Новые экстремофильные анаэробные бактерии, восстанавливающие соединения серы и железа Рыжманова Яна Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Биоразнообразие сульфатвосстанавливающих бактерий в экстремальных местах обитания 9

1.1. Характеристика сульфатвосстанавливающих бактерий 9

1.1.1. Особенности конструктивного и энергетического обмена СВБ 10

1.1.2. Филогения сульфатвосстанавливающих прокариот 13

1.1.3. Экология и распространение сульфатвосстанавливающих бактерий 17

1.1.4. Методы детекции и анализа популяций сульфатредукторов 18

1.2. Распространение и активность сульфатвосстанавливающих бактерий в экосистемах содовых озер 21

1.3. Сульфатвосстанавливающие бактерии многолетнемерзлых отложений полярных областей 23

Глава 2. Алкалофильное микробное сообщество содовых озер 25

2.1. Содовые озера: происхождение и распространение 25

2.2. Содовые озера Забайкалья 26

2.3. Первичная продукция органического вещества в содовых озерах 28

2.4. Начальные этапы разложения органического вещества в содовых озерах 30

2.5. Терминальная стадия деструкции органического вещества 32

2.6. Микробное восстановление железа в содовых озерах 34

Заключение по обзору литературы 35

Глава 3. Материалы и методы исследования 37

3.1 Районы и объекты исследования 37

3.2. Среды и условия культивирования 39

3.3. Микробиологические методы учета численности бактерий 41

3.4. Методы контроля чистоты культур 43

3.5. Микроскопические методы исследования 43

3.6. Изучение физиолого-биохимических свойств изолятов 43

3.7. Спорообразование 45

3.8. Аналитические методы 45

3.8.1. Определение продуктов брожения и окисления 45

3.8.2. Определение сероводорода 46

3.8.3. Определение десульфовиридина, цитохромов и менахинонов 46

3.8.4. Определение ионов двухвалентного железа 47

3.8.5. Анализ жирнокислотного состава клеток 47

3.9. Молекулярно-генетические методы 48

3.9.1. Выделение хромосомной ДНК 48

3.9.2. Определение содержания Г+Ц пар в ДНК 49

3.9.3. ДНК-ДНК гибридизация 50

3.9.4. Разработка праймеров in silico 50

3.9.5. Полимеразная цепная реакция 50

3.9.6. Секвенирование 52

3.9.7. Филогенетический анализ 52

Глава 4. Результаты и обсуждение 53

4.1. Определение численности бактерий в криопэгах полуострова Ямал 53

4.2. Психротолерантный сульфатредуктор из арктического криопэга 55

4.3. Обнаружение сульфатвосстанавливающих бактерий в содовых озерах Соленое и Сульфатное 59

4.4. Определение численности сульфатредукторов в содовых озерах 62

4.5. Новые анаэробные бактерии содовых озер 64

4.5.1. Сульфатвосстанавливающие бактерии 64

4.5.2. Выделение и характеристика анаэробной алкалофильной протеолитической бактерии 71

4.6. Восстановление Fe(III) сульфатвосстанавливающими бактериями в щелочных условиях 78

4.7. Новые виды анаэробных бактерий 79

Заключение 82

Выводы 84

Список сокращений 85

Список литературы

• Филогения сульфатвосстанавливающих прокариот
• Терминальная стадия деструкции органического вещества
• Определение продуктов брожения и окисления
• Обнаружение сульфатвосстанавливающих бактерий в содовых озерах Соленое и Сульфатное

Введение к работе

Актуальность проблемы. К настоящему времени известным фактом является участие микроорганизмов в природных биогеохимических циклах. Анаэробные микроорганизмы принимают участие в процессах восстановления соединений переменновалентных элементов, к которым относятся сера и железо. Сульфатвосстанавливающие прокариоты - это обширная группа микроорганизмов, объединяющая археи и бактерии, представители которой способны, кроме соединений серы, восстанавливать соединения железа, марганца, мышьяка, хрома и других элементов. Сульфатредукторы населяют различные экосистемы и хорошо адаптированы к экстремальным условиям существования.

Несмотря на общепринятое представление о низких скоростях биохимических реакций, идущих при пониженных температурах, глобальный вклад низкотемпературных микробных сообществ может быть значительным, учитывая масштабы занимаемых ими территорий. В последнее время интерес к микроорганизмам холодных экосистем активизировался еще и в связи с угрозой глобального потепления, в случае которого огромное количество захороненного органического вещества окажется вновь вовлеченным в биогеохимические циклы с участием присутствующей микрофлоры. Все перечисленные факторы обусловили активное развитие относительно новой области микробиологии -исследования холодоустойчивых микроорганизмов и микробных сообществ (Cowan et al, 2002; Deming, 2002; Priscu et al, 2004; Rivkina et al, 2004; Trotsenko et al, 2005; Steven et al, 2006). Уникальной экологической нишей являются криопэги - закрытые водные системы морского происхождения, залегающие в мерзлых толщах возрастом 6-120 тысяч лет на глубине нескольких десятков метров в виде линз хлоридно-натриевых вод, характеризующиеся постоянной отрицательной температурой и высокой минерализацией (Gilichinsky et al, 2005). Как показали исследования последнего десятилетия, криопэги являются местом обитания психрофильных, психротрофных и галофильных микроорганизмов. Арктические криопэги характеризуются высоким содержанием сульфата (0.62-3.84 г/л) и населены сульфатредукторами, которые осуществляют в них терминальную стадию разрушения органического вещества (Gilichinsky et al, 2003; Печерицына и др., 2007). Однако на данный момент выделен и описан лишь один психроактивный сульфатредуктор из распресненного криопэга полуострова Варандей - Desulfovibrio arcticus (Pecheritsyna et al, 2012). Исследования сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) криопэгов методами молекулярной биологии до настоящего времени не проводились.

Содовые озера распространены во внутриконтинентальных аридных районах и по своим характеристикам относятся к экстремальным системам из-за высокой минерализации (от 10 до 475 г/л) и рН (от 8.5 до 11). Первые комплексные микробиологические исследования центрально-азиатских содовых озер были проведены в Кулундинской степи Б.Л. Исаченко в 30-х годах XX века (Исаченко, 1951). Исследования были возобновлены в 90-х годах во многом благодаря гипотезе Г.А. Заварзина о том, что микробные сообщества внутриконтинентальных содовых водоемов могут рассматриваться как реликтовый аналог наземной биоты раннего протерозоя и, возможно, могли являться центрами микробного биоразнообразия (Заварзин, 1993; Заварзин и др., 1999; Zavarzin et al, 2000). В результате изучения этих экосистем, были выделены представители почти всех микроорганизмов, обеспечивающих замкнутость циклов основных биогенных элементов в содовых озерах. Описанию микрофлоры содовых водоемов как целостных экосистем посвящен ряд обзоров (Заварзин и др., 1999; Заварзина и др., 2012; Tindall, 1988; Grant et al, 2000; Zavarzin et al, 2000; Sorokin et al, 2011a, 2014a). Изучение разнообразия и распространения СВБ в соленых

и гиперсоленых содовых озерах Африки, Алтая и Северной Америки показало доминирование в них родов Desulfonatronovibrio, Desulfonatronum и Desulfonatronospira (Scholten et al., 2005; Foti et al., 2007; Sorokin et al., 2010a; Sorokin et al., 2011a). Однако исследования биоразнообразия СВБ содовых озер Бурятии молекулярными методами до сих пор не проводились. Также до настоящего времени не было известно случаев описания алкалофильной железоредукции, осуществляемой сульфатвосстанавливающими бактериями.

В настоящее время изучение микроорганизмов экстремальных экосистем создает основы для новых биотехнологических разработок (Horikoshi, 1999; Podar et al, 2006; Cavicchioli et al, 2011; Zhang et al, 2011). Выделенные и охарактеризованные экстремофильные и экстремотолерантные микроорганизмы представляют интерес как модели для изучения механизмов адаптации и способов стабилизации биомолекул и целых клеток при воздействии различных физико-химических факторов, а также являются возможными источниками получения криопротекторов и ферментов, стабильных в широком диапазоне рН, солености и температуры.

Цель данной работы - поиск, количественная оценка и идентификация анаэробных бактерий, способных использовать соединения серы и железа в качестве акцепторов электронов, в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) с использованием микробиологических и молекулярно-биологических методов.

Задачи работы:

1. Оценка численности сульфатредукторов в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное с помощью метода ПЦР "в реальном времени" (ПЦР-РВ).

2. Разработка праймеров для детекции алкалофильных сульфатредукторов рода Desulfonatronum в природных экосистемах.

3. Выделение новых экстремофильных анаэробных бактерий из содовых озер и криопэгов и
их физиолого-биохимическая и филогенетическая характеристика.

4. Изучение способности новых изолятов алкалофильных сульфатредукторов
восстанавливать Fe(III) в щелочных условиях.

Научная новизна работы. Впервые проведена оценка численности сульфатредукторов в двух экстремальных экосистемах - содовых озерах Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) и криопэгах полуострова Ямал - методом ПЦР-РВ. В результате численность СВБ в образцах донных осадков содовых озер составила 7.9x10 -2.4х 10⁶ копий гена dsrA/r, а в воде криопэгов - 2.7х 10²-6.9х 10³ копий гена dsrAB/мя.

Получены новые данные о видовом разнообразии и метаболическом потенциале сульфатвосстанавливающих бактерий содовых озер и криопэгов. Из арктического криопэга выделен новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор, являющийся представителем нового вида 'Desulfovibrio algoritolerans' sp. nov., способный расти при отрицательных температурах и восстанавливать Fe(III). Из донных осадков содовых озер выделены и охарактеризованы три штамма галотолерантных алкалофильных СВБ. Описан новый вид алкалофильных сульфатредукторов Desulfonatronum buryatense sp. nov. Выделена и охарактеризована бактерия-спутник алкалофильных сульфатредукторов -протеолитическая аммонифицирующая бактерия 'Anoxynatronum buryatense' sp. nov., характеризующаяся способностью восстанавливать соединения серы в процессе роста. Впервые у представителей алкалофильных сульфатредукторов обнаружена способность к восстановлению трехвалентного железа в условиях высокой щелочности среды.

Практическая значимость. Разработаны и экспериментально проверены новые пары праймеров на ген dsrA, являющийся маркерным для сульфатвосстанавливающих бактерий, и ген 16S рРНК сульфатредукторов рода Desulfonatronum, подходящие для использования в ПНР "в реальном времени". Новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор 'Desulfovibrio algoritolerarts' K3S^T может представлять интерес как источник холодоактивных ферментов, а также как компонент искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации поллютантов в условиях холодного климата. Галоалкалофильные штаммы видов Desulfonatronum buryatense Ki5^T и 'Anoxynatronum buryatense' Su22 также могут найти применение в системах биоремедиации, осуществляя удаление токсичных ионов металлов и серы из сточных вод с повышенными значениями солености и рН.

Апробация работы. Материалы работы представлены на российских и международных конференциях: "Биология - наука XXI века- 2009, 2013", на всероссийском симпозиуме с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов - 2009", на международной конференции "10 European Workshop on Astrobiology EANA'2010", на международной конференции "The 5^l FEMS Congress of European Microbiologists - 2013", на 10-м международном конгрессе "Extremophiles 2014" (Санкт-Петербург, Россия).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 8 печатных работах: 2 экспериментальных статьях и 6 тезисах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, который включает 230 наименований.

Место проведения работы и благодарности. Работа выполнена в лаборатории анаэробных микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН). Автор выражает искреннюю благодарность Щербаковой В. А. и всему коллективу лаборатории анаэробных микроорганизмов за практическую помощь, ценные советы и поддержку при написании диссертации. Особую благодарность хочется выразить к.б.н. Арискиной Е.В. (ИБФМ РАН) за помощь в определении Г+Ц состава ДНК и проведении анализа ДНК-ДНК гибридизации; к.б.н. Сузиной Н.Е. и к.б.н. Абашиной Т.Н. (ИБФМ РАН) за помощь в проведении микроскопических исследований; к.б.н. Автуху А.Н. (ИБФМ РАН) за помощь в определении продуктов метаболизма; д.б.н. Осипову Г.А. за определение жирнокислотного состава клеток; д.б.н. Сорокину Д.Ю. (ИНМИ РАН) за предоставленные культуры СВБ; д.б.н., проф. Намсараеву Б.Б. (ИОЭБ СО РАН) за предоставленные образцы донных осадков содовых озер; к.г-м.н. Демидову Н.Э. (ИФХиБПП РАН) за предоставленные образцы воды ямальских криопэгов, а также д.б.н. Хмелениной В.Н., к.б.н. Решетникову А.С. и д.б.н. Троценко Ю.А. (ИБФМ РАН) за ценные советы при написании диссертации.

Филогения сульфатвосстанавливающих прокариот

Сульфатвосстанавливающие микроорганизмы - физиологическая группа прокариот (бактерий и архей), осуществляющих диссимиляционное восстановление сульфатов до сульфида (H2S). Они представляют важное звено, связывающее потоки углерода и серы в анаэробных биотопах, содержащих сульфат. Ассимиляционная сульфатредукция направлена на биосинтез серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин, метионин) при выращивании бактерий на среде, где источником серы служат сульфаты, и не приводит к накоплению сульфида. Активность процесса диссимиляционной сульфатредукции намного выше, чем ассимиляционной, следствием чего является накопление в среде больших количеств H2S.

