Содержание к диссертации
Введение
1 Взаимоотношения растений яблонь и микроорганизмов (обзор литературы) 11
1.1 Поверхность и внутренняя среда надземных частей растений как среда обитания микроорганизмов 11
1.1.1 Особенности условий обитания микроорганизмов на поверхности надземных частей растений 11
1.1.2 Особенности условий обитания микроорганизмов во внутренней среде растений 1.2 Микробные ассоциации побегов яблонь 16
1.3 Фитопатогенные бактерии и грибы, поражающие надземные части яблонь
1.3.1 Фитопатогенные бактерии 18
1.3.2 Фитопатогенные грибы 21
1.4 Использование бактериального антагонизма для защиты растений от фитопатогенов 27
1.5 Вторичные метаболиты бактерий и грибов и их роль в системе растение-микроорганизмы 31
2 Материал и методы 35
2.1 Характеристика района исследований 35
2.2 Материал исследований 37
2.3 Методы исследований
2.3.1 Анатомические исследования поражённых побегов яблонь 40
2.3.2 Микробиологические исследования побегов яблонь 40
2.3.3 Микробиологические исследования насекомых, трофически связанных с поражёнными побегами 42
2.3.4 Идентификация выделенных штаммов бактерий и грибов 42
2.3.4.1 Фенотипическая идентификация 42
2.3.4.2 Молекулярно-генетическая идентификация
2.3.5 Изучение антагонистической активности 46
2.3.6 Выявление факторов патогенности бактерий-антагонистов 47
2.3.7 Выделение и идентификация вторичных метаболитов бактерий и грибов 48
2.3.8 Методы статистической обработки результатов исследований 51
3 Сравнительная характеристика микробных ассоциаций здоровых И поражённых побеговяблонь 53
3.1 Характер повреждений исследованных побегов яблонь 53
3.2 Особенности микробных ассоциаций здоровых и поражённых побегов яблонь
3.2.1 Микробные ассоциации здоровых и поражённых побегов яблонь разных сортов 56
3.2.2 Микробные ассоциации здоровых и поражённых побегов яблонь, произрастающих в разных районах Саратовской области
4 Динамика качественных и количественных характеристик микробных ассоциаций поражённых побегов в течение года и в разные вегетационные сезоны 90
5 Биологические свойства микроорганизмов, ассоциированных с поражёнными побегами яблонь 103
5.1 комплекс грибов, ассоциированных с поражёнными побегами яблонь 103
5.1.1 Краткая характеристика выделенных видов грибов 103
5.1.2 Основные вторичные метаболиты грибов, доминирующих в выявленном микокомплексе 110
5.1.3 Способность выделенных видов грибов сохраняться в организмах насекомых, трофически связанных с побегами яблонь 120
5.2 Комплекс бактерий, ассоциированных с поражёнными побегами яблонь 124
5.2.1 Краткая характеристика выделенных видов бактерий 124
5.2.2 Пищевые потребности бактерий-ассоциантов и их устойчивость к физико-химическим факторам среды 129
5.2.3 Антагонистическая активность бактерий по отношению к выявленному комплексу грибов 133
5.2.4 Основные продукты метаболизма бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов 139 Заключение 143
Выводы 146
Список использованных источников 1
- Особенности условий обитания микроорганизмов на поверхности надземных частей растений
- Анатомические исследования поражённых побегов яблонь
- Особенности микробных ассоциаций здоровых и поражённых побегов яблонь
- Основные вторичные метаболиты грибов, доминирующих в выявленном микокомплексе
Введение к работе
Актуальность темы. Растения являются средой обитания для огромного количества микроорганизмов, выполняющих множество значимых для хозяина функций. Многие микроорганизмы филлосферы участвуют в синтезе биологически активных веществ, влияющих на рост растений-хозяев, обеспечивают колонизационную резистентность к фитопатогенам (Заикина, 2007; 2008; Martini, 2009; Gabriele et al., 2014). Грибные эндофиты могут отпугивать травоядных животных, защищать от возбудителей инфекций, увеличивать засухоустойчивость, усиливать биоремедиационный потенциал растений (Arnold et al., 2003; Schweitzer et al., 2006; Russell, 2011).
Вместе с тем, развитие на поверхности или во внутренних тканях растений фитопатогенных микроорганизмов может привести не только к снижению продуктивности, но и к полной гибели растения-хозяина. Противодействие фитопатогену могут оказать как защитные механизмы самого растения, так и компоненты его нормальной микрофлоры, участвующие в обеспечении колонизационной резистентности. Таким образом, любая инфекционная патология растения – это результат конкурентной борьбы между патогеном и компонентами нормальной микрофлоры, а также результат противостояния защитных механизмов макроорганизма и факторов патогенности возбудителя (Заикина, 2007; 2008).
