Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Особенности таксономии и биологии легионелл 19
1.1.1 Общая характеристика возбудителя 19
1.1.2 Особенности таксономии легионелл 23
1.1.3 Особенности биологии легионелл 28
1.2. Лабораторная диагностика легионеллёза 32
1.2.1 Выделение и идентификация культуры легионелл из клинического материала 34
1.2.2 Серологическая диагностика легионеллеза 39
1.2.3 Определение антигена легионелл в моче больных 41
1.2.4 Выявление легионелл в клиническом материале методом прямой иммунофлюоресценции 44
1.3 Экология легионелл в потенциально опасных водных системах 44
1.3.1 Легионеллы в воде и почве 45
1.3.2 Легионеллы и простейшие 50
1.3.3 Легионеллы и биопленки 52
1.3.4 Выделение легионеллы из окружающей среды 57
1.3.5 Методы контроля и мониторинга легионелл в потенциально опасных водных системах 59
1.4 Заключение 61
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
Материалы 63
2.1 Штаммы легионелл, клинический материал (бронхоаль- 63
веолярный лаваж, моча) Методы 74
2.2. Лабораторная диагностика легионеллёза 74
2.2.1 Определение антигена в моче 74
2.2.2 Микробиологическое исследование БАЛ 75
2.2.3 Применение ПЦР-РВ для диагностики легионеллезной инфекции у гематологических больных 76
2.3. Выявление легионелл в потенциально опасных водных объектах окружающей среды 78
2.3.1 Бактериологическое исследование воды и биопленок 78
2.3.2. Характеристика выделенных штаммов 81
2.3.2.1 Идентификация легионелл 81
2.3.2.2 Типирование легионелл с помощью панели моноклональ-ных антител 81
2.3.2.3 Секвенирование ДНК легионелл 83
2.4. Получение бактериальных биопленок 85
2.4.1. Получение моновидовых биопленок 85
2.4.2 Получение биопленок других микроорганизмов 86
2.4.3. Изучение природных биопленок 88
2.4.3.1 Высев из биопленок на легионеллы и другие микроорга низмы 88
2.4.3.2 Электронно-микроскопическая характеристика биопленок 88
2.5 Статистическая обработка результатов 89
ГЛАВА 3. Результаты исследований 90
3.1. Диагностика легионеллеза у больных тяжелыми пневмо ниями 90
3.1.1 Разработка алгоритма диагностики легионеллёза при вне-больничных пневмониях 90
3.1.2 Разработка алгоритма диагностики легионеллёза при лёгочных осложнениях у иммунокомпрометированных па 4
циентов 98
3.2. Разработка алгоритма выявления легионелл в окружаю щей среде 100
3.3. Применение разработанного алгоритма при расследова нии эпидемических вспышек легионеллёза 107
3.3.1. Применение разработанного алгоритма при расследовании вспышки внебольничного легионеллеза в Верхней Пышме 107
3.3.2. Применение разработанного алгоритма при анализе случаев пневмоний в ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации 119
3.4. Изучение особенностей формирования модельных и при родных биопленок легионелл 127
3.4.1. Особенности формирования модельных биопленок в экспериментальных условиях 127
3.4.2. Изучение особенностей формирования биопленок в открытых (градирни промышленных предприятий) и закрытых (системы горячего водоснабжения общественных зданий) водных системах 134
3.5. Сравнительное изучение особенностей колонизации ле гионеллами 2-х типов потенциально опасных водных систем в регионах России 147
3.5.1. Особенности колонизации градирен промышленных предприятий 148
3.5.2. Особенности колонизации легионеллами систем водоснабжения общественных зданий 150
3.5.3. Серологическое разнообразие выделенных штаммов Le-gionella pneumophila, циркулирующих в градирнях и сис 5
темах водоснабжения в Российской Федера
ции 152
3.6. Создание национальной коллекции легионелл 157
Обсуждение 159
Выводы 178
Список литературы
- Выделение и идентификация культуры легионелл из клинического материала
- Лабораторная диагностика легионеллёза
- Типирование легионелл с помощью панели моноклональ-ных антител
- Сравнительное изучение особенностей колонизации ле гионеллами 2-х типов потенциально опасных водных систем в регионах России
Выделение и идентификация культуры легионелл из клинического материала
Возбудитель представляет собой мелкую грамотрицательную кислотоустойчивую палочку длиной 2-3 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм. В ряде случаев можно наблюдать и более длинные нити до 20 мкм, а иногда и до 50 мкм. Полиморфизм и интенсивное нитеобразование характерны для культур легионелл, выделенных из секционного материала или от павших лабораторных животных. После нескольких пассажей на искусственных питательных средах вариабельность формы и размеров клеток легионелл, как правило, исчезает. Легионеллы не образуют спор, размножение происходит путем бинарного деления; они подвижны благодаря наличию одного или нескольких жгутиков, прикрепленных, как правило, к одному из полюсов клетки.
Помимо жгутиков, у многих легионелл на внешней поверхности клеточной стенки формируются пили (фимбрии), равномерно распределенные по всей поверхности клетки. Как правило, фимбрии лучше всего заметны у бактерий в период логарифмической фазы роста на питательных средах. Структура клеточной стенки, включая более электронно-плотный внешний слой и менее плотную ци-топлазматическую мембрану (внутренний слой), в целом, типична для грамотри-цательных бактерий.
Легионеллы значительно отличаются от других грамотрицательных бактерий по содержанию липидных компонентов. Клеточная стенка легионелл характеризуются значительным содержанием фосфолипидов, а среди жирных кислот до 90% составляют соединения с разветвленными боковыми цепями. Среди грамот-рицательных бактерий только Thermus aquaticus и термофильная Flavobacterium содержат значительное количество жирных кислот с разветвленными цепями. Другим важным отличительным признаком всех видов легионелл является наличие убихинонов (кофермент Q) с боковыми цепями, представленными 9-14 изопреновыми радикалами [1]. Соотношение различных типов жирных кислот и убихинонов является достаточно важным таксономическим признаком, позволяющим идентифицировать различные виды легионелл с помощью газово-жидкостной хроматографии [2]. Данный методический подход активно использовался для таксономически надежной идентификации культур легионелл в 80-е годы прошлого века, пока не был вытеснен бурно развивавшейся техникой молекулярно-генетического типирования.
Возбудитель легионеллеза отличается своеобразными требованиями к условиям культивирования. Это факультативный внутриклеточный паразит, требующий для своего культивирования обогащенных питательных сред со специфическими ростовыми добавками и узкого диапазона pH и температуры. В отличие от многих патогенных микроорганизмов, утилизирующих углеводы, легионеллы в качестве источника энергии и питательных веществ используют аминокислоты, а не сахара. L-цистеин является обязательным компонентом всех питательных сред для выращивания легионелл. Помимо цистеина показана необходимость для роста ле-гионелл и других аминокислот – аргинина, лейцина, метионина, треонина, серина, валина и изолейцина, а также ионов железа, источником которых в питательных средах является растворимый пирофосфат железа.
Большинство видов легионелл характеризуются сходными культуральными и биохимическими свойствами. Бета-лактамаза продуцируется всеми известными к настоящему времени видами, за исключением L.micdadei, L. feeleii и L.maceachernii. Гидролиз гиппурата характерен для представителей всех серог-рупп вида L.pneumophila, за исключением сероваров 4 и 15, а также для L. feeleii [3,4]. Практически все штаммы легионелл, за редким исключением, разжижают желатин. В 80-ые годы прошлого века биохимические и культуральные тесты широко использовались для идентификации видов легионелл. Совокупность тестов включала определение каталазной и оксидазной активности, разжижение желатина, определение тирозиназной активности (образование коричневого пигмента в процессе культивирования), гидролиз гиппурата Na и крахмала, анализ флюоресцирующего свечения колоний при ультрафиолетовом освещении, а также цвета колоний на средах с красителями (бромкрезоловым красным и бромтимоловым синим). Но большое число тестов далеко не всегда соответствовало специфичности полученных результатов [21]. В настоящее время биохимические и культу-ральные тесты могут быть использованы для паспортизации штаммов легионелл, но не для быстрой идентификации выделенных культур.
По устойчивости к действию химических и физических факторов легионеллы не отличаются от большинства неспоровых форм бактерий. Возбудитель не обладает кислотоустойчивостью и не окрашивается по Цилю-Нильсену. В лабораторных условиях клетки L.pneumophila в суспензии (106-107 КОЕ/мл) погибают в течение минуты при действии 1% формалина, 70% этилового спирта, 0,002% фенола. 3% раствор хлорамина вызывал гибель возбудителя в течение 10 мин. при концентрации суспензии легионелл 109КОЕ/мл. При хранении культур легионелл в полужидком агаре с добавлением глицерина при -70оС они сохраняли жизнеспособность более 10 лет. Показана также способность легионелл к длительному сохранению в дистиллированной и водопроводной воде – в течение нескольких недель или месяцев при комнатной температуре [5]. Хотя возбудитель высокочувствителен к действию различных химических и физических агентов, требователен к температуре и pH среды культивирования, в водной среде и при низких температурах он может сохраняться достаточно долго. Таким образом, диапазон физико-химических и биологических условий существования легионелл достаточно широк.
Лабораторная диагностика легионеллёза
После первых вспышек болезни легионеров и открытия нового инфекционного агента стало ясно, что водная среда обитания является основной для легионелл. В центре внимания первоначально оказались, прежде всего «искусственные» водные системы с размножением в которых возбудителя были непосредственно связаны вспышки болезни легионеров. Основные современные представления о ле 45
гионеллах в природных водных системах были сформулированы в работах С.Fliermans et.al. в начале 80-х годов прошлого века [55, 56, 57]. В то время еще не были разработаны оптимальные питательные среды для выделения легионелл из окружающей среды, поэтому в качестве основных методов выявления возбудителя использовали прямую иммунофлюоресценцию, дополненную окраской тетра-золиевым красителем для выявления живых клеток, и заражение морских свинок.
Научно-исследовательский центр Саванна Ривер в Южной Каролине (США) под руководством Флиерманс с помощью мобильных лабораторий собрал и исследовал 793 образца воды (объемом по 22 литра) из 67 крупных и очень разных водоемов США (озера, реки, термальные источники, водоисточник в окрестностях действующего вулкана). С помощью иммунофлюоресценции L.pneumophila была выявлена практически во всех водоемах. Концентрация легионелл была низкой и не превосходила в среднем 103 КОЕ/л воды. Популяционная плотность ле-гионелл в водных экосистемах не превышала 1% от общей бактериальной популяции. Более высокая концентрация легионелл была выявлена в природных термальных водах и минеральных источниках с теплой водой в диапазоне от 36о до 60оС и составляла от 104 до 108 КОЕ/л. Культуру возбудителя выделяли путем заражения морских свинок сконцентрированными до 1 мл образцами воды, что позволило выделить 47 штаммов L.pneumophila из водоемов с самыми различными физическими, химическими и биологическими особенностями. Диапазон температуры водоемов – от 5,7 до 63оС, рН-5,0-8,5, растворенного кислорода – 0,2-9,6 мг/л, мутности (видимость диска на глубине)-1-4м, концентрации хлорофилла – 0,7-2,4 г/м3, феофитина – 0,2-18,8 мг/м3. Sheehan et.al.(2005) c помощью ПЦР показал присутствие 4-х видов легионелл в сообществе с эукариотическими водорослями в экстремально кислой среде (pH-2,7) в Йелстоунском национальном парке, США[58]. Легионеллы выделяли из грунтовых вод скальных пород с глубины 57 метров, где плотность микробной популяции крайне низка [59]. Наиболее высокая частота выделения легионелл приходилась на термальные водоемы с температурой от 40о до 60оС, хотя в нескольких случаях легионелы выделяли из рек покрытых льдом. Легионеллы не выделяли и даже не выявляли методом им-мунофлюоресценции из морской и океанической воды, однако одной группе исследователей удалось выделить легионеллы из воды Карибского моря [60].
В дальнейшем экологические исследования на базе более современных методов показали, что культуру Legionella spp. можно выделить из 40% пресных водоемов, а в 80% водоемов легионеллы выявляют методом ПЦР [61]. Наряду с водой в качестве возможной среды обитания легионелл в первые годы после открытия возбудителя рассматривали и почву. Этому способствовало расследование ряда вспышек легионеллеза 70-х годов ХХ века, преимущественно, ретроспективное, когда рядом с местом возникновения вспышки проводились земляные работы и отсутствовали градирни. В дальнейшем было установлено, что легионеллы не способны к существованию в сухой среде и, в частности, в почве. При расследовании упомянутых вспышек не учитывалась возможность колонизации легионел-лами системы водоснабжения, о чем тогда не было известно. Тем не менее, в качестве исключения существует один вид легионелл, для которого доказана связь с почвой. Речь идет о виде L.longbeachae, который периодически выделяют из готовой почвенной смеси для посадки комнатных растений, преимущественно, в Австралии. Этот вид долгое время считали эндемичным для Австралии, где зарегистрировано заметное количество случаев пневмонии, вызванной L.longbeachae . В ряде случаев была доказана связь с почвенной смесью цветочных горшков. С 2000 года случаи L.longbeachae пневмонии, ассоциированные с почвенной смесью для цветочных горшков, выявляют и в США [62].
Полученные данные убедительно показали, что легионелла – естественный обитатель природных пресноводных водоемов, способный к существованию в самом широком диапазоне условий внешней среды. При этом были установлены следующие важные для понимания экологии легионелл факты. Данные о высокой концентрации легионелл в природных термальных источниках и водоемах позволили предположить, что возбудитель ассоциирован с этими экосистемами достаточно длительный исторический период и они наиболее благоприятны для размножения легионелл. Микроорганизмы, ассоциированные с этими экосистемами, как правило, мезофилы или термофилы с температурным оптимумом роста от 30о до 90оС. Для микроорганизмов данных экосистем характерно присутствие высокого содержания жирных кислот с разветвленными цепями, что также является важной таксономической особенностью легионелл. Возбудитель, попадая в менее благоприятные для активного размножения пресноводные водоемы, не представлял опасности для человека, пока человеческая цивилизация не создала «искусственные» водные системы еще более благоприятные для накопления легионелл, чем природные. Человек постоянно соприкасается с подобными экосистемами в условиях современной цивилизации, что рано или поздно должно было привести к вспышкам болезни легионеров (рисунок 2). Парадокс полученных данных состоял и в противоречии между исключительно широким диапазоном условий внешней среды в природных водных экосистемах, в которых обитают легионел-лы, и очень жесткими требованиями к условиям выделения и культивирования легионелл на питательных средах (рН, температура, состав среды и ростовых добавок). Исследования Флиерманс показали значительные различия в частоте выделения легионелл через заражение морских свинок и их определения в воде методом иммунофлюоресценции. И хотя через несколько лет, в середине 80-х годов, была оптимизирована и стандартизована процедура выделения легионелл из воды на питательных средах, а на смену иммунофлюоресценции для выявления легио-нелл в окружающей среде пришла ПЦР и другие модификации молекулярно-генетических методов разница между количественным выделением и «количественным прижизненным определением» легионелл в одних и тех же образцах во многих экологических исследованиях была существенной.
Типирование легионелл с помощью панели моноклональ-ных антител
Тестирование всех штаммов легионелл на способность формировать биопленки проводили в 96луночных плоскодонных пластиковых планшетах для иммунофер-ментного анализа («Costar») [123]. Выращенные в бульоне культуры тестируемых штаммов разводили свежей питательной средой 1:10. Полученные суспензии стерильно вносили по 150 мкл в лунки планшет (по 4 лунки для каждого штамма). Для контроля фона также в 4 лунки вносили питательную среду, в которой инкубировали культуры. Планшет помещали в термостат на 96ч (при температуре 28oС) для подращивания. Оптическую плотность выросших планктонных клеток определяли на фотометре iEMS Reader MF «Labsystems» (Швеция) при длине волны 540 нм. Затем содержимое лунок осторожно отбирали и вносили по 150 мкл дистиллированной воды и 15 мкл 1% спиртового раствора кристалл виолета. Планшеты инкубировали при комнатной температуре (20оС) в течение 45 мин. Затем краситель осторожно удаляли и промывали лунки дважды дистиллированной водой. В отмытые от несвязавшейся краски лунки вносили по 200 мкл этилового спирта и оставляли на 45 мин при комнатной температуре. Интенсивность окрашивания спирта в лунках планшеты оценивали на фотометре при длине волны 540 нм.
Отработку оптимальных условий образования монобиопленок легионеллами осуществляли, используя типовой штамм L.pneumophila Philadelphia 1. Сравнительную оценку способности штаммов Legionella spp. к формированию биопленок производили при культивировании в питательной среде (96 часов) и воде (до 2 недель).
Данные средних арифметических значений, полученные для каждой из четырех лунок при определении оптической плотности клеток и интенсивности окрашивания спиртового раствора, обрабатывали по программе Excel.
Для работы использовали типовые штаммы Salmonella typhimurium и Pseudo-monas aeruginosa. Бактериальные культуры выращивали в жидкой Luria-Bertani (LB) или агаризованной среде MacCONCEY AGAR (DIFCO), SS –агар при 370С. Тестирование штаммов сальмонелл и псевдомонад на способность формировать биоплёнки проводили в плоскодонных пластиковых планшетах для иммунофер-ментного анализа.
Для получения моновидовых биопленок ночную культуру типового штамма S.typhimurium и P.aeruginosa разводили свежей питательной средой 1:100. Полученные суспензии стерильно вносили по 150мкл в лунки планшет (в 4 лунки для каждого штамма). Для контроля фона также в 4 лунки вносили питательную среду, в которой инкубировали культуры. Планшет помещали в термостат на 24 часа для подращивания. Далее действовали аналогично методике описанной выше (см. получение биоплёнок легионелл).
Для получения биопленок P. aeruginosa, cуточную культуру дважды отмытую от бульона разводили 1:4 и 1:40 дистиллированной водой и вносили в лунки плоскодонного планшета по 150 мкл, инкубировали в течение 3-х суток при 28оС. После инкубации содержимое лунок аккуратно удаляли и вносили 150мкл культуры легионелл, дважды отмытой от бульона и разведенной 1:1 дистиллированной водой. После 7суток инкубации аккуратно удаляли содержимое из лунок и к полученной биопленке добавляли по 100мкл стерильной дистиллированной воды. Cодержимое лунок cуспендировали, и из полученной взвеси делали разведения (102, 104, 106), так как концентрация бактерий в биопленках достаточно высока. Далее делали высев из разведений на чашки со средой BCYE для учета легионелл и MacCONCEY AGAR для учета псевдомонад. Высевы на среды производились на 7е и 14е сутки после подселения легионелл.
Биопленки сальмонелл готовили аналогично псевдомонадным (см. выше), так же высев из разведений на чашки делали со средой BCYE для учета легионелл и SS-агар для учета сальмонелл. Высевы на среды производились на 7е и 14е сутки после подселения легионелл. 2.4.3 Изучение природных биопленок
Образцы биопленок из окружающей среды исследовали в соответствии с разработанным алгоритмом. Образцы биопленок, смывы с поверхностей подвергали концентрированию с помощью центрифугирования, кислотной и термической обработке.
При высеве биопленок на легионеллы для снижения уровня загрязненности сконцентрированной пробы посторонней микрофлорой одну ее часть подвергали прогреванию, а другую обрабатывали кислотным буфером.
При высеве биопленок на другие сопутствующие микроорганизмы, после концентрирования пробы, высевали по 0,1 мл на питательный агар для общего подсчета колоний, кровяной агар, агар Эндо, SS-агар, энтерококковый агар. Термо-статировали при 30ОС и 37ОС в течение 2-5 суток.
Для изучения биопленок методом сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, были взяты соскобы из градирен промышленных предприятий. Предварительно проведенные бактериологические исследования соскобов показали присутствие в них легионелл.
В работе исследовали также образцы биопленок из систем горячего водоснабжения общественных зданий г. Москвы. Для исследования формирования биопленок L.pneumophila в системах горячего водоснабжения, на водопроводные краны монтировали антибактериальные фильтры Pall («Аквасейф»). После экспозиции в течение 1, 2 и 3 недель соответственно фильтры демонтировали и исследовали биопленку, сформировавшуюся на внешней поверхности фильтра [124]. Для изучения биопленок методами сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии полученные образцы были фиксированы по методу Ito – Karnovsky [125].
Для анализа ультратонких срезов биопленки препараты были подготовлены по общепринятой методике заливки в заливочную среду (метакрилатную смолу) LR White [126]. Ультратонкие срезы получали с помощью ультрамикротома LKB – 3, окрашивали по методу Reynolds [127], и изучали в электронном микроскопе JEOL 100 B (Japan).
В работе был проведен рентгеновский микроструктурный анализ образцов с помощью приставки EDAX (EDAX Inc. USA) к сканирующему электронному микроскопу Quanta 200 3 D. Пробоподготовка образцов для этого метода исследования заключалась в упомянутой выше фиксации и напыления нанослоем золота, толщиной 5 nm, что позволяло сохранить нативную структура образца. С помощью этого метода исследования возможно проводить анализ микроэлементного состава объекта.
Для проведения исследований была создана база данных в программе Excel Of-fice2010. Все анализируемые параметры вносили в эту базу с последующей статистической обработкой с помощью программ Statistica 10. Для анализа данных использовали методы описательной статистики и частотный анализ. Для сравнения качественных признаков применяли критерий 2. Статистически значимыми считали различия при степени вероятности безошибочного прогноза 95% (p 0,05).
Сравнительное изучение особенностей колонизации ле гионеллами 2-х типов потенциально опасных водных систем в регионах России
В середине июля 2007 года в городе Верхняя Пышма Свердловской области была выявлена эпидемическая вспышка легионеллезной инфекции, которая продолжалась около 3-х недель.
Верхняя Пышма, небольшой город в окрестностях Екатеринбурга с населением 70 тыс. человек. Данный город является крупным центром цветной металлургии не только в масштабах Уральского региона, но и всей страны. Градообразующее предприятие - Уральский Горно-Металлургический комбинат (УГМК). Лето 2007 года на Урале было очень жарким, температура часто превышала 32-33оС. ОРЗ в июле не превышало в Верхней Пышме обычных сезонных значений до 15 июля, неожиданно начался резкий подъем заболеваемости, продолжавшийся до 30 июля. Всего за период вспышки было госпитализировано 190 человек с предполагаемым диагнозом инфекции нижних дыхательных путей, в 5 случаях имел место летальный исход. Среди заболевших легионеллезной пневмонией преобладали лица 50 лет (68,9%) и старше, мужского пола (70%), курящие составили 53%. Большая часть заболевших имела, по крайней мере, одно фоновое заболевание (сердечно-сосудстой системы - 55%, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) - 50%).
С 25 июля число обращений за медицинской помощью больных с рентгенологически подтвержденной пневмонией составило до 10-12 человек в сутки. В течение 26-27 июля специалистами различных подразделений Минздрава и Роспот-ребнадзора Свердловской области была исключена возможная роль в возникновении вспышки других этиологических агентов кроме пневмококков и легионелл.