Первая сульфатвосстанавливающая бактерия (СВБ) была открыта в 1895 г., когда Бейеринк описал бактерию Spirillum desulfuricans\ продуцирующую сульфид водорода в донных отложениях посредством восстановления сульфата (Веуеппск, 1895, цит. по Barton et al., 2009). Но, поскольку техника культивирования анаэробов была недостаточно разработана, знания о СВБ накапливались медленно на протяжении более 50 лет. К середине двадцатого века интерес к этой группе микроорганизмов возрос благодаря их экологической роли и практической значимости в различных областях. Помимо отрицательного воздействия сульфатредукторов на окружающую среду в результате загрязнения выделяемым H2S, биокоррозии металлов и трубопроводов, порчи продуктов термофильными спорообразующими СВБ, сульфатредукторы нашли применение в биоремедиации природной среды от токсичных соединений серы, углеводородов и других органических и неорганических загрязняющих веществ (Widdel, 1986; Janssen et al, 2009; Sorokin et al, 2012b). 1.1.1. Особенности конструктивного и энергетического обмена СВБ

По степени окисления органического вещества все сульфатредукторы делятся на 2 основные группы. К первой относят виды, полностью окисляющие органические субстраты до СОг. Вторую группу составляют организмы, окисляющие субстраты до ацетата и СОг.

Сульфатвосстанавливающие бактерии, осуществляющие полное окисление органического вещества до СОг, используют два различных метаболических пути. Один из них - модифицированный цикл трикарбоновых кислот, детально описанный у Desulfobacter postgatei (Brandis-Heep et al., 1983). Второй -ацетилкоэнзимный путь (путь Вуда-Люнгдаля) (Wood et al., 1986), при котором ацетил-КоА преобразуется с участием СО-дегидрогеназы до СОг. Представителями этой метаболической группы являются бактерии родов Desulfobacterium, Desulfotomaculum и Desulfococcus (Schauder et al., 1986), a также вида Desulfobacca acetoxidans (Elferink et al., 1999).

Сульфатредукторы, осуществляющие неполное окисление субстратов, образуют ацетил-КоА, который далее преобразуется в ацетилфосфат при участии фосфотрансферазы. Из ацетилфосфата в реакции, катализируемой ацетаткиназой, образуется ацетат. Этот процесс сопровождается субстратным фосфорилированием. Данный тип метаболизма характерен для представителей родов Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobulbus и др.

Первоначально считалось, что СВБ способны утилизировать ограниченный спектр субстратов (лактат, формиат, пируват, этанол и др.), но недавние микробиологические и биохимические исследования существенно расширили ряд акцепторов и доноров электронов, используемых СВБ. Более ста веществ, включая сахара, аминокислоты, монокарбоновые и дикарбоновые кислоты, спирты и ароматические соединения являются возможными донорами электронов для СВБ (Fauque et al, 1991, 2004; Rabus et al, 2006). Что касается акцепторов электронов, то СВБ могут восстанавливать большое количество различных соединений. Помимо использования соединений серы (сульфат, сульфит, тиосульфат и элементная сера) и фумарата (Miller et al, 1966), некоторые СВБ (Desulfobulbus propionicus, Desulfovibrio desulfuricans) могут осуществлять диссимиляционную редукцию нитрата или нитрита до аммония (Dannenberg et al., 1992), причем этот процесс дает больший выход биомассы, чем сульфатредукция (Seitz et al., 1986). Desulfosporosinus orientis способен осуществлять карбонатное дыхание, используя СОг как акцептор электронов, который восстанавливается до ацетата при гомоацетатном брожении (Klemps et al., 1985). Более того, некоторые виды Desulfovibrio могут восстанавливать Cr(VI) (Lovley et al, 1994), Fe(III) и U(VI) (Coleman et al, 1993; Wall et al, 2006), хотя восстановление ионов металлов у этих бактерий не сопряжено с ростом. Однако Desulfotomaculum auripigmentum и Desulfotomaculum reducens способны расти с арсенатом (Newman et al, 1997) или Fe(III), Mn(IV), U(VI) и Cr(VI) (Tebo et al., 1998) как акцепторами электронов. Desulfobulbuspropionicus, Desulfococcus multivorans, Desulfobacterium autotrophicum и некоторые виды Desulfovibrio могут осуществлять аэробное дыхание, причем скорость дыхания у Desulfovibrio termitidis выше, чем у большинства аэробных бактерий (Dilling et al., 1990; Kuhnigk et al, 1996; Cypionka et al, 2000). Однако этот процесс не поддерживал рост микроорганизмов.

