Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 20
Антигенсвязывающие фрагменты моноклональных антител 20
Отличительные особенности молекулярной структуры однодоменных антител23
Технология получения однодоменных антител 25
Продуценты однодоменных антител 33
Использование однодоменных антител для диагностики бактериальных инфекций 35
Использование однодоменных антител для терапии бактериальных инфекций 38
Представление о факторах вирулентности микоплазм 43
Патогенный потенциал Mycoplasma hominis 45
Лечение инфекций, вызванных Mycoplasma hominis, и поиск новых терапевтических мишеней 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
Материалы 49
Оборудование, использованное в диссертационной работе. 49
Микроорганизмы, используемые в диссертационной работе. 50
Линии клеток млекопитающих, использованные в диссертационной работе. 51
Плазмидные векторы, используемые в диссертационной работе. 52
Ферменты для молекулярно-биологических процедур . 52
Питательные среды и вещества. 53
Методы 53
Общелабораторные методы и подходы. 53
Культивирование микроорганизмов и культур клеток млекопитающих. 53
Выделение нуклеиновых кислот. 55
Молекулярное клонирование фрагментов ДНК. 55
Полимеразная цепная реакция. 56
Электрофоретическое разделение макромолекул. 58
Иммуноблоттинг. 58
Биотинилирование белков. 60
Определение нуклеотидной последовательности ДНК. 60
Получение однодоменных антител. 60
Выделение липид-ассоциированных мембранных белков (LAMPs) M. hominis. Иммунизация, отбор крови и выделение лимфоцитов. 61
Выделение РНК из лимфоцитов и синтез кДНК. 62
ПЦР-амплификация последовательностей VHH. 62
Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4 и получение библиотеки клонов-трансформантов . 63
Получение библиотеки бактериофагов. 64
Определение титра бактериофагов методом подсчета трансдуцирующих единиц. 65
Паннинг на антигене. 65
Скрининг клонов. 66
Получение рекомбинантных конструкций для экспрессии белков 69
Трансформация. 70
Продукция и очистка рекомбинантных белков. 72
Определение кинетических констант реакций. 74 Получение рекомбинантных аденовирусов. 74
Методы работы с животными 77
Статистическая обработка результатов исследований. 78
Биоинформатические методы. 79
ГЛАВА 3. Результаты 80
Получение и характеристика однодоменных антител, специфически связывающихся с M. hominis 80
Получение последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. 80
Получение белкового препарата VHH. 88
Характеристика специфичности aMh06. 95
Тримеризация aMh06. 96
Создание продуцентов препаратов на основе aMh06 с изолейциновым зиппером (aMh06-ILZ-НА) 97
Определение термодинамических характеристик взаимодействия aMh06-ILZ с антигеном. 103
Идентификация антигена 105
Изучение диагностического потенциала препаратов на основе aMh06 для детекции M. hominis 107
Генетическая пассивная иммунизация для защиты от урогенитальной инфекции, вызванной M. hominis 113
Противомикоплазменное действие aMh в условиях in vitro. 113
Получение вектора для генетической пассивной иммунизации 114
Оценка эффективности подхода генетической пассивной иммунизации для
защиты от урогенитальной инфекции мышей, вызванной M. hominis 120
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 126
Выводы 142
Список литературы 143
- Использование однодоменных антител для терапии бактериальных инфекций
- Патогенный потенциал Mycoplasma hominis
- Ферменты для молекулярно-биологических процедур
- Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4 и получение библиотеки клонов-трансформантов
Использование однодоменных антител для терапии бактериальных инфекций
Технология получения VHH фрагментов заданной специфичности является воспроизводимой процедурой, не требующей дорогостоящего оборудования, а весь процесс может быть реализован в течение нескольких месяцев [Kastelic и др., 2009; Pardon и др., 2014]. Отчасти именно поэтому прогресс в области получения и использования VHH развивается весьма быстрыми темпами.
Технология получения VHH в общем виде состоит из нескольких ключевых этапов, каждый из которых может быть реализован с помощью как общепринятых методик и подходов, так и с использованием оригинальных решений в зависимости от целей, задач и объектов исследования.