Яблоня – наиболее возделываемая древесная культура, которая
выращивается почти во всей области умеренного климата в Северном и
Южном полушариях. Во всех климатических зонах существенный ущерб
садоводству наносят фитопатогенные микроорганизмы, вызывающие
повреждения как самих деревьев, так и плодов (Victor et al., 2014). Одним из
факторов, снижающих продуктивность и долговечность яблони, является
паразитирование на скелетных органах растений комплекса грибов,
приводящее в конечном итоге к усыханию побегов и дальнейшей гибели
растения (Bayman, 2011). Сведения о развитии миконекрозов на побегах
яблонь, их распространенности весьма ограничены. Имеющиеся
литературные данные свидетельствуют о том, что в разных регионах схожие повреждения скелетных частей яблонь могут вызывать разные комплексы фитопатогенных грибов (Романченко, 1993; Verma et al., 2006; France et al., 2009; Evidente et al., 2012; Ismail et al., 2013; Якуба, 2014).
В Саратовской области в последние годы и профессиональные агрономы, и садоводы-любители отмечают массовую гибель яблонь вследствие усыхания побегов, сопровождающегося растрескиванием и почернением коры, однако микробиологических исследований пораженных растений не проводилось.
В связи с этим, целью данной работы явилось выявление микробных ассоциаций скелетных частей яблонь при их микозном усыхании на территории Саратовской области.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Сравнить микробные ассоциации поверхности и внутренних тканей здоровых и поражённых побегов яблонь.
-
Выявить динамику качественных и количественных характеристик микробоценозов поражённых побегов яблонь в течение года и в разные вегетационные сезоны.
-
Выделить и идентифицировать основные продукты метаболизма грибов, доминирующих в выявленном микокомплексе.
-
Установить роль насекомых, трофически связанных с побегами яблонь, в сохранении и распространении выделенных фитопатогенных грибов.
-
Изучить биологические свойства бактерий, доминирующих на поражённых побегах, и выделить штаммы, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам.
-
Выделить и идентифицировать основные продукты метаболизма наиболее перспективных штаммов бактерий-антагонистов.
Научная новизна. Впервые установлена структура микробоценозов
скелетных частей яблонь при их микозном усыхании на территории
Саратовской области. Впервые проведён сравнительный анализ микробных
ассоциаций здоровых и поражённых побегов яблонь, произрастающих в
схожих природно-климатических условиях. Впервые показано, что гриб
Alternaria alternatа доминирует в микокомплексах поражённых скелетных
частей яблонь. Впервые выявлен комплекс бактерий, обладающих
антагонистической активностью в отношении грибов, доминирующих на
скелетных частях яблонь в Саратовской области при их микозных
усыханиях. Впервые выявлены вторичные метаболиты штаммов грибов
A. alternatа, Fusarium equiseti, F. tricinctum, Aspergillus tubingensis,
Trichoderma harzianum, ассоциированных с побегами яблонь. Среди
продуктов метаболизма Phoma fungicola впервые выделен и
идентифицирован микотоксин спициферон А. Впервые показана способность фитопатогенных грибов A. alternatа и F. equiseti сохраняться в организмах яблонных тлей (Aphis pomi De Geer, 1773).
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты
существенно расширяют представления о микробных ассоциациях скелетных
частей яблонь в норме и при патологиях, механизмах их формирования.
Установление видового состава микокомплекса, доминирующего на
скелетных частях яблонь при их усыхании, позволит специалистам в области
защиты растений предпринимать более эффективные меры борьбы с
данными патологиями. Выделены штаммы бактерий, хорошо
адаптированные к обитанию на побегах яблонь и обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к выявленным видам фитопатогенных грибов. В дальнейшем эти штаммы могут послужить основой для создания фунгицидных биопрепаратов.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и физиологии растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего образования «Саратовский государственный национальный исследовательский университет имени Н.Г. Чернышевского» и в Институте фармацевтической биологии и биотехнологии г. Дюссельдорф, Германия.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 1st
International Conference of Global Summit on Herbals and Natural Remedies.
(Chicago, USA., 2015); 2nd International Conference on New Horizons in Basic
and Applied Science ICNHBAS (Hurghada, Egypt 2015); VIII Всероссийском с
международным участием конгрессе молодых учёных-биологов: Симбиоз –
Россия 2015 (Новосибирск, 2015); Всероссийской конференции с
международным участием «Мониторинг и биологические методы контроля
вредителей и патогенов древесных растений: от теории к практике» (Москва,
2016); 69-ой Всероссийской школе-конференции молодых ученых.
«Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород,
2016); Региональной конференции «Исследования молодых ученых в
биологии и экологии» (Саратов, 2016); VIII Всероссийской конференции
молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с
окружающей средой» (Саратов, 2016); Международной научно-практической
конференции «Материалы и методы инновационных исследований и
разработок» (Пенза, 2016); Международной научно-практической
конференции «Результаты современных научных исследований и
разработок» (Пенза, 2017); 6th International Conference on Clinical Microbiology and Microbial Genomics. (Italy, 2016).
Публикации. По данной теме опубликовано 17 работ, в том числе 5 работ в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах, содержит 50 таблиц, 37 рисунков. Состоит из введения, 5 глав, выводов, заключения, списка литературы, включающего 332 источника, в том числе 299 иностранных.
Личный вклад автора. Автор лично провёл полевые и лабораторные исследования. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление проведены автором самостоятельно. Доля участия автора в совместных публикациях составляет 75-80 %.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При микозных поражениях скелетных частей яблонь в Саратовской области выделяется комплекс фитопатогенных грибов, в котором доминирует A alternatа.
-
В бактериальной составляющей микробной ассоциации поражённых скелетных частей яблонь увеличиваются количественные показатели видов, представители которых обладают антагонистической активностью по отношению к доминирующим фитопатогенным грибам.
-
Бактериальные и грибные компоненты микробной ассоциации поражённых побегов выделяют комплекс вторичных метаболитов с антибактериальной, фунгицидной и фитотоксической активностями.
Особенности условий обитания микроорганизмов на поверхности надземных частей растений
По ксилеме переносится в основном вода и минеральные соли, и поэтому основной класс соединений, содержащихся в соке ксилемы – это группа неорганических ионов, среди которых преобладают калий и нитрат (Schurr, Schulze, 1995).
Сахара (сахароза и др.) в ксилемном соке присутствуют в очень низких концентрациях, и их трудно обнаружить (Schurr, Schulze, 1995). Концентрация аминокислот также в несколько раз меньше, чем во флоэме. Например, у табачного дерева (Nicotiana glauca) концентрация аминокислот во флоэмном соке составляет 83 мМ, тогда как в ксилемном соке – только 2,2 мм (Buchanan et al., 2000). В ксилемном соке яблонь и персиков были обнаружены различные белки в очень низкой концентрации (Biles, Avbeles, 1991). Концентрация белка в ксилемном соке различных видов варьирует в диапазоне 0,05-0,1 мг/мл (Buhtz et al., 2004). Большинство идентифицированных белков могут участвовать в регенеративных и защитных реакциях. Некоторые из наиболее распространенных белков ксилемного сока, таких как хитиназы, пероксидазы и сериновые протеазы, являются общими компонентами сока у разных видов растений (Biles, Avbeles, 1991; Buhtz et al., 2004). Защитные белки могут эффективно и быстро транспортироваться с ксилемным соком к месту своего назначения. Эти белки, скорее всего, синтезируются в клетках паренхимы ксилемы в корнях. Из корневых клеток они могут активно выделяться в ксилемный сок (Biles, Avbeles, 1991).
Уровень рН ксилемного сока соответствует кислой среде и колеблется в диапазоне 5,5-6,5 (Schurr, Schulze, 1995). У различных древесных пород отмечается подкисление ксилемного сока в начале весны (Essiamah, 1980). Флоэмный сок содержит широкий спектр метаболитов (Lohaus et al., 2000; Lohaus, Moellers, 2000; Arlt et al., 2001; Fiehn, 2003), которые могут транспортироваться на большие расстояния или могут иметь значение для поддержания функциональности флоэмы. Флоэмный сок представляет собой сложную смесь органических и неорганических веществ (Komor et al.,1996). Сахара и аминокислоты являются преобладающими метаболитами флоэмного сока (Dinant et al., 2010). Основным углеводом в соке флоэмы является сахароза. Концентрация этого дисахарида находится в диапазоне от 200 до 1400 мМ (Lohaus et al., 1995; Marschner, 1995; Lohaus, Moellers, 2000) и зависит от вида растений. Другие сахара, такие как гексозы (например, глюкоза и фруктоза), раффинозы-олигосахариды, полиолы (маннит и сорбит) также найдены в соке флоэмы. Аминокислоты являются основной формой восстановленного азота во флоэмном соке, и их концентрация варьирует у разных видов (Dinant et al., 2010). У большинства изученных видов растений основными аминокислотами во флоэмном соке являются глутамин, глутамат, аспарагин и аспартат (Lohaus et al., 1998; Lohaus, Moellers, 2000; Fiehn, 2003). L-аргинин, основная аминокислота с высокой степенью соотношения N/C (четыре атома азота и шесть атомов углерода на молекулу), служит в качестве важного резерва азота у яблонь (Guak et al., 2003; Canton et al., 2005). Кроме того, L-аргинин обладает уникальной физиологической ролью по сравнению с другими аминокислотами, участвует в различных физиологических процессах. Известно, например, что как экзогенный, так и эндогенный аргинин может быть вовлечен в реакцию растений на стресс (Chen et al., 2004).