Виды Syntrophobacter являются особой группой СВБ. Они способны расти на пропионате и сульфате, но были выделены как бактерии, превращающие пропионат в ацетат, СОг и 1 в сокультуре с водородпотребляющими метаногенами и сульфатредукторами (Boone et al, 1980; Harmsen et al, 1993; Wallrabenstein et al, 1994).

Терминальная стадия деструкции органического вещества

Железоредукторы широко распространены в содовых озерах, несмотря на низкую растворимость железа в щелочных условиях, а их численность составляет от 10 до 10 клеток/г осадка. Деятельность железоредукторов приводит к окислению ацетата, водорода и образованию магнетита (БезС ) и сидерита (FeCCb) (Заварзина и др., 2006, 2012; Жилина и др., 2013а). Впервые ассимиляционное восстановление железа в щелочных условиях было показано у алкалофилов Tindallia magadiensis (Kevbrin et al., 1998) и Anoxynatronum sibiricum (Garnova et al., 2003). Ассимиляционное восстановление Fe(III) в содовых озерах также осуществляют алкалофильные бактерии Bacillus arsenicoselenatis (Blum et al., 1998), Alkaliphilus metalliredigens (Ye et al., 2004), Anaerobranca californiensis (Gorlenko et al., 2004). Алкалофильные диссимиляционные железоредукторы представлены Geoalkalibacter ferrihydriticus (Заварзина и др., 2006). Характерно, что G. ferrihydriticus в качестве акцептора электронов (помимо железа) может использовать элементную серу, что позволяет ему существовать и при доминировании цикла серы. Alkaliphilus peptidofermentans (Жилина и др., 2009а), Alkaliphilus sp. (Захарюк, 2010) и Natronincola ferrireducens (Жилина и др., 20096) восстанавливают железо при облегченном брожении, когда электроны, образующиеся при сбраживании пептидов или Сахаров, опосредованно восстанавливают Fe(III). Заключение по обзору литературы

Содовые озера обладают уникальным разнообразием галоалкалофильных бактерий и архей. Многочисленные исследования показали, что современные алкалофильные сообщества содовых озер содержат все основные функциональные группы организмов и могут существовать автономно за счет замкнутости трофических цепей и биогеохимических циклов основных биогенных элементов.

Сульфатвосстанавливающие бактерии содовых озер занимают доминирующую позицию деструкторов органического вещества на заключительном этапе в анаэробных условиях, что обусловлено избытком сульфата и нахождением серы в доступной полисульфидной форме (H2Sn).

Численность этой группы бактерий в содовых озерах достигает 10 кл/мл, скорость сульфатредукции также имеет высокие значения (до 1426 (хмоль/дм -день" ), что подтверждает большую активность СВБ в щелочных экосистемах. Среди представителей СВБ, выделенных в чистые культуры, а также идентифицированных с помощью молекулярных методов, в экосистемах содовых озер четко определяется доминирование трех родов алкалофильных сульфатредукторов, а именно Desulfonatronovibrio, Desulfonatronum и Desulfonatronospira, по всей видимости, наиболее хорошо адаптированных к экстремальным условиям жизни в содовых озерах.

В многолетнемерзлых отложениях полярных областей и криопэгах численность сульфатвосстанавливающих бактерий достигает 10 кл/мл. СВБ этих экосистем являются активным компонентом микробного сообщества и проявляют активность даже при отрицательных температурах, что указывает на существенный вклад в глобальный круговорот веществ и биогеохимические процессы, учитывая, что огромные площади земной поверхности круглогодично находятся при температурах не выше 5С.

Несомненно, щелочные и холодные экосистемы, населенные экстремофилами, представляют огромную ценность для биотехнологий в связи с продукцией ферментов ("экстремозимов"), активных при высоких значениях рН и солености, а также при низких температурах. К примеру, уже сейчас устойчивые к щелочам внеклеточные протеазы, липазы, целлюлазы используются для производства моющих средств (Horikoshi, 1999). Соле- и щелочеустойчивые целлюлазы применяют для расщепления Сахаров в сельскохозяйственных отходах производства биоэтанола из лигноцеллюлозы (Zhang et al., 2011). Помимо ферментов, целые клетки галоалкалофильных СВБ могут быть использованы для удаления токсичных соединений серы из сточных вод и газовых потоков (Janssen et al., 2009), а также для биодеградации углеводородов и других органических (нитроароматических) и неорганических (мышьяк, уран) загрязняющих веществ (Sorokin et al., 2012b). Что касается холодоустойчивых ферментов, то они применяются в производстве бытовых моющих средств, в хлебопекарной, лекарственной промышленности и в молекулярной биологии. Их высокая каталитическая активность при низких температурах позволяет снизить потребление энергии и затраты на производство (Cavicchiolietal.,2011).

