Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Метилотрофные бактерии 8
1.1. Таксономия метилотрофных бактерий 8
1.2. Пути окисления и ассимиляции С1-соединений
1.2.1. Окисление метанола 19
1.2.2. Окисление формальдегида 20
1.2.3. Циклический рибулозомонофосфатный путь 22
1.2.4. Окисление формиата 23
1.2.5. Рибулозомонофосфатный путь 24
1.2.6. Рибулозобисфосфатный (РБФ) путь 25
1.2.7. Сериновый цикл 26
1.3. Центральный метаболизм 31
2. Синтез полигидроксибутирата – биодеградабельного и биосовместимого полимера 32
2.1. Продуценты ПГБ 35
2.2. Синтез ПГБ и генетическая организация 38
2.3. Синтез ПГБ и центральный метаболизм 40
2.4. Метилотрофные продуценты ПГБ 42
2.5. Применение ПГБ 44
3. Осмоадаптация 46
3.1. Осмотическое давление 46
3.2. Физиологические группы микроорганизмов по отношению 47
к осмотическому давлению 47
3.3. Типы осмоадаптации 48
3.4. Первоначальный этап осмоадаптации 50
3.5. Осмолиты 52
3.6. Синтез эктоина и генетическая организация у метилобактерий 55
3.7. Применение эктоина 59
3.8. Галофильные метилобактерии 60
3.9. Осмопротекторы метилобактерий 61
4. Материалы и методы 64
4.1. Объекты исследования 64
4.2. Методы исследования 66
4.2.1. Микроскопия 66
4.2.2. Методы работы с культурами 67
4.2.2.1. Состав питательных сред 67
4.2.2.2. Получение накопительных культур 68
4.2.2.3. Выделение чистых культур 68
4.2.2.4. Культивирование бактерий
4.2.3. Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств 71
4.2.4. Экстракция ПГБ/В из биомассы и определение молекулярной массы 73
4.2.5. Аналитические методы
4.2.5.1. Выделение и анализ изопреноидных хинонов 74
4.2.5.2. Определение состава жирных кислот 74
4.2.5.3. Определение состава фосфолипидов 75
4.2.5.4. Определение осмопротекторов 1) Определение осмопротекторов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) 76
2) Анализ аминокислот 77
3) Количественный анализ сахарозы 77
4) Определение количества эктоина методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
4.2.5.5. Определение количества ПГБ в биомассе и соотношения 3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата (3ГБ/3ГВ) методом обращённо-фазовой ВЭЖХ 79
4.2.5.6. Определение концентрации азота 80
4.2.5.7. Спектрофотометрические измерения 80
4.2.5.8. Количественное определение белка 80
4.2.5.9. Протеомный МАЛДИ-анализ 82
4.2.6. Биохимические методы 83
4.2.6.1. Определение активностей ферментов 83
4.2.6.2. Биохимические тесты
4.2.7. Радиометрические измерения 87
4.2.8. Молекулярно-генетические методы
4.2.8.1. Выделение и анализ ДНК 88
4.2.8.2. RAPD-анализ (метод случайной амплификации полиморфной бактериальной ДНК) 89
4.2.8.3. Филогенетический анализ 89
5. Результаты 91
5.1. Характеристика метилобактерий из биотопов Урала 91
5.1.1. Морфология изолятов 91
5.1.2. Культуральные, физиолого-биохимические и хемотаксономические свойства 93
5.1.3. Энзимологический анализ 98
5.1.4. Филогенетический анализ 100
5.2.Характеристика метилобактерий из парка Памуккале 107
5.2.1. Морфология 107
5.2.2. Культуральные, физиолого-биохимические и хемотаксономические свойства 108
5.2.3. Энзимологический анализ 110
5.2.4. Филогенетический анализ 113
5.2.5. Дифференцирующие признаки подвида A. kashmirensis subsp. nov. methyliсa. 116
5.3. Биосинтез полигидроксиалканоатов из метанола
метилобактериями 118
5.3.1. Культивирование штаммов 118
5.3.2. Характеристика ПГБ 120
5.3.3. Энзимологический анализ 121
5.3.4. Биосинтез ПГБ/В продуцентами M. halotolerans С2T и M. extorquens G10 122
5.3.5. Биосинтез ПГБ продуцентом Methylobrevis pamukkalensis PK2T 123
Диагнозы новых таксонов 125
Заключение 132
Выводы 134
Список сокращений и условных обозначений 135
Список литературы 136
- Рибулозомонофосфатный путь
- Синтез ПГБ и центральный метаболизм
- Синтез эктоина и генетическая организация у метилобактерий
- Определение активностей ферментов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Аэробные метилобактерии – группа прокариот, использующих в качестве источников углерода и энергии окисленные или замещённые производные метана, но не метан. Эта таксономически и физиологически гетерогенная группа включает представителей более 50 родов, относящихся к классам Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria, Verrucomicrobiae, Actinobacteria и Flavobacteriia (Kolb, 2009; Троценко и др., 2010; Доронина и др., 2015).
В последнее время сформировалось представление о таксономическом и структурно-функциональном многообразии умеренно галофильных аэробных метилобактерий, их важной экофизиологической роли в различных биотопах и механизмах осмоадаптации. Аэробные умеренно галофильные метилобактерии обнаружены в морской воде, содовых озёрах, засолённых почвах и разрушающемся мраморе. В природе метилобактерии часто ассоциированы с метанотро-фами, поскольку используют продукты неполного окисления метана – метанол, формальдегид и формиат. Кроме того, галофильные метилобактерии образуют с гетеротрофами и растениями устойчивые метилотрофные сообщества, поставляя гетеротрофам экзометаболиты и, в свою очередь, получая факторы роста (витамины).
Целенаправленный поиск и изучение метилобактерий, адаптированных к условиям экстремальных биотопов, актуальны для оценки биоразнообразия и роли этих бактерий в различных природных и техногенных эконишах, а также в связи с перспективами их использования в качестве модельных объектов при исследовании молекулярных механизмов адаптации и реализации биотехнологического потенциала.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы – выделение и характеристика метилобактерий из солёных природных и техногенных биотопов России и Турции.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Выделить чистые культуры метилобактерий из солёных биотопов Урала и национального парка Памуккале (Турция);
-
Изучить цитофизиологию и хемотаксономические признаки изолятов;
-
Провести энзимологический анализ путей С1-метаболизма новых штаммов;
-
Идентифицировать выделенные штаммы методами полифазной
таксономии;
5. Определить осмопротекторы и запасные вещества галофильных и галотолерантных метилобактерий.
Научная новизна работы. Получены новые данные о биоразнообразии и метаболическом потенциале аэробных метилобактерий из солёных биотопов. С использованием методов полифазной таксономии описаны: новый род и вид га-лотолерантных метилобактерий Methylobrevis pamukkalensis (Poroshina et al., 2015), новый род умеренных галофилов Methyloligella, включающий два вида: Methyloligella halotolerans и Methyloligella solikamskensis (Doronina et al., 2013), три новых галотолерантных вида: Methylopila oligotropha, Ancylobacter defluvii и Paracoccus communis (Порошина и др., 2013). Кроме того, три изолята идентифицированы как представители известных видов: умеренный галофил Methylophaga thalassica LS, галотолерантный штамм Ancylobacter rudongensis S3270 и негалофильный штамм Arthrobacter protophormiae 2395В (Порошина и др., 2013), а один изолят – как подвид вида Advenella kashmirensis – A. kash-mirensis subsp. methylica (Порошина и др., 2015). Полученные данные расширяют представление о биоразнообразии аэробных галофильных/толерантных ме-тилобактерий из техногенных и природных биотопов, а также раскрывают перспективы их применения в качестве объектов биотехнологии.
Научно-практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур аэробных метилобактерий, устойчивых к высоким значениям солёности. Новые изоляты накапливают универсальный биопротектор эктоин (до 20% от веса сухих клеток) и биодеградабельный и биосовместимый полимер – полигидроксибутират (ПГБ) (40–50% от веса сухих клеток), что позволяет считать их потенциальными продуцентами этих соединений на основе непищевого возобновляемого сырья – метанола. Все новые виды представлены в международных коллекциях микроорганизмов и доступны научной общественности для последующих исследований как в теоретическом, так и в прикладном аспектах.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 15– 19-й международных школах-конференциях «Биология – наука 21 века» (Пу-щино, 2011–2015 гг.), на VIII и IX Молодёжных конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ РАН, 2012–2013 гг.), на конференциях «Экотоксикология» (Тула, 2010; 2014 гг.), ежегодных конференциях ИБФМ РАН (Пущино, 2011–2014 гг.), международной конференции «XIII Съезд общества микробиологов Украины им. С.Н. Виноградского» (Ялта, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6 статей в рекомендованных ВАК РФ рецензируемых научных журналах, входящих в международные базы данных.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальной части, диагнозов новых таксонов, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Текст работы занимает 169 страниц, содержит 21 рисунок и 19 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 324 ссылки.
Рибулозомонофосфатный путь
Генотипическая характеристика в бактериальной таксономии включает анализ последовательности гена 16S рРНК, ДНК-ДНК гибридизацию и содержание Г+Ц пар в ДНК (Stackebrandt and Ebers, 2006; Tindall et al., 2010). Информация о нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК является ценным инстру ментом для быстрого размещения любого штамма в схеме классификации, по крайней мере, на уровнях семейства и рода. Полученные последовательности вы сокого качества выравнивают с последовательностями филогенетически ближай ших соседей с помощью нескольких надёжных программ (например, CLUSTAL_X, CLUSTAL W, CLUSTAL X2, CLUSTAL W2, MEGA, T-COFFEE, MUSCLE), а затем редактируют вручную (Tindall et al., 2010). Для расчёта сход ства рекомендуются программы ARB, PHYDIT и jPHYDIT; значения несходства дают такие программы, как CLUSTAL или PHYLIP. Для расчётов сходства также применяют веб-инструмент EzTaxon на сервере EzBioCloud [http://www.ezbiocloud.net/] (Tindall et al., 2010), и, кроме того, быстрый поиск близкородственных штаммов можно реализовать при помощи пакета программ BLAST [http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. При классификации бактериальных изолятов как новых таксонов на уровнях рода и вида учитывают пороговые значения сходства последовательностей генов 16S рРНК, равные 95 и 98,65%, соответственно, по сравнению с их валидно опубликованными филогенетически наиболее близкими соседями (Tindall et al., 2010; Kim et al., 2014). Таким образом, генные последовательности 16S рРНК предоставляют первичное свидетельство того, что выделен новый вид (в том случае, если сходство последовательностей гена 98,65%). Там, где значения сходства последовательности гена 16S рРНК 98,65%, должны быть использованы другие методы, например, ДНК-ДНК гибридизация, результаты которой, как правило, коррелируют с результатами анализа гена 16S рРНК (Stackebrandt et al., 2002; Richter and Rossell-Mra, 2009), или анализ генных последовательностей с большим разрешением.
Несмотря на то, что метод ДНК-ДНК гибридизации был разработан эмпирически, он широко применяется как «золотой стандарт» для разделения бактериальных видов, поскольку обеспечивает чёткий и объективный численный порог для границ вида, косвенно измеряя общее сходство между двумя геномными последовательностями. Термин «сходство» применяют вместо термина «гомология», поскольку неизвестно, в каких именно Г+Ц богатых областях происходит ДНК-ДНК гибридизация цепей ДНК исследуемых штаммов. Значение сходства по данному методу 70% означает, что тестируемые бактерии принадлежат к различным видам (Wayne et al., 1987; Tindall et al., 2010). Тем не менее, ДНК-ДНК гибридизация имеет ряд ограничений: 1) пороговые значения не распространяются на все роды прокариот; 2) определение ДНК-ДНК гибридизации требует специальных средств, имеющихся в ограниченном количестве лабораторий; 3) это трудоёмкий и дорогой способ, имеющий недостаточную воспроизводимость и отсутствие возможности постепенного создания сравнительной справочной базы данных (Tindall et al., 2010).
Дополнением к ДНК-ДНК гибридизации служит метод секвенирования последовательностей генов, кодирующих белки с консервативными функциями («housekeeping»-генов), а также RAPD-ПЦР (от англ. random amplified polymorphic DNA) анализ – метод случайной амплификации полиморфной ДНК. Анализ прост и широко применяется в молекулярной генетике. Метод RAPD-ПЦР заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого, обычно декануклеотидного праймера, с произвольной нуклеотидной последовательностью, содержащей 40–70% Г+Ц в составе праймера и 50–100% лингвистической сложности нуклеотидной последовательности, с низкой температурой отжига. Полученные продукты разделяют при помощи агарозного электрофореза, получая уникальный для каждого штамма/вида профиль амплифици-рованных продуктов, на основании которых строят бинарную матрицу и филогенетические деревья с использованием различных программ (TREECONw (Van de Peer and De Wachter, 1994; 1997).
Полиморфизм продуктов амплификации ДНК включает характеристики трёх типов: длину фрагментов, наличие/отсутствие полосы и интенсивность свечения. Вариативность в длине продуктов является результатом инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте между праймер-связывающими сайтами, тогда как наличие/отсутствие полиморфизма определяется присутствием/отсутствием самих праймер-связывающих сайтов (Guthrie et al., 1992). К недостаткам метода следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее, RAPD-анализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма.
Содержание Г+Ц в геномной ДНК определяется как доля пар цитозина и гуанина к общему количеству нуклеотидов в геноме, и должно быть частью описания типового штамма типового вида нового рода (Stackebrandt et al., 2002). Согласно лиитературным данным, изменение содержания Г+Ц в ДНК в пределах рода составляет не более чем 10 мол.%, в пределах вида – 3–5 мол.% (Rossell-Mra and Amann, 2001; Mesbah et al., 2011) либо, по расчётам из геномных последовательностей, не более чем на 1 мол.% (Meier-Kolthoff et al., 2014). Последняя цифра особенно актуальна для представителей класса Actinobacteria, являющихся исключением для интерпретации результатов на уровне 3–5 мол.%, т.к. пороговое значение Г+Ц для этой группы бактерий составляет лишь 2 мол.%.
Синтез ПГБ и центральный метаболизм
Биополимеры на основе дешёвого непищевого сырья – метанола – являются перспективными аналогами синтетических полимеров.
В последние годы опубликован ряд работ, описывающих различные микроорганизмы и процессы культивирования для производства ПГБ из метанола (Tan et al., 2014).
Метанол – один из наиболее дешёвых непищевых возобновляемых субстратов, доступных в больших объёмах при производстве из древесных материалов или из натурального газа, полученного после анаэробного сбраживания органических веществ. Он обладает малой плотностью и полной смешиваемостью с водой, высокой химической чистотой, доступен по сравнительно низкой цене, требует меньше кислорода и образует меньше тепла в процессе культивирования (Mokhta-ri-Hosseini et al., 2009; Троценко и др., 2010). Использование метанола вместо чистых сахаров для промышленного производства может снизить стоимость ПГБ (Bourque et al., 1995; Tan et al., 2014). Среди недостатков метанола как субстрата – дефицит по энергии, так как метанол обусловливает несколько большие затраты метаболической энергии на биосинтез, нежели полиуглеродные субстраты.
Общая стратегия синтеза ПГБ – это двухфазный процесс, разделённый на фазу накопления биомассы и фазу накопления продуктов, стимулируемую лимитированием по азоту. С помощью этой стратегии на метилотрофах были достигнуты уровни ПГБ до 130 г/л. При этом в оптимальных условиях выход ПГБ может составлять до 60% от общей биомассы (Zhao et al., 1993; Kim et al., 1996). В условиях периодического культивирования различные сериновые метилобактерии способны накапливать как низко- ( 60 кДа), так и высокомолекулярный ПГБ (1300 кДа).
Наиболее изученным и перспективным в отношении синтеза ПГБ модельным метилотрофом является M. extorquens (Hfer et al., 2011; Delaney et al., 2013), продуцирующий до 46–53% ПГБ на вес сухой биомассы (табл. 2) (Bourque et al., 1995). M. organophilum синтезирует до 30–70% ПГБ. Высокий выход ПГБ (до 80%) получен при культивировании штамма M. extorquens P14, который наряду с метанолом был способен утилизировать метиламин, формальдегид, глицерин, сукцинат и этанол (Ostafin et al., 1999). При периодическом культивировании M. extorquens K накапливал до 60% ПГБ с выходом 0,2 г/г метанола (Suzuki et al., 1986).
Hyphomicrobium zavarzinii синтезировал ПГБ на среде с метанолом с выходом 47% и Мм 1000 кДа. В этом случае наблюдалась довольно высокая степень конверсии (13%) метанола в полимер (Zhao et al., 1993; Волова и Шишацкая, 2011). При непрерывном культивировании H. zavarzinii накапливал 40–59% ПГБ (Zhao et al., 1993). Метанотроф Methylosinus trichosporium OB3b продуцировал 30% ПГБ от веса сухой биомассы с Мм 300 кДа (Доронина и др., 2008). С5-соединения (пентанол и валерат) более эффективны для биосинтеза сополимера метилобактериями и метанотрофами, чем С3-субстраты (пропанол и пропионат) (Короткова, 1997; 1999).