Первый этап в получении VHH фрагментов заданной специфичности – это иммунизация животного. Неканонические антитела образуются в организме всех животных семейства Cameliedae. Относительная доля таких антител варьирует в переделах нескольких десятков процентов. Выбор определенного вида животного (лама, альпака, одногорбый или двугорбый верблюд) зависит в большей степени от возможностей содержания животных. К сожалению, в России получением и исследованием VHH пока занимаются единичные группы ученых, а животные из семейства Верблюдовых содержатся, как правило, в зоопарках или у частных заводчиков.
Как и в большинстве иммунологических исследований, на этапе иммунизации решающую роль играет характер антигена, выбор адъюванта, способ его введения и схема иммунизации. Как правило, в большинстве работ эффективно применяют последовательную иммунизацию очищенными белковыми антигенами с добавлением хорошо известных в ветеринарии классических адъювантов, таких как адъювант Фройнда или соединения алюминия [Spickler, Roth, 2003]. Максимальный титр антител класса G наблюдается в таких случаях примерно на 6 10 неделе после иммунизации [Ferrari и др., 2012]. Тем не менее, в случаях, когда невозможно или нецелесообразно получение очищенного белкового препарата в достаточном количестве или целью исследования является получение VHH к неизвестному антигену, присутствующему в том или ином материале, используют в качестве иммуногена многокомпонентные препараты (смесь белков, целые бактерии и вирусы, лизаты клеток или даже целые клетки) [Garaicoechea и др., 2008] [Maussang, Muji-Deli, Descamps, 2013]. Смешанные антигены позиционируются в случае инфекционных заболеваний как «инфектомы» (видимо, присутствует аналогия с термином «веном», использующимся применительно к ядам) [Toms и др., 2011]. Получение «инфектом-специфичных» VHH было успешно реализовано для ряда мишеней [Saerens и др., 2008] . Также для иммунизации используются различные генетические векторы, обеспечивающие продукцию целевого иммуногена in vivo [Koch-Nolte и др., 2007] . В этом случае однократное введение обеспечивает длительное присутствие иммуногена в организме и обеспечивает формирование специфического иммунного ответа.
Второй этап заключается в получении библиотеки генов, кодирующих последовательности VHH фрагментов антител. Для этого у иммунизированного животного забирают кровь и выделяют из нее мононуклеарные клетки, в том числе лимфоциты. Необходимо отметить, что в ряде работ исследователи не ограничивались периферической кровью, а отбирали селезенки или лимфоузлы [Maass и др., 2007] . Этот подход, хоть и успешен, но гораздо менее гуманен. В целом, существенным требованием на этом этапе, помимо общих требований к лабораторной практике и качеству образцов, является работа с достаточным количеством исходного материала, поскольку важно соблюсти множественность разнообразия специфических для VHH мРНК. Полученный материал используют для выделения РНК и получения кДНК, на матрице которой осуществляют амплификацию VHH-кодирующих последовательностей. Поскольку нуклеотидные последовательности канонических и неканонических антител обладают высокой степенью гомологии, то важной задачей является дифференциация VHH и VH последовательностей. Для этого различными авторами было разработано несколько стратегий ПЦР [Pardon и др., 2014] . Отсутствие CH1 региона у неканонических антител позволяет отличить соответствующие ампликоны по размеру, а затем, изолировав необходимый пул продуктов ПЦР, провести второй раунд амплификации. Помимо гнездовой ПЦР, также описаны праймеры, позволяющие напрямую амплифицировать последовательности, соответствующие только VHH [Pardon и др., 2014] . Амплифицированные последовательности, кодирующие VHH, затем клонируют в фагмидный вектор.
Фагмидные векторы, в которые клонируют последовательности VHH, разнообразны [Qi и др., 2012]. Практически всегда используются фагмиды на основе рIII белка М13 бактериофага. Основной принцип фагмид заключается в том, что инсерцию VHH проводят в рамку считывания pIII белка бактериофага М13. Поскольку фагмиды содержат два ориджина репликации, то они могут реплицироваться как в форме двуцепочечной плазмидной ДНК, так и в виде одноцепочечной ДНК, способной упаковываться в капсид бактериофага M13. В бактериальной клетке, содержащей фагмиду с инсерцией VHH, происходит синтез белка pIII, слитого с последовательностью VHH. В тоже время в этой клетке присутствует одноцепочечная форма этой фагмиды. В случае если в этой клетке появится источник всех остальных структурных белков бактериофага, произойдет сборка вирионов, причем в головку бактериофага будет упакован химерный белок, состоящий из pIII и VHH, а в капсид будет упакована одноцепочечная ДНК, содержащая последовательность, кодирующую этот химерный белок. На этом дуализме фагмид основан принцип фагового дисплея как подхода для изоляции специфических белок-кодирующих последовательностей [Hammers, Stanley, 2014].