Интерес к СВБ экстремальных экосистем неуклонно растет, о чем свидетельствует все большее количество публикаций, посвященных выделению, описанию и изучению физиолого-биохимических свойств сульфатредукторов, адаптированных к условиям низких или высоких температур, экстремально низкой или высокой щелочности среды. Наша работа имеет целью внести свой вклад в изучение распространения и разнообразия СВБ в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия).

Определение продуктов брожения и окисления

Для определения десульфовиридина снимали абсолютный спектр поглощения бесклеточного экстракта и регистрировали пик поглощения при 630 нм (Postgate, 1959). В качестве положительного и отрицательного контроля использовали Desulfovibrio desulfuricans В-1799 и Escherichia coli К-12, соответственно. Состав цитохромов определяли спектрофотометрически по положению максимумов поглощения на спектрах, регистрируемых на двулучевом спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония) при длинах волн 552, 523 и 420 нм.

Получение бесклеточного экстракта: бактериальную культуру анаэробно осаждали при 12000g в течение 10 мин при 4С, промывали в 400 мл фосфатного буфера (рН 6,7) и ресуспендировали в 10-12 мл фосфатного буфера. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Великобритания) в течение 1 мин (процедуру повторяли 20 раз), центрифугировали 20 минут при 12000 g и проверяли супернатант на наличие цитохромов. Анализ состава цитохромов проводили, используя следующие виды спектров: - СО-дифференциальный: препарат, восстановленный дитионитом натрия + СО против восстановленного дитионитом; - абсолютный: восстановленный дитионитом препарат против раствора латекса такой концентрации, чтобы компенсировать поглощение препарата при 600 нм.

Метод определения ионов Fe основан на экстракции ионов феррозином, который образует с двухвалентным железом стабильный комплекс (Lovley et al., 1986). 0.5 мл культуральной жидкости помещали в 3 мл 0.1% раствора феррозина, содержащего 50 мМ HEPES, рН 7.0. Через 1 мин измеряли поглощение при 562 нм на спектрофотометре Specol-221.

Анализ жирнокислотного состава клеток Липиды экстрагировали из биомассы методом кислого метанолиза в смеси 0.4 мл 1.2N НС1 - метанол при температуре 80С в течение 1 часа. Метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали дважды 200 мкл гексана. Экстракт высушивали, обрабатывали 20 мкл Ы,0-бис-(триметилсилил)-трифторацетамида при 80С в течение 15 мин для образования триметилсилиловых эфиров гидроксикислот. Пробу реакционной смеси в 2 мкл -за проведение анализа автор выражает благодарность д.б.н. Г.А. Осипову. анализировали на приборе Шерлок (MIDI Inc. Delawere, США) в автоматическом режиме. Идентификацию веществ, неоднозначно определяемых по времени удерживания на Шерлоке, производили на системе газовый хроматограф - масс спектрометр AG-5973 (Agilent Technologies, США). Разделение осуществляли на капиллярной колонке (25мх0.25мм), покрытой химически связанной метилсиликоновой неподвижной фазой HP-5ms Hewlett-Packard (толщина слоя 0.2 мкм). Хроматографию проводили в режиме программирования температуры от 130 до 320С со скоростью 5/мин. Обработка данных выполнялась с помощью стандартных программ приборов.

Хромосомную ДНК из 5 природных образцов донных осадков экстрагировали с помощью Ultra Clean Mega Prep Soil DNA Kit (MO BIO, США). Для выделения ДНК из образцов воды криопэгов, бактерии концентрировали в 10 раз с использованием пористой диафрагмы, ДНК выделяли набором "Гомо-Сорб" (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Выделение и очистку хромосомной ДНК чистых культур проводили модифицированным методом Мармура (Marmur, 1961). Сырую биомассу ресуспендировали в ТЕ-буфере (ЮмМ Трис рН 8.0; 1мМ ЭДТА), доведя OD6oo до 1.0. К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 2-5 мг/мл и инкубировали 30 мин при 37С на водяной бане. Затем добавляли протеиназу К до конечной концентрации 10-20 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 37С. К суспензии добавляли 20% раствор SDS до конечной концентрации 1-2% и инкубировали 60 мин при 56С. Затем проводили 3 цикла замораживания при -40С и оттаивания при +65С. Далее к раствору добавляли 5М NaCl и 10% ЦТАБ в 0.7М NaCl до конечной концентрации 1М и 1% соответственно. Лизат выдерживали 20 мин при 65С, добавляли равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа (1:1), перемешивали и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, экстрагировали с равным объёмом хлороформа и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин.

Для осаждения ДНК из отобранной верхней фазы добавляли 3 объема охлажденного 96% этанола (или 1 объем изопропанола комнатной температуры) и 0.1 объем ЗМ ацетата калия, тщательно перемешивали и центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин. Осадок ДНК промывали последовательно 80% и 96%-ным растворами этанола и подсушивали на воздухе. ДНК растворяли в ТЕ-буфере. Добавляли раствор РНК-азы до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубировали 1 ч при 37С. Повторяли экстракцию смесью фенола-хлороформа. ДНК из раствора осаждали этанолом или изопропанолом как описано выше.

Концентрацию ДНК измеряли с помощью NanoPhotometerP-Class (Implen, Германия). Выделенные препараты ДНК имели типичные соотношения поглощения при 260/280 и 260/230 нм, лежащие в пределах 1.8-2.0 и 1.5-1.8, соответственно. Первое соотношение является показателем на загрязнение белком, второе - полисахаридом. Растворы ДНК хранили при -20С.

Определение содержания Г+Ц пар в ДНК Содержание Г+Ц пар в ДНК определяли по температуре плавления ДНК (Mesbah et al., 2011; Owen et al., 1985). ДНК диализовали в течение суток против 1000-кратно превосходящего объема O.lxSSC буфера (0.15М NaCl; 0.015 М МазСбН507х5.5Н20, рН 7.0) при 4С при медленном перемешивании на магнитной мешалке. Температуру плавления ДНК определяли на спектрофотометре DU800 Beckman Coulter (Beckman, США) в термостатируемой ячейке при температурах от 60 до 95С со скоростью нагрева 0.5С в минуту. Измерения проводили в трех повторностях. В качестве контроля использовали ДНК D. lacustre Z-7951 с известным составом Г+Ц 57.3+0.5% (Пикута и др., 1998). Расчет вели по формулам: (Г+Ц)%= 56.8+ 2.08 (Tmxmr) и (Г+Ц)%= 57.8 + 2.08 (Tmxmr), - за проведение анализа автор выражает благодарность с.н.с, к.б.н. Е.В. Арискиной (ИБФМ РАН). где Tmx- температура плавления исследуемого штамма, Tmr - температура плавления контрольного штамма, а 56.8 и 57.8 - процентное содержание Г+Ц в ДНК типового штамма D. lacustre с учетом погрешности (Owen et al., 1985).

ДНК-ДНК гибридизация ДНК диализовали против 2 SSC как описано выше и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE на льду до получения фрагментов длиной 500-700 п.н. Реакцию гибридизации проводили в соответствии с протоколом Rossello-Mora с соавт. (Rossello-Mora et al, 2011) на спектрофотометре DU800 Beckman Coulter (Beckman, США).

Поиск нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и dsrAB СВБ проводили в международной базе данных GenBank. Процедуру выравнивания нуклеотидных (16S рРНК) и аминокислотных {dsrAB) последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTAL W (Larkin et al., 2007). Поиск наиболее консервативных участков, перспективных для конструирования праймеров, проводили вручную. Проверку специфичности праймеров проводили с использованием web-pecypca http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov. Оценку конформации шпилечных структур, образуемых праймерами, силу их связей и температуру плавления осуществляли с помощью программы FastPCR 6.5 (Kalendar et al., 2014). Олигонуклеотиды произведены фирмами Евроген (г. Москва) на синтезаторе Applied Biosystems ABI 3900 (США) и Синтол (г. Москва) на синтезаторе ASM-1000 (Биосет, Россия).

Обнаружение сульфатвосстанавливающих бактерий в содовых озерах Соленое и Сульфатное

Изолят не рос на индивидуальных аминокислотах, а именно лизине, глутамине, аргинине, гистидине, валине, орнитине, урациле, аланине, холине, пролине, цитруллине и серине. Также не наблюдалось роста на парах аминокислот (аланин+глицин, лейцин+пролин, валин+орнитин, гистидин+аргинин, аланин+триптофан, аланин+аспарагин, изолейцин+пролин, валин+глицин), входящих в состав дрожжевого экстракта, что является тестом на реакцию Стикленда. Следовательно, рост штамма Su22 связан с ассимиляцией неидентифицированных компонентов дрожжевого экстракта.

Штамм Su22 не требовал добавления в среду акцепторов электронов. Тем не менее, добавление в среду серосодержащих акцепторов электронов стимулировало его рост. Элементная сера ингибировала рост референтного штамма A. sibiricum Z-7981 , тогда как остальные содержащие серу акцепторы электронов также стимулировали его рост. Рост изолята на тиосульфате и элементной сере сопровождался образованием сульфида (1.98 и 3.2 мМ, соответственно). Такие акцепторы электронов, как DMSO, фумарат, Fe(III) и NaNCb не стимулировали рост штамма Su22 .

При росте на дрожжевом экстракте (2 г/л) штамм Su22 образовывал аммоний, формиат и ацетат в качестве основных продуктов, а также пропионат в качестве минорного продукта. Изолят не продуцировал водород и этанол. Таким образом, физиологически штамм Su22 относится к первичным анаэробам, использующим белковые соединения для роста.

Липидный анализ. Сравнение профилей жирных кислот штаммов Su22 и A. sibiricum Z-7981 показало, что доминирующими соединениями для них являются Сіб:ісо7с, Сіб:0 и Сіб:0а (Таблица 14). В сумме они составили 54.34 и 42.51% от общего количества ЖК для штаммов Su22 и A. sibiricum Z-7981 , соответственно. Однако по составу минорных компонентов профили значительно различались. Так, клетки штамма Su22 содержали насыщенную т Ci2:0 И Ненасыщенную Ci7:lco9 КИСЛОТЫ, а КЛеТКИ ШТаММа Z-7981 - Сі3:0 , Сі4:Ь5,

Г+Ц пар в ДНК штамма Su22 составило 46.1 ±0.5 мол %. Уровень сходства ДНК штамма Su22 с A. sibiricum Z-7981 составил 69%. Сравнение фенотипических свойств штамма Su22 и типового штамма вида A sibiricum Z-7981 (Таблица 15) показало, что их объединяет способность к ферментативному росту, использование триптона в качестве донора электронов и тиосульфата в качестве акцептора электронов, а также способность расти на разрушенной микробной биомассе. Оба штамма имеют схожие температурные диапазоны, но различные температурные оптимумы для роста. Они являются облигатными алкалофилами, оптимально растущими при рН 9.5 (Su22 ) и 9.1 (А. sibiricum). В отличие от сахаролитической бактерии A sibiricum Z-7981 , штамм Su22 не сбраживал сахара, пептон, и не рос на отдельных аминокислотах или их парах. Кроме тиосульфата, он восстанавливал элементную серу в процессе роста на дрожжевом экстракте. Таблица 15. Дифференцирующие характеристики штаммов Su22 и Z-7981

Таким образом, полученные фенотипические и генотипические характеристики новой бактерии убедительно свидетельствуют в пользу того, что она является представителем нового вида рода Anoxynatronum, для которого предложено название Anoxynatronum buryatense sp. nov.

Протеолитические бактерии содовых озер играют важную роль в функционировании алкалофильных микробных сообществ, обеспечивая субстратами микроорганизмы, участвующие в цикле углерода и азота в этих экосистемах. Мы выделили и описали новую алкалофильную протеолитическую бактерию - спутника сульфатредуктора, выделенного из содового озера Сульфатное.

Восстановление Fe(III) сульфатвосстанавливающими бактериями в щелочных условиях Большинство железоредуцирующих бактерий являются нейтрофилами (Straub et al, 2001; Lovley et al, 2004; Заварзина и др., 2012). До недавнего времени восстановление аморфного и слабокристаллического оксида железа в содовых озерах считалось невозможным из-за низкой доступности Fe(III) при щелочной реакции среды (Ye et al. 2004). Однако, некоторые алкалофильные бактерии, выделенные из содовых озер, оказались способны восстанавливать как растворимые, так и плохо растворимые соединения железа (Zavarzina et al., 2006; Zhilina et al., 2009 a,b). Нами впервые выделены два штамма СВБ (штамм КІ5 и Su2), способные использовать аморфную гидроокись Fe(III) как акцептор электронов во время роста при рН 9.5-10.0. Восстановление аморфного гидроксида Fe(III) сопровождалось образованием 3.54 (Su2) и 3.12 (КІ5 ) молей Fe(II) на 1 моль потребленного лактата в третьем пересеве. Как было показано для штамма Su2 (Рисунок 22), процесс восстановления железа сопровождался накоплением ацетата и увеличением численности клеток от единичных до 10 кл/мл. Таким образом, это первое описание алкалофильной железоредукции, осуществляемой сульфатвосстанавливающими бактериями. Экологическую роль этого феномена в содовых озерах следует исследовать более детально. Возможно, эта способность генетически закрепилась в исследуемых бактериях во времена доминирования цикла железа и позволила адаптироваться к окружающей среде без сульфата.