Показано, что увеличение концентрации пентанола до 20% в смеси с метанолом стимулировало M. extorquens к биосинтезу ПГБВ с Мм 1500 кДа и содержанием валерата до 50%, особенно при добавлении пентанола в логарифмической фазе роста. Высокие концентрации пентанола токсичны для продуцента и снижают общий выход ПГБВ. Увеличение Мм ПГБВ с 305 до1500 кДа снижает температуру плавления биополимера (с 171 до 162С) и степень кристалличности с 55 до 8% (Ежов и др., 2013).
Одной из интересных особенностей М. extorquens и P. denitrificans является их способность производить сополимер ПГБ/В из смеси метанола и н-амилового спирта. Так, при добавлении к метанолу н-пентанола содержание сополимера ПГБВ у P. denitrificans достигало 58%, а выход повышался до 0,97 г/г субстратов (Ueda et al., 1992); P. denitrificans также синтезирует ПГБ/В из смеси метанола и н-пропанола или н-амилового спирта (Ueda et al., 1996), P. methylutens – из метанола, глицерина и гептана (Троценко и др., 2010).
Применение рекомбинантной технологии позволило в 2,5 раза увеличить содержание полимера у Mycoplana rubra (Fllner et al., 2007). Однако генно 44 модифицированные метилотрофы с РМФ-путём ассимиляции формальдегида демонстрировали невысокие параметры биосинтеза полимера. Так, рекомбинатные Methylophilus methylotrophus B115 и Methylobacillus glycogenes B121, содержащие гены синтеза ПГБ, накапливали не более 15% полимера (Fllner et al., 1993).
Гранулы ПГБ обнаружены в Methylovirgula ligni (Vorob ev et al., 2009), Methylarcula spp. (Doronina et al., 2000) и других метилотрофах (табл. 1).
Прежде чем метилотрофы смогут рассматриваться как достойная альтернатива для промышленного производства ПГБ, необходимы дальнейшие исследования для повышения продуктивности и содержания ПГБ (Khanna and Srivastava, 2005).
Благодаря разнообразию своих свойств, ПГБ может быть адаптирован для различных областей применения, от биоразлагаемого упаковочного материала до изготовления нанокомпозитов и полимерных смесей, однако наиболее востребо-ваннной областью является медицина. Биосовместимость ПГБ с тканями млекопитающих объясняется тем, что деградация ПГБ является истинной биологической и происходит клеточным и гуморальными путями; образующиеся при этом мономеры гидроксимасляной кислоты (естественного метаболита клеток и тканей организмов) не вызывают резкого закисления тканей и, следовательно, выраженной воспалительной реакции; скоростью деградации ПГБ можно управлять (Волова и Шишацкая, 2011). Благодаря высокой биосовместимости, ПГБ/В апробирован в качестве сырья для производства рассасывающихся шовных нитей, остеопротезов, хирургических пластин, матриц для получения лекарственных форм пролонгированного действия, разобщающих биодеградируемых мембран для предотвращения спаечного процесса в кардиохирургии (Насонова и др., 2012), а также в качестве каркаса для создания тканей и органов (Насонова и др., 2015), в том числе нанофибриллярных матриксов для культур клеток сердечной мышцы (Agladze et al., 2013). Обработка поверхности шовной нити ПГБВ способ 45 ствовала повышению био- и гемосовместимости шовного материала (Акентьева и др., 2014).
У бактерий низкомолекулярный ПГБ является частью Ca2+ каналов (Lara and Huisman, 1999), наравне с его мономером – гидроксибутиратом – является химическим шапероном и действует как осмолит в галотолерантных и галофиль-ных метилобактериях, т.к. положительно коррелирует с концентрацией NaCl в Methylarcula marina, Methylarcula terricola (Doronina et al., 2000; Arora et al., 2006). Кроме того, бактерии, содержащие ПГБ, показали повышенную стрессоустойчи-вость к временным воздействиям окружающей среды, таким, как УФ-излучение, тепловой и осмотический шок (Kadouri et al., 2005). В сфере фармацевтической и медицинской промышленности, тканевой инженерии, ПГБ может быть использован в качестве компонента потенциальных анти-ВИЧ и противоопухолевых препаратов и антибиотиков (De Roo et al., 2002). Показано, что, стабилизируя гидрат-ную оболочку вокруг белков, ПГБ действует как химический шаперон: снижает степень агрегации белка и протектирует ферментативную активность. Известно, что некоторые нейродегенеративные расстройства, такие, как болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона, вызваны агрегацией белка (Soto et al., 2012); применение олигомеров гидроксибутирата предложено в качестве эффективного лечения этих расстройств (Kashiwaya et al., 2000; Tieu et al., 2003).
Синтез эктоина и генетическая организация у метилобактерий
Ионный состав цитоплазмы клеток, величина концентрационных градиентов через цитоплазматическую мембрану определяются слаженным механизмом действия различных ионных помп, антипортеров и ряда транспортных белков (Oren, 1999).
Этот подход требует значительных структурных изменений и характерен для экстремально- и умеренно галофильных анаэробных архей Halobacteria, анаэробных галофильных бактерий Haloanaerobiales, и облигатных аэробных хемоор-ганотрофных экстремально галофильных бактерий Salinibacter ruber (Oren, 1999; Oren et al., 2002; Pflger and Mller, 2004). Особенности их физиологии адаптированы к условиям высокой солёности среды. Второй тип осмоадаптации: осмолиты. Значительную часть микроорганизмов составляют виды, не претерпевшие значительных генетических изменений и потому чувствительные к высоким уровням неорганических ионов внутриклеточные макромолекулы. Вторая стратегия характерна для большинства умеренно галофильных и галотолерантных микроорганизмов. Стратегия осмолитов предоставляет организмам быструю адаптацию к осмотически флуктуирующей среде простым регулированием внутреннего пула растворов, противодействующих осмолярности окружающей среды. По этой причине данная стратегия осмо-адаптации широко распространена в природе, не только у бактерий, но и у архей, эукариот, растений, животных и человека (Burg and Ferraris, 2008). Присутствие данного типа осмоадаптации в трёх различных линиях организмов свидетельствует о независимом развитии этой стратегии, причем трудно представить себе, как эти древние характеристики сохранились в нескольких рассеянных группах; возможно, их происхождение обусловлено массовым горизонтальным переносом генов (Santos and Da Costa, 2002).
Первым ответом на осмотический шок, как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий, является активное поглощение ионов калия K+ (Heermann and Jung, 2004). У грамотрицательной бактерии E. coli осмотический ответ включает две стадии: (1) первичный (временный) ответ, приводящий к накоплению K+. У бактерий есть по крайней мере три К+ -транспортирующие системы, различающиеся по сродству к ионам К+: Kdp, Trk и KtrAB. Две из них, Kdp и Trk, регулируются изменениями в тургорном давлении, и активны при низком ( 1 мМ) и высоком ( 1 мМ) содержании калия в среде, соответственно. Kdp работает, когда другие системы не способны поглощать К+. Оперон kdpFABS кодирует К+-трнаспортирующую АТФазу P-типа. Экспрессия оперона регулируется двумя белками – KdpD и KdpE, которые принадлежат к классу двухкомпонентных регу 51 ляторных систем. KdpD, локализованный в цитоплазматической мембране, является сенсором тургорного давления и автофосфорилируется по сайту His-673 при его уменьшении. Затем фосфатная группа KdpD переносится на KdpE-регулятор ответа (Kempf and Bremer, 1998; Карандашова и Еланская, 2005).
Для функционирования Trk-системы требуются АТФ и протонный потенциал. Основными компонентами Trk-системы являются четыре белка: TrkA, TrkE, TrkG и TrkH. Для активности Trk-системы необходимо присутствие TrkA-периферического мембранного NAD+-связывающего белка размером 50,4 кДа, а также наличие либо TrkG, либо TrkH (Карандашова и Еланская, 2005).
Единовременно, в течение 1 мин после осмотического шока, происходит увеличение синтеза глутамата (Poolman and Glaasker, 1998; Domnguez-Ferreras et al., 2009; Nanatani et al., 2015), и обеспечивает E. coli противоионами для K+, который, в свою очередь, удаляется из клетки неспецифическими системами оттока. Таким образом, пара K+/глутамат, как вторичный мессенджер, опосредованно запускает систему и координацию последующего осмотического ответа; (2) вторичный осмотический ответ – накопление более специфических растворов, таких как трегалоза, глицин-бетаин или пролин (Roeler and Mller, 2001). Транспортные системы, принимающие участие в этом процессе – ProP (первая) и ProU (вторая). ProP –H+/пролиновый симпортер. ProU – ATP-связанный транспортер, обладающий широкой субстратной специфичностью (Kempf and Bremer, 1998).
Недавно in vitro было показано, что в осмотическом ответе E. coli происходит термодинамическая ассоциация РНК-полимеразы с ДНК: в ходе первоначальной реакции, когда в цитоплазме временно накапливается К+, РНК-полимераза быстро диссоциирует в цитоплазму, и одновременно происходит гиперконденсация нуклеоида. Освобождённая РНК-полимераза повторно связывается с ДНК во время последующей фазы осмоадаптации, когда накапливаются органические осмопротекторы, а уровень К+ снижается (Cagliero and Jin, 2013).
Система первичного ответа у Bacillus subtilis также включает накопление К+ и также зависит от тургора. Характер противоина для К+ неясен, поскольку, в от 52 личие от E. сoli, уровень глутамата увеличивается незначительно. Грамположи-тельные бактерии накапливают осмопротекторные соединения, такие как глицин-бетаин, а не электролитическую пару K+/глутамат и трегалозу. Транспортные системы OpuA и OpuC соответствуют ProU в E. сoli, но они не свободно диффундируют и не связаны с периплазмой, а являются субстрат-связывающими белками (Roeler and Mller, 2001).
Таким образом, основная функция накопления K+ сводится к сигнальной индукции вторичного ответа, что находит отражение в наблюдаемой зависимости осмотического ответа от поглощения K+ (Kempf and Bremer, 1998).
Осмолиты накапливаются при гипертонических условиях роста либо синтезом de novo, либо транспортом из окружающей среды (Riis et al., 2003).
Осмолиты – небольшие органические, высокорастворимые в воде соединения, защищающие клетки от денатурации уравновешиванием осмотического давления и внутриклеточной среды. Данные соединения совместимы с клеточной биохимией и физиологией (Street et al., 2006; Ignatova and Gierasch, 2006), не нарушают жизненно важных клеточных функций, таких как репликация ДНК, ДНК-белковые взаимодействия и клеточные метаболические механизмы (Kempf and Bremer, 1998), что нашло отражение в применяемом для них термине «совместимые растворимые вещества» (Brown, 1976).
Определение активностей ферментов
Изоцитратлиазу определяли спектрофотометрически – по образованию фенилгидразона глиоксилата при 324 нм (Dixon and Kornberg, 1959). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 6,8 – 150; MgCl2 – 10; фенилгидразин – 6,5; цистеин-HCl – 4; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль изоцитрата калия.
Глутаматдегидрогеназу (Н.Ф. 4.1.3.2) определяли в реакционной смеси, содержащей в 2 мл (мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,5 – 100; NH4Cl – 80, НАД(Ф)Н – 0,5, экстракт. Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль -кетоглутарата.
Глутаминсинтетазу определяли колориметрически модифицированным методом (Elliot and Kaplan, 1955) в -глутаминтрансферазной реакции. Реакционная смесь в 7,52 мл содержала: имидазольный буфер, рН 7,15, MgCl2 – 0,27, арсенат натрия – 12,5, АДФ – 0,18, гидроксиламсин – 20, экстракт. Реакцию начинали добавлением 20 мкмоль L-глутамина, смесь инкубировали 10 мин при 30С и добавляли 0,6 мл раствора, содержащего 55 г FeCl3, 20 г трихлоруксусной кислоты и 21 мл HCl в 1 л воды. Контролем служила смесь без L-глутамина. Образующийся осадок удаляли центрифугированием и измеряли поглощение при 540 нм. 0,63 единицы поглощения соответствовали 1 мкмоль/мл -глутамилгидроксамата – продукта реакции.
Глутаматсинтазу (Meers et al., 1970) определяли по окислению НАД(Ф)Н при 340 нм. Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): 1,75 мл Трис-HCl буфера рН 7,6 – 50; НАДН – 0,5 или НАДФН 0,5; -кетоглутарат – 10. Реакцию начинали добавлением 25 мкмоль глутамина.
-кетотиолазу определяли по обратной реакции тиолиза (Senior and Dawes, 1973). Реакционная смесь в 1 мл содержала: 100 мМ трис-HCl (pH 8,3), 25 мМ MgCl2, 100 мкМ ацетоацетил-КоА и 100 мкМ КоА. После 2 мин преинкубации при 30С реакцию начинали 0,05 мл экстракта. Уменьшение концентрации ацето-ацетил-КоА измеряли при 303 нм, используя миллимолярный коэффициент экс-тинкции 12,9. Ацетоацетил-КоА-редуктазу определяли спектрофотометрически (Senior and Dawes, 1973). Реакционная смесь содержала: 1,5 мл 100 мМ калий-фосфатного буфера, pH 5,5; 0,12 мл 0,25 мМ MgCl26H2O; 0,1 мл 12,5 мМ дитиот-рейтола; 0,1 мл 6,0 мМ НАД(Ф)Н; 10 мкл 18 мМ ацетоацетил-КоА; 0,1–0,5 мл экстракта, воду до общего объёма 2,5 мл. Контролировали изменение смеси при 340 нм в течение 3 мин и затем начинали реакцию добавлением ацетоацетил-КоА.
ПГБ-синтазу определяли спектрофотометрически при 412 нм (Jossek et al., 1998) в 25 мМ Трис-HCl буфере, содержащем 1 мМ 5,5-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (ДТНБ), 30 мМ В-3-гидроксибутирил-КоА и экстракт.
Удельную активность ферментов выражали, как число нмоль превращённо-го субстрата или образованного продукта в мин/мг белка. Для определения удельной активности подбирали такое количество белка, при котором скорость линейно зависела от количества фермента. При расчётах использовали следующие коэффициенты молярной экстинкции (мМ-1см-1): НАД(Ф) (при 340 нм) – 6,22; ДХФИФ (при 600 нм) – 21,9; ДТНБ (при 412 нм) – 13,6.
В таблицах представлены средние результаты трёх независимых экспериментов, вариация данных ±10%.
Наличие активностей -галактозидазы, аргининдигидролазы, лизиндекар-боксилазы, орнитиндекарбоксилазы, а также способность гидролизовать мочевину (уреаза), сбраживать/окислять глюкозу, маннит, инозит, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин и арабинозу проверяли при помощи API тестов “20Е”, (“BioMerieux”, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя.
Способоность к продукции H2S, восстановление нитратов до нитритов, наличие активностей -галактозидазы, -глюкозидазы, способность к ассимиляции малата, цитрата, маннозы, арабинозы, глюкозы, мальтозы проверяли с использованием API тестов “20NE” (“BioMerieux”, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя.
Радиометрические измерения проводили на жидкостном сцинтил-ляционном регистрирующем спектрометре LS6500 Multi-Purpose Scintillating Counter (“Beckman Coulter”, США) в смеси, содержащей 4 г 2,5-дифенилоксазола (ППО) и 0,05 г 1,3-ди 2/5-фенилоксазолил бензола (ПОПОП) в 1 л толуола. Для просчёта водосодержащих образцов использовали сцинтилляционный коктейль Aquasol-2 (“NEN”, Германия).
Выделение и анализ ДНК проводили по методу Мармура (Marmur, 1961). Нуклеотидный состав ДНК определяли методом тепловой денатурации на спектрофотометре “Beckman DU-8B” (США) при скорости нагрева 0,5С/мин. В качестве стандарта использовали ДНК E. coli K-12 (Owen and Lapage, 1976). Уровень ДНК-ДНК сходства изолятов и референтных культур определяли методом ДНК-ДНК реассоциации (Доронина и соавт., 1988, De Ley et al., 1970) в трёх повторостях; стандартное отклонение данных реассоциации ДНК составляло ± 3%.
Фрагменты генов 16S рРНК амплифицировали, используя универсальные для бактерий праймеры 27f: 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 и 1492r: 5 -AAGGAAGGTGATCCAGCTCGT-3 (Lane, 1991). ПЦР – амплификацию проводи-ли на ДНК – термоциклере MJ Mini (“BioRad”, США) в режиме: 1 цикл – 96С, 3 мин; 27 циклов – 95С, 40с; 58С, 40с; 72С, 50с; последний цикл – 72С, 4 мин. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 0,5 мкмоль соответствующих праймеров; 1 мкл (10–100 нг) ДНК, 200 мкмоль каждого дНТФ и 1 Е Таq-ДНК-полимеразы. Ген mxaF амплифицировали, используя праймеры f1003 и r1561 согласно протоколу (McDonald and Murrell, 1997). Ампликоны mxaF очищали с помощью ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (“Zymo Research”, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, и секвенировали на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (“Beckman Coulter”, США). Обработку и перевод нуклеотидных последовательностей в аминокислотные проводили с использованием Gene Runner, версия 3.05 [Hastings Software, Inc.].