Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной in важнейших проблем медицинской микробиологии является проблема сохранения патогенных бактерий в окружающей среде. Теперь уже не вызывает сомнения, что многие патогенные бактерии способны размножаться не только в организме хозяина, но и в объектах внешней среды, а именно, п почве, воде, на растительных субстратах. (Сомов, Литвин 1988). В ходе эволюции у бактерий вырабатывались генетические системы, позволяющие им координирование) перестраивать работу клетки для адаптации к условиям существования, качественно различающимся не отдельными субстратами, а всем комплексом биотических и абиотических факторов. Для спорообразуюших бактерий уже в течение 40 лет известно, что резкое ограничение питательных веществ в среде обитания приводит к тому, что такие бактерии способны формировать покоящиеся формы - споры или цисты, способствующие сохранению бактерий в течение длительного времени до наступления благоприятных для размножения условий. Формирование спор - процесс перестройки бактериальной клетки, подверженный сложному генетическому контролю (llarwood 1989). В последние несколько лет обнаружено, что и грамотрнцательные бактерии, в том числе возбудители многих массовых заболеваний людей, также способны к длительному переживанию неблагоприятных условий внешней среды в виде вегетативных клеток со значительно сниженной метаболической акгивностью и не обнаруживаемых традиционными методами лабораторного культивирования. Состояние бактерий, при котором они, оставаясь живыми, теряют способность к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста и размножения к соответствующих питательных средах, получило название "пскультивируемого" (НС) (Colwell 1985). Бактерии, находящиеся в
некультивируемом состоянии называются "некультивируемыми формами" (НФ). Способность патогенных бактерий к переходу в НС имеет большое медицинское и эпидемиологическое значение, так как обеспечивает им возможность длительного существования во внешней среде вне организма хозяина при сохранении своего патогенного потенциала. Эндемичностъ природных очагов многих сапронозных инфекций может зависеть от способности их возбудителей существовать в НС (Четина и др. 1992, 1993). В последнее время наблюдается значительное возрастание интереса к исследованию некультивируемого состояния и количество видов бактерий, для которых обнаруживаегся способность к формированию НФ, постоянно растет. Однако данные о молекулярно-генетических механизмах этого явления практически отсутствуют. Медицинское и эпидемиологическое значение феномена способности бактерий к переходу в НС послужило основанием для разработки принципиально нового направления исследования, связанного с пониманием природы адаптационной изменчивости, позволяющей патогенным бактериям сохраняться в объектах внешней среды. Таким направлением являегся выяснение молекулярно-генетических механизмов формирования НС у грамотрнцатсльнмх патогенных бактерий.
Цель работы - исследование феномена перехода в некультивируемое состояние у патогенных бактерий и идентификация генетической регуляторной системы, обеспечивающей этот процесс.
Модельным объектом для выполнения исследования выбраны бактерии Salmonella typhimurium, поскольку они являются типичными представителями патогенных бактерий, длительно существующих в окружающей среде, и при работе с ними возможно применение всех современных микробиологических и молекулярно-генегических методов.
Для достижении цели были поставлены следующие задачи:
о разработать подходы и методы, позволяющие выявлять способность клеток Salmonella typhimurium к переходу в некультивируемос состояние,
изучить влияние различных факторов виешнеіі среды и фазы роста культуры
на динамику процесса перехода клеток сальмонелл в нскультивируемое
состояние,
разработать лабораторную модель для индукции некультивируемого состояния у сальмонелл,
изучить участие в генетическом контроле механизма образования нскультипирусмых форм некоторых известных генов, контролирующих клеточные функции жизнеобеспечения,
получить коллекцию мутантов с различными параметрами процесса образования некулыишгруемых форм,
идентифицировать гены, мутации в которых привели к изменениям параметров процесса образования нскультипирусмых форм,
изучить экспрессию идентифицированных генов, участвующих в контроле образования нскультипирусмых форм в процессе перехода клеток в НС,
изучить ультраструктуру клеток сальмонелл п некультивируемом состоянии
Научная повита работы.
н впервые показана способность бактерий Salmonella typhimurium к переходу в нскультивируемое состояние,
и изучение влияния различных факторов среды и физиологического состояішя бактериальной культуры на динамику процесса перехода в НС позволило разработать лабораторную модель индукции некультивируемого состояния у
патогенных бактерий с целью проведения генетических исследований и управления параметрами процесса перехода в НС,
впервые проведено системное исследование, показавшее, что процесс перехода в НС подвержен генетическому контролю,
впервые получена коллекция мутантов с измененными параметрами процесса перехода в НС,
впервые идентифицированы гены, участвующие в контроле механизма перехода в НС,
впервые показано взаимодействие генетических систем, контролирующих процесс индукции НС и активации генов патогенносте, так как один из идентифицированных генов входит в состав оиерона, индуцирующегося в клетках сальмонелл на ранних стадиях инфекции,
выявлены аналогии в участии идентичных генов как в процессе спорообразования у бацилл, так и в процессе образования НФ у сальмонелл, что расширяет наши представления об эволюции бактерий,
впервые разработан методический подход для изучения активности генов в процессе перехода и существовании в НС
Практическая значимость работы.
Решение комплекса поставленных в работе задач направлено на выявление
факторов внешней среды, вызывающих индукцию некульти вируемого
состояния, и прогнозирование как временного анабиоза, так и активации
патогенных бактерии во внешней среде. Возможность существования
бактерий в НС должна учитываться микробиологами и эпидемиологами для
решения актуальной задачи - эпидемиологического мониторинга за
патогенными бактериями в объектах внешней среды до того, как они
проникнут в чувствительную популяцию и вызовут заболевание.
я Разработанные п ходе выполнения исследования амплификанномные тест-системы па основе ПЦР целесообразно использовать для идентификации сальмонелл как в целях медицинской диагностики, так и для выявления сальмонелл и их НФ в объектах окружающей среды и продуктах питания.
н Созданные в процессе работы аттенуиропанпые штаммы сальмонелл рекомендованы для использования в качестве вакцинных при иммунизации сельско-хозяйственных животных. Один из полученных штаммов депонирован в ВГНКИ ветеринарных препаратов и защитен авторским свидетельством.
Аппробация работы. Аппробация диссертации состоялась 23 декабря 1996 года на конференции отдела Генетики и Молекулярной биологии НИИЭМ им. II. Ф.Гамалеи.
Материалы диссертации были доложены: на Всесоюзной конференции "Иммуно-биологические препараты нового поколения и методы их контроля (Суздаль 1988), на Всесоюзной конференции "Бактериальные плазмнды" (Нальчик 1990), на YI конференции РФ "Новые направления биотехнологии (Пупишо-на-Оке 1994), на конференциях института им.Роберта Коха (Всрнигсроде) и института медицинской микробиологии (Лейпциг) (Германия 1994), на конференции института экспериментальной микробиологии (Вюрцбург,Германия 1995), Научных чтениях, посвященных 90-лстню со дня рождения В.Д. Тимакова (Москва 1995) , на совместном заседании проблемных комиссий "Медицинская микробиология" и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Москва 1995), на 1 научно-практической конференции "Применение метода ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний" (Сочи 1996), на YH Всероссийском Съезде общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва 1997).
В 1994-1995 гг. работа поддерживалась грантами Международного Научного Фонда и в 1995-1996 гг. - грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе 1 авторское свидетельство и 1 международный патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и включает разделы: "Введение", Обзор литературы" (4 главы), "Материалы и методы", "Собственные исследования (6 глав ), "Обсуждение" и "Выводы". Список литературы состоит из 160 работ отечественных и иностранных авторов. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками и 14 таблицами.