Как правило, помимо общих элементов, таких как ген селективного маркера антибиотикоустойчивости, фагмиды часто содержат различные тэги в рамке считывания VHH-pIII для удобства детекции экспрессии белка, а также дальнейшей очистки и использования VHH. В большинстве случаев это следующие тэги или их комбинации: Hisag, HAag, c-Mycag, Strepag, FLAGag и Eag [Qi и др., 2012]. Также, в некоторых фагмидах предусмотрен участок кодирующий сайт трипсинолиза, располагающийся между последовательностями VHH и pIII [Baek и др., 2002]. С использованием таких конструкций становится возможным элюция связавшихся с антигеном фаговых частиц с помощью обработки трипсином. К тому же отщепление VHH от головки фага снижает риск влияния VHH на его инфекционность. Таким образом, существует большое многообразие фагмидных векторов, которые позволяют исследователям выбрать оптимальное решение для их экспериментальных задач.
Ключевым завершающим звеном этого этапа является трансформация полученной библиотеки VHH в фагмидном векторе в соответствующий штамм E.coli и получение библиотеки индивидуальных клонов-трансформантов. До сих пор речь шла о получении библиотеки с использованием иммунизированного животного. То есть В-лимфоциты, продуцирующие антитела, проходили клональную селекцию in vivo. Современные технологии позволяют получать синтетические библиотеки антител и их фрагментов такой комплексности, чтобы из них также можно было отобрать специфические VHH, в том числе на такие антигены, иммунизация которым затруднительна или невозможна [Frigotto и др., 2015; Yan и др., 2014]. Однако работа с такими библиотеками на начальных этапах трудоемка, а также всегда существует вероятность отбора последовательностей, которые могут быть стабильны только в составе слитого белка VHH-pIII, тогда как собственно VHH не будут обладать необходимыми свойствами. Более того, наши исследования разнообразия последовательностей VHH с использованием высокопроизводительного секвенирования, показали, что широкая вариабельность аминокислотных остатков характерна не только для CDR петель, но затрагивает и константные области, что не учитывается при конструировании синтетических библиотек. Тем не менее, подобные синтетические библиотеки представляют собой в некоторой степени универсальный источник VHH [Finlay, Almagro, 2012; Ponsel и др., 2011; Sidhu, Fellouse, 2006] .
Патогенный потенциал Mycoplasma hominis
Первичную структуру ДНК определяли по принципу Сэнгера на генетическом анализаторе «3130 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, США). Данная работа выполнялась сотрудниками лаборатории Анализа геномов ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ под руководством Ворониной О.Л.
Получение однодоменных антител. Выделение липид-ассоциированных мембранных белков (LAMPs) M. hominis. Культуру M. hominis осаждали центрифугированием при 10000g, 20 минут. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в первоначальном объеме DPBS, повторяли осаждение. Бактерии ресуспендировали в 1/10 объема буфера TEX114 (50 mM Tris HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0, 2% Triton X-114), инкубировали в ледяной бане при перемешивании 3 часа. Затем центрифугированием при 5000g, 5 мин, 4 С осаждали клеточный дебрис. Супернатант отбирали в отдельную пробирку и нагревали при 37 С до образования мицелл. Центрифугированием при 5000g, 5 мин, 30С разделяли мицеллы и водную фазу. Отбирали мицеллы и доводили объем смеси буфером ТЕ (50 mM Tris HCl; 150 mM NaCl). Растворяли мицеллы при перемешивании на 4 С. Повторяли разделение мицелл еще 2 раза. Полученные мицеллы содержали фракцию липид-ассоциированных мембранных белков M. hominis (LAMPs), которую хранили при -20 С. Для дальнейшего использования LAMPs переосаждали путем добавления эквивалентного объема метанола и центрифугировали 10000g, 20 мин, 3 раза промывали осадок белков в этаноле, повторяли центрифугирование, затем растворяли полученные белки в DPBS.
Иммунизация, отбор крови и выделение лимфоцитов.
Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фройнда. В качестве антигена использовали 100 мкг LAMPs M. hominis. Вторую иммунизацию проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще три иммунизации. Взятие крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 150 мл DPBS, гепарин (100 ед./мл) и ЭДТА (3 мМ). По 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку Histopaque-1077 с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором DPBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. Полученные лимфоциты использовали немедленно для выделения РНК. Выделение РНК из лимфоцитов и синтез кДНК.
Тотальную РНК из лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США) по протоколу фирмы-производителя. Концентрацию РНК определяли с помощью наноспектрофотометра Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, США) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Синтез кДНК проводили на матрице полученной тотальной РНК в количестве 20 мкг с использованием набора SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, США) по протоколу фирмы-производителя с использованием, входящих в набор oligo-dT праймеров. Полученную кДНК использовали для амплификации последовательностей VHH.
ПЦР-амплификация последовательностей VHH.
Последовательности VHH амплифицировали методом гнездовой ПЦР (nested-PCR) с использованием готовой смеси высокоточной полимеразы с горячим стартом Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB). Параметры ПЦР реакций (ПЦР I и II) были установлены в соответствии с протоколом фирмы-производителя фермента. Температура отжига праймеров во всех раундах амплификации была определена экспериментально и составляла 58 С, количество циклов - 30.
Специфичность гнездовой амплификации определялась дизайном праймеров. Для первого цикла амплификации использовались праймеры Call001 и Call002, количество кДНК составляло 3 мкг на реакцию. Продукты ПЦР I представляли собой два пула ампликонов, соответствующие VH-СH1-CH2 (900 п.о.) фрагментам канонических антител и VHH-CH2 (600 п.о.) фрагментам неканонических антител. Продукты ПЦР I разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, ампликоны соответствующие VHH-CH2 (600 п.о.) фрагментам неканонических антител элюировали из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США) по протоколу фирмы-производителя. Элюированные ампликоны использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации – ПЦР II.
Для второго цикла амплификации использовались праймеры NcoI-VHH и VHH-NotI, количество ДНК-матрицы составляло 20 нг на реакцию. Использованные праймеры содержат в своей последовательности сайты гидролиза эндонуклеазами рестрикции NcoI и NotI соответственно, которые необходимы для клонирования VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4. Продукты ПЦР II разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, ампликоны соответствующие VHH (420 п.о.) фрагментам неканонических антител элюировали из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) по протоколу фирмы-производителя.
Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4 и получение библиотеки клонов-трансформантов.
Клонирование ампликонов, полученных в результате ПЦРII и соответствующих VHH фрагментам неканонических антител, в фагмидный вектор pHEN4 проводили по сайтам гидролиза специфическими эндонуклеазами рестрикции NotI и NcoI согласно общепринятой схеме молекулярного клонирования фрагментов ДНК. Лигазную смесь очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и использовали для серии электропорации электрокомпетентных клеток E. coli TG1 (проводят 15-20 реакций электропораций), которые затем высевали по 3 мл на квадратные (25х25 см) агаризованные чашки со средой 2xTY, 2% глюкозой и селективным антибиотиком. Аликвоту клеток использовали для приготовления серии 10-кратных разведений, которые высевали на стандартные чашки Петри (диаметром 9 см) с той же средой. Чашки инкубировали ночь в термостате при 37 С. На следующий день проводили подсчет колоний на стандартных чашках Петри и пересчитывали, с учетом разведений, на общее количество полученных клонов-трансформантов. Колонии с больших чашек соскребали шпателем, ресуспендировали в DPBS с 20% глицерином, аликвоты хранили при -70 С. Полученные клоны-трансформанты представляют собой исходную библиотеку с комплексностью, соответствующей числу полученных колоний. 50 случайно выбранных клонов использовали для ПЦР реакции для подтверждения наличия в них целевой фагмидной ДНК со вставкой VHH. Для этого стерильной зубочисткой переносили колонию в 20 мкл лизирующего буфера «colony PCR LB», нагревали в течение 15 минут при 98С, затем добавляли 80 мкл воды, центрифугировали при 10000g 10 минут, 1 мкл супернатанта использовали в качестве матрицы для 25 циклов ПЦР с праймерами LacZ-for и Fr4-rev, результаты ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле.
Ферменты для молекулярно-биологических процедур
Из представленных данных видно, что aMh06 взаимодействует со специфическим антигеном (Mw 40кДа), причем этот антиген присутствует во фракции ЛАМБ, а также детектируется в тотальном лизате клеток микоплазмы, что подтверждает его локализацию в составе мембранных белковых комплексов M. hominis.
Для повышения авидности aMh06 было принято решение методами молекулярного клонирования ввести в последовательность aMh06 изолейциновый зиппер (молнию) – мотив, вызывающий олигомеризацию молекул (в данном случае ди- и тримеризацию). Для соединения с зиппером был введен «жесткий» молекулярный спейсер, а также добавлена последовательность НАag для последующей детекции продукта трансляции. В наших предшествующих работах было показано, что такой подход может быть успешно применен к данному типу фрагментов антител [Tillib и др., 2013; Tutykhina и др., 2013] . Однако, также было показано, что присоединение изолейцинового зиппера снижает уровень продукции рекомбинантных белков. Для увеличения эффективности продукции белкового продукта, нуклеотидная последовательность была оптимизирована, путем замены кодонов соответствующих редким тРНК на кодоны, соответствующие более представленным тРНК в клетках E. coli. Оптимизация не привела к изменениям в полипептидной последовательности белка (рисунок 19).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая aMh06 c изолейциновым зиппером (aMh06-ILZ-НА) была синтезирована в ЗАО Евроген и получена в составе плазмиды pALA, в которой aMh06-ILZ-НА была фланкирована участками полилинкера, содержащего различные сайты гидролиза эндонуклеазами рестрикции для удобства дальнейших процедур молекулярного клонирования в различные векторные системы.
Создание продуцентов препаратов на основе aMh06 с изолейциновым зиппером (aMh06-ILZ-НА).
Для различных VHH фрагментов и их производных показана высокая биотехнологическая гибкость и возможность их получения в различных продуцентах от бактерий до высших растений. Однако для продуктов на основе aMh06-ILZ-НА (рисунок 20) могут возникать некоторые сложности. Во-первых, aMh06-ILZ-НА в высоких дозах могут быть токсичны для продуцентов. Во-вторых, они могут нарабатываться в нерастворимой форме. В-третьих, различные продуценты обладают отличающимся потенциалом в ключе получения очищенных препаратов на основе aMh06-ILZ-НА. Для исследования аспектов биотехнологического получения очищенных препаратов на основе aMh06-ILZ-НА были поставлены следующие задачи:
Методами генетической инженерии и молекулярного клонирования был получен ряд рекомбинантных плазмид, несущих в своем составе различные экспрессионные кассеты на основе aMh06-ILZ-НА (таблица 4). Рисунок 20. Предполагаемый дизайн тримеризованных белковых молекул на основе aMh06-ILZ-НА.
Идентичность полученных конструкций была подтверждена секвенированием с использованием праймеров, фланкирующих белок-кодирующие последовательности. Все конструкции являются индуцибельными, то есть для продукции рекомбинантного белка требуется добавление в питательную среду дополнительных метаболитов. Полученные конструкции были трансформированы в клетки соответствующих продуцентов. Индукция экспрессии проводилась согласно общепринятым протоколам. Анализ экспрессии целевого белка подтверждался методом вестерн-блот гибридизации со специфическими антителами. Полученные данные суммированы в таблице 4 и отображены на рисунке 21.