Важной составляющей флоэмного сока являются белки. Состав белков и их концентрация во флоэме значительно различаются у разных видов, но у большинства изученных растений варьирует в диапазоне 0,1-2 мг/мл (Ziegler, 1975; Fisher et al., 1992). Это могут быть как структурные, так и растворимые белки. У разных видов растений во флоэме обнаружено более 200 растворимых белков (Fisher et al., 1992; Kehr et al., 1999; Walz et al., 2004). Была выявлена большая группа белков, которые, вероятно, участвуют в поддержании основных клеточных процессов внутри ситовидных трубок (убиквитин, белки теплового шока, тиоредоксин h) (Schobert et al., 1995).
Во флоэмном соке могут также присутствовать органические кислоты, такие как яблочная, янтарная, аскорбиновая, лимонная (Dinant et al., 2010), нуклеиновые кислоты (Khn et al., 1996).
Значения рН флоэмного сока обычно составляет 7-9. Особый интерес вызывают условия аэрации во внутренней среде растений. Кислород диффундирует из окружающего воздуха через отверстия в эпидермисе и межклеточном воздушном пространстве в пределах ткани (Drew, 1997). Отсутствие специализированных систем для транспортировки кислорода, как правило, не является проблемой для роста растений и обмена веществ. Тем не менее, ткани с высокой метаболической активностью часто становятся гипоксичными. На основании косвенных доказательств можно предположить, что часть ткани флоэмы может быть аноксигенной. Во-первых, конкретные биохимические и морфологические характеристики могут привести к дефициту кислорода во флоэме. Флоэма представляет собой ткань с высокой метаболической активностью и высоким уровнем дыхания (van Bel, Knoblauch, 2000), что обеспечивает необходимым АТФ для активного импорта и транспортировки сахарозы (Komor, 1997; DeWitt, Sussman, 1995). Это неизбежно приводит к высоким скоростям локального потребления кислорода. Кроме того, доступ кислорода может быть ограничен из-за анатомических особенностей флоэмы: это достаточно плотная ткань с маленькими межклеточными пространствами или вакуолями (Parthasarathy, 1975; Behnke, Sjolund, 1990). Во-вторых, показано, что в камбии деревьев наблюдаются высокие концентрации этанола и активности алкогольдегидрогеназы (Kimmerer, Stringer, 1988), что указывает на анаэробные условия в ткани вблизи флоэмы. В-третьих, в корневых системы, в которые внедряется сосудистая ткань, наблюдаются низкие концентрации кислорода (Ober, Sharp, 1996; Drew, 1997). Все эти данные позволяют предположить, что во внутренней среде растений могут быть как аэробные, так и анаэробные условия.
Таким образом, растительный организм является благоприятной средой для сохранения и размножения многих сапрофитических и фитопатогенных микроорганизмов с самыми разными метаболическими потребностями.
Анатомические исследования поражённых побегов яблонь
Идентификация грибов. Большую часть штаммов грибов идентифицировали с помощью амплификации и секвенирования транскрибирующих спейсеров ITS (Kjer et al., 2010). Для идентификации грибов рода Fusarium использовали также праймеры ub T1 и ub T2, для грибов рода Alternaria – Alt-for и Alt-rev (O Donnell, Cigelnik, 1997, Hong et al., 2005).
Выделение ДНК грибов проводилось с помощью DNeasy Plant Mini Kit (QIAgen). Лиофилизированный грибковый мицелий измельчали и разрушали с помощью стеклянных шариков. Затем клеточный лизис проводили путем добавления лизирующего буфера АР-1 и раствора РНКазы с последующей инкубацией смеси при +65 C. Затем лизат помещали в центрифужную колонку (Qiashredder Mini Spin Column) и центрифугировали для удаления остатков клеток. После центрифугирования фильтрат удаляли. Колонку промывали добавлением этанольного буфера AW с последующим центрифугированием. Другую часть буфера AW добавляли к колонке и центрифугировали при максимальной скорости для высушивания мембраны в колонке с остатками этанола. Грибную ДНК, встроенную в мембрану, элюировали добавлением буфера AE непосредственно в мембрану на колