Нормальная микрофлора открытых полостей организма человека представляет собой сложную многокомпонентную, строго сбалансированную экологическую систему, каждый из сочленов которой составляет важное звено в обеспечении состояния эубиоза макроорганизма и служит естественным защитным механизмом (Van der Waaij D., 1987). С нарушением микробной экологии изменяется баланс, т.е. количественный и качественный состав микроорганизмов, при котором потенциально патогенные бактерии могут стать преобладающими в количественном отношении и привести к дисбиозу (Salromen S.,«et al., 1995; Tazume S., etal., 1993).
Для нормализации микробного^ценоза в практике
здравоохранения все более широкое применение находят средства
бактериальной терапии. Накоплен достаточный опыт использования
эубиотиков (пробиотиков). Практика применения эубиотиков из
различных штаммов и видов нормофлоры показала их положительное
влияние на кишечный микробиоценоз, повышение общей
резистентности организма (Golledge C.L.. et al.. 1996: Perdigon G., et al., 1995). По данным ряда исследователей (В.В:Поспелова с соавт.. 1990; Mantere-Alhonen S., 1986) эффективность бактерийных препаратов определяется биологическими свойствами входящих в них штаммов. Не разработаны единые принципы отбора новых перспективных штаммов для изготовления эубиотиков и контроля производственных штаммов, также требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств обеспечивающих безопасность и лечебную эффективность препарата (А.А.Воробьев с соавт., 1997). В связи с этим, проблема конструирования и использования экологически безопасных эубиотиков из представителей нормальной микрофлоры в настоящее время чрезвычайно актуальна.
В нашей стране при отборе штаммов - кандидатов в эубиотики обращают внимание прежде всего на спектр и уровень антагонистической активности, их технологичность. Подобная характеристика является недостаточной, т.к. она не раскрывает механизм действия эубиотика, его ззаимодейстзие с макроорганизмом и другими видами бактерий (В.М.Бондаренко. Е.М.Горская. 1992). Начиная с 90-х годов, некоторые исследователи высказали мнение, что основным требованием при подборе производственных штаммов
- з -должна быть их высокая колонизационная резистентность (Fuller R.,1989; 1991; Gibson GR., etal., 1995).
Одним из старейших эубиотиков является колибактерин, исходный штамм Е.соН М-17 вьщелен из "мутафлора" Ниссле. Многочисленные данные свидетельствуют о хорошей клинической эффективности колибактерина при острой и хронической дизентерии, которую связывают, в основном, с антагонистической активностью препарата в отношении ряда патогенных бактерий, а также стимуляцией специфического и неспецифического иммунитета (Ю.К.Зацепин, 1972; Н.Б.Касымова с соавт., 1982). Однако, отсутствие достаточно полных данных о взаимоотношениях между эубиотиком и условнопатогенными бактериями приводит порой к необоснованному назначению препарата и, как следствие этого, отсутствию положительного эффекта.
Однако остается недостаточно изученным механизм защитного действия и некоторых биологических свойств E.coli М-17: такие как адгсзивность к эукариотическим клеткам и тканевым белкам, в частности, к фибронектину; влияние кишечной палочки на слизистую оболочку кишечника; спектр антагонистической активности.
Одной из задач стандартизации является сравнительное
изучение и оценка методов контроля свойств препарата для выбора
оптимальных тестов, дающих наиболее полную (адекватную)
информацию о свойствах продукции при высокой степени надежности
и удобстве применения. Существующий метод контроля
антагонистической активности колибактерина, основанный на совместном культивировании производственного штамма E.coli М-17 с тест-штаммами шигелл несовершенен и трудоемок, поэтому разработка нового метода оценки и контроля антагонизма была своевременна и актуальна.
В последние годы в мировой практике получили развитие работы по изучению и внедрению в практику медицины эубиотиков из живых культур аэробных спорообразуюших бактерий. Препараты из бацилл (бактисубтил. флонивин, энтерогермин и др.) предназначены для лечения дисбактериозов, острых кишечных инфекций, аллергий и других патологических процессов, вызванных патогенными и условнопатогенными бактериями у людей (В.В.Смирнов, С.Р.Резник, И.Б.Сорокулова, 1992; Fais S., et al., 1987; Rocchietta G..1967; Thach P.N., Vu T.C., Nguen Т.Н., 1968; Wei H., Kan E.,1981). He смотря на значительный опыт применения споровых эубиотиков в разных странах (Франция. Югославия. Китай, Япония) в нашей стране долгое
время ввелась дискуссия о безопасности широкого применения в медицинской практике споровых эубиотиков. В связи с этим, а также в соответствии с РД 42-28-889 "О создании новых препаратов и их безопасности" необходимы исследования: по безопасности споровых эубиотиков, определение контаминации посторонней микрофлорой, специфической активности (количества живых микробов в дозе препарата и антагонистической активности).
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выявление новых биологических свойств производственных штаммов эубиотиков (колибактерина, биоспорина и споробактерина) обеспечивающих защиту макроорганизма и характеризующих качество препаратов,' а также их безопасность.
Учитывая вышеизложенное, в соответствие с целью были определены следующие конкретные задачи:
1. Изучение антагонистической и адгезивной активностей E.coli
М-17 и производственных штаммов рода Bacillus. с
2. Оценка безопасности споровых эубиотиков и колибактерина.
3. Разработка и стандартизация новых методов контроля специфической активности производственных штаммов и оценка качества коммерческих препаратов.
4. Сравнение сохранения адгезивных и антагонистических свойств у производственного штамма и коммерческих серий препарата.
Научная новизна исследований.
Впервые в модельных опытах изучена адгезивная активность производственного штамма E.coli М-17 и серий колибактерина к эукариотическим клеткам и тканевым белкам. в частности, к фибронектану. муцину и конА. Доказано, что адгезивная активность производственного штамма сохраняется и у коммерческих серий препарата.
Найдена прямая корреляция между СП А (средним показателем адгезявности) и специфической активностью (количеством живых микробрв в одной дозе препарата). Доказано, что метод определения адгезивной активности серий колибактерина на эритроцитах человека может быть использован как экспресс-метод хія оценки качества препарата.
Разработана модификация методики оценки антагонистической активности колибактерина методом отсроченного антагонизма. Изучена антагонистическая активность Exoli М-17 и колибактерина в отношении клинических патогенных и условнопатогенных бактерий.
Впервые дана характеристика адгезивной активности на разных моделях (эритроциты человека, изолированные эпителиальные клетки кишечника крыс) производственных штаммов B.subtilis 534, B.subtilis 3, B.licheniformis ЗI и споровых эубиотиков.
Впервые изучена адгезивность тест-штаммов используемых для контроля антагонистической активности эубиотиков на модели эритроцитов человека и различных типах эпителиальных клеток кишечника крыс.
Изучена безопасность B.subtilis 534, B.subtilis 3, B.licheniformis ЗІ и споровых эубиотиков.
Впервые разработаны методы определения качества споровых эубиотиков, специфической активности (включающие методику отсроченного антагонизма, определения количества живых микробов в дозе препарата) и методика определения контаминации споровых эубиотиков посторонней микрофлорой.
Практическая значимость.
Усовершенствование метода контроля антагонистической активности производственного штамма E.coli М-17 и контроля качества (конечного продукта) колибактерина и бификола. Метод определения антагонистической активности внесен в НТД и позволяет объективно оценивать качество препаратов.
Изучение специфической активности (антагонистической активности и определения количества живых микробов в дозе), адгезивности, подбора сред для определения контаминации споровых эубиотиков позволило охарактеризовать биологическую активность и защитные свойства препаратов, отработать методы контроля производственных штаммов и препаратов. Была показана безопасность споровых эубиотиков.
Результаты научной работы отражены в НТД на изученные препараты.
В настоящий момент утверждены:
1. ФС 42 - 336І-97 на колнбактерин сухой
- б -
-
ФС 42- 3364-97 на колибактерин в таблетках
-
ВФС 42-371 ВС-92 на споробактерин
-
ЭРП 415-92 на споробактерин
-
ВФС 42-366 ВС-92 на биоспорин
-
ЭРП 580-96 на биоспорин
-
ФС 42- 3268-96 на бификол сухой (контроль антагонизма коликомпонента)
Получен патент РФ № 1722502 "Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудо«о-кишечных заболеваний человека".
Положения, выносимые на зашиту. 1. Адгезивная и антагонистическая активности основные механизмы защитного действия и показатели качества эубиотиков. 2. Разработанные и стандартизированные методы контроля качества7 колибактерина и споровых эубиотиков позволяют судить о безопасности препаратов.
Апробация диссертации. Основные положения работы были доложены на конференции молодых ученых в ГИСК им.Тарасевича (Москва, 1989, 1991); Конференции молодых ученых "Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных- болезней", посвященной 30-ти летию ЦНИИ эпидемиологии (Астрахань, 1992 г), на конференции бактериологического отдела ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
По материалам диссертации опубликовано 6 статей.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения.
Работа содержит 207 страниц машинописного текста. 37 таблиц, 7 рисунков. Список использованной литературы составляет 257 названий, в том числе І42 - иностранных авторов.