Экспрессия aMh-ILZ-HA-His в B. megaterium, S. сerevisiae, E. coli. А Вестерн-блот гибридизация лизатов S. сerevisiae (1-4) и B. megaterium (5-6) с анти-His антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. 1 и 2 – лизаты двух клонов S. сerevisiae, культивируемых на среде с декстрозой (т.е. пробы без индукции экспрессии), 3 и 4 – эти же клоны, культивируемые на среде с галактозой (индукция экспрессии); 5 – лизат фракции растворимых белков B. megaterium, 6 – лизат фракции нерастворимых белков B. megaterium. Белковые фракции были получены из эквивалентного количества биомассы продуцентов. Б -Вестерн-блот гибридизация образцов белковых лизатов E. coli с анти-HA антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. 1, 2, 3 – фракции растворимых и нерастворимых белков соответственно, выделенные из 3 независимых клонов экспрессионной системы E. coli M15 (вектор pQE6). В - Вестерн-блот гибридизация образцов белков E. coli с анти-His антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена фракции растворимых и нерастворимых белков, выделенные из клеток E. coli Rosetta (вектор pET28c). 1 – положительный контроль (проба тотального лизата), 2, 3 – образцы телец включения двух независимых клонов, 4,5 – образцы фракций растворимых белков двух независимых клонов.
Из представленных данных видно, что белковые продукты aMh-ILZ-НА экспрессируются во всех использованных продуцентах. Однако в клетках E. coli штаммов M15 и Rosetta большая часть продукта находится в тельцах включения (в нерастворимой фракции белков). Тем не менее, в других системах экспрессии на основе B. megaterium и S. сerevisiae возможно получение aMh-ILZ-HA в растворимой форме.
Для очистки aMh-ILZ из клеток E. coli Rosetta (вектор pET28c) был использован тотальный лизат бактерий, приготовленный с использованием 8М мочевины, то есть лизат включал в себя как растворимые, так и нерастворимые белки. Очистку проводили с использованием Со2+ аффинного сорбента в денатурирующих условиях (электрофореграмма различных фракций очистки представлена на рисунке 22).
Рисунок 22. Электрофореграмма белковых фракций, полученных в результате очистки aMh-ILZ-НА из клеток E. coli Rosetta (вектор pET28c) в денатурирующих условиях. М – маркер молекулярного веса белков, 1 – исходный лизат, 2-5 серия последовательных промывок, 6 –элюат с сорбента.
Из представленных данных видно, что белковые продукты aMh-ILZ-HA-His были эффективно очищены из тотального лизата E. coli с использованием металл-аффинных сорбентов в денатурирующих условиях (с 8М мочевиной). Степень чистоты полученного препарата достаточно высокая, так как при на электрофорезе в акриламидном геле не детектируется посторонних белковых примесей.
Для продукции ряда мало растворимых белков в клетках E. coli успешно используется модификация белковых последовательностей, путем присоединения к ним мальтоза-связывающего белка. Для проверки применимости этого подхода к продукции и очистке aMh-ILZ-HA в растворимой форме в клетках E. coli был использован экспрессионный вектор pMAL-c5x c инсерцией соответствующей последовательности в рамку считывания экспрессионной кассеты, содержащей мальтоза-связывающий белок MBP. Белок MBP-aMh06-ILZ-HA был очищен из растворимой фракции E. coli на сорбенте из амилозы. После очистки полученные образцы методом диафильтрации были переведены в фосфатно-солевой буферный раствор. Мальтоза-связывающий белок был удален путем протеолиза с использованием фактора Ха, сайт расщепления которого содержится в векторной части плазмиды pMAL-c5x сразу после последовательности MBP. Электрофореграмма полученного препарата представлена на рисунке 23.
Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4 и получение библиотеки клонов-трансформантов
Современные технологии селекции и продукции моноклональных антител позволяют получать иммуноглобулины и их производные самых различных форматов, отличающихся по своим свойствам и биотехнологическому потенциалу. Канонические иммуноглобулины, получаемые с использованием гибридомной технологии, обладают рядом недостатков, главным из которых является их комплексная природа, заключающаяся в комбинации тяжелых и легких цепей для формирования функционально активной молекулы. Этот недостаток значительно усложняет процесс их селекции и обуславливает высокую стоимость конечного продукта, а также ограниченность их модификаций для создания препаратов с комплексными функциональными свойствами. Поэтому сейчас происходит стремительный рост интереса к альтернативным форматам антител и их фрагментов, лишенных ряда недостатков [Деев С.М. и др. 2008; Альтшулер Е.П. и др. 2010]. Одним из наиболее перспективных направлений является получение и использование антиген-распознающих фрагментов неканонических антител представителей семейства верблюдовых (VHH или nanobody). VHH представляют собой фрагмент неканонических антител, состоящих только из тяжелых цепей иммуноглобулинов. Полипептидная цепь этих фрагментов кодируется одним геном, что делает их очень привлекательными молекулами с точки зрения биотехнологического потенциала и возможности различных генно-инженерных манипуляций. Антигенсвязывающий домен формируется из 3 гипервариабельных петель – CDR1, 2 и 3. Причем характерной особенностью VHH является удлиненная CDR3 петля, которая конформационно образует гибкий «палец», способный входить в функционально-активные сайты антигенов, а также связывать необычные и скрытые эпитопы различных молекул. Это свойство VHH позволяет с большей вероятностью отбирать антитела с нейтрализующими и блокирующими свойствами.