Большая часть случаев заболеваний приходилась на период с 15 по 25 июля. Предварительные результаты эпидемиологического расследования показали, что начало вспышки с учетом инкубационного периода заболевания, составляющего от 2 до 10 дней, коррелирует с запуском воды в систему горячего водоснабжения города после нескольких недель ремонтно-профилактических работ (ремонт СуГ-РЭС, опрессовки).
Предварительный диагноз легионеллез был поставлен 27 июля по результатам исследования образцов сыворотки крови 59 больных пневмонией с помощью им-муноферементной тест-системы для обнаружения иммуноглобулинов класса М к L.pneumophila серогруппа 1 («Vircell», Испания). Ранние JgM антитела Legionella pneumophila 1 были выявлены у 25 больных. Метод определения ранних JgM ан 109 тител к возбудителю легионеллеза не входит в стандарты лабораторной диагностики инфекции, так как в первую неделю заболевания возможно как выявление JgM антител, так и полное их отсутствие, особенно у пациентов с выраженным иммунодефицитом, а также перекрестные реакции с некоторыми возбудителями респираторных инфекций. Тем не менее, положительные результаты исследований данным методом у 42,4% обследованных позволили с высокой степенью вероятности предположить у них диагноз легионеллез (таблица 13).
При последующем применении стандартов лабораторной диагностики легио-неллеза в качестве первого шага было выбрано применение иммунохроматогра-фического метода для определения легионеллезного антигена в моче больных. Образцы мочи были взяты у группы наиболее тяжелых больных, находящихся в реанимационном отделении (8 человек). Исследования на выявление легионел-лезного антигена в моче каждого больного проводилось с помощью 2х типов им-мунохроматографических тест-систем Binax Now и SAS Legionella test (США). В течение 30 минут положительные результаты, продублированные обеими тест-системами, были получены для 5 больных. Еще у 2-х заболевших при использовании тест системы Binax Now были получены положительные результаты, при использовании SAS Legionella test сомнительные. У одного больного отрицательные результаты были получены при использовании обоих тест-систем. Параллельно секционный материал от 3 умерших больных был исследован с помощью количественной модификации ПЦР с видоспецифическими праймерами на mip ген L.pneumophila. ДНК возбудителя в высокой концентрации была выявлена в образцах легочной ткани пациентов, умерших от легионеллезной пневмонии.
Поскольку иммунохроматографический метод определения антигена в моче рекомендован ВОЗ и Европейской рабочей группой по легионеллезу для окончательного подтверждения диагноза легионеллезной инфекции и положительные результаты, полученные данным методом, были дополнены с помощью ПЦР материала аутопсии, то 29 июля можно считать датой окончательного подтверждения легионеллезной этиологии вспышки.
Следующим шагом применения стандартов стало использование бактериологического метода для исследования секционного материала (легочная ткань) от 3-х пациентов, умерших от пневмонии, и исследование 67 образцов мочи больных на наличие антигена с помощью количественного иммуноферментного метода (BIOTEST, Германия).
Применение иммуноферментного метода позволило в течение 4 часов количественно выявить легионеллезный антиген в 33 образцах мочи. Причем в образцах мочи, исследовавшихся ранее иммунохроматографическим методом от 7 тяжелых больных легионеллезом, находившихся в реанимационном отделении, концентрация антигена была особенно велика, превосходя уровень рекомендованного положительного контроля в 8-10 раз.
Культура L.pneumophia серогруппа 1 была выделена из легочной ткани 1 из 3 умерших пациентов после 5 дней культивирования на среде буферный угольно-дрожжевой агар (BCYE) c селективной добавкой, содержащей цефамандол, поли-миксин и анизомицин (модификация данной среды называется также BMPA). Последующая идентификация культуры с помощью бактериологических тестов, латекс-агглютинации и ПЦР заняла 2 суток.
30 июля были начаты исследования образцов воды из потенциально опасных водных систем города. В качестве таковых рассматривались 3 возможных объекта: градирни предприятия УГМК (3 градирни), комплекс из двух фонтанов в центре города, горячая вода из центральной системы водоснабжения города (таблица14).