Роль Mycoplasma hominis как патогенной бактерии долгое время оставалась без должного внимания. До сих пор, несмотря на научные данные, диагностика, профилактика и лечение микоплазменных инфекций в клинической практике находится на недостаточном уровне чувствительности, воспроизводимости и эффективности. Во многом такой медленный прогресс в этой области связан с уникальной природой микоплазм, вызывающей сложности в их изучении из-за недоступности многих молекулярно-биологических подходов, в том числе использующих в своей основе антитела. Например, для научных исследований доступны для приобретения в коммерческих фирмах специфические антитела всего лишь к одному белку M. hominis – поверхностному антигену р120, причем их характеристики для использования в реакциях ИФА и вестерн-блот гибридизации оказываются ниже среднего уровня качества антител, применяемых в лабораторной практике (по аннотации производителей их рабочая концентрация в реакциях ИФА составляет 0,5 мкг/мл). Получение моноклональных антител специфичных к различным антигенам M. hominis является актуальной задачей, такие антитела могут быть использованы в качестве инструмента в фундаментальных исследованиях, основы для разработки диагностикумов и для терапевтического использования.
Целью данной работы было создание однодоменных антител, специфически связывающихся с M. hominis, и изучение потенциала их применения для диагностики, профилактики и терапии урогенитальной инфекции, вызванной M. hominis.
На этапе получения и селекции специфических к M. hominis VHH принципиальное значение имел выбор антигенного материала для иммунизации животных. Микоплазмы лишены клеточной стенки, поэтому их контакт с окружающей средой и эукариотическими клетками, а также все активные системы транспорта веществ и поддержания осмотического баланса осуществляется комплексами липопротеинов, интегрированных в мембрану микоплазменной клетки. Возможно, что именно этой структурной особенностью объясняется тот факт, что массовая доля белков в наружной оболочке некоторых микоплазм достигает 1/3, а мембранные белки составляют около половины всех белков микоплазм [Liu и др., 2012] [Cacciotto и др., 2010] . Помимо этого, значительная часть липопротеинов микоплазм ацетилируется и представляет собой патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, являющиеся лигандами для рецептора врожденного иммунитета TLR2 [Reutter и др., 2005] . Поскольку в последнее время все большее внимание уделяется новым поколениям адъювантов на основе лигандов рецепторов врожденного иммунитета, то это свойство ЛАМБ позволяет рассматривать их в качестве молекулярных адъювантов, усиливающих ответ при иммунизации [Basto, Leito, 2014; Weigt и др., 2003] . Можно предположить, что ЛАМБ при введении в организм вызывают иммунный ответ, обусловленный как белковой природой вводимых антигенов, так и стимуляцией врожденного иммунитета ацетилированными липопептидами. Дополнительное использование адъювантов Фройнда обеспечивает депонирование гидрофобных по своей природе антигенов. Таким образом, выбор фракции липид-ассоциированных мембранных белков для иммунизации верблюдов представляется нам оптимальным решением для получения специфических VHH к поверхностным антигенам M. hominis.
После иммунизации, выделения лимфоцитов и клонирования библиотеки ДНК VHH-кодирующих последовательностей, дальнейшая стратегия получения и селекции VHH использует технологию фагового дисплея на основе нитчатого бактериофага M13. Этот подход получил широкое распространение для селекции, в том числе, различных фрагментов антител. Ряд существенных модификаций данной технологии, включает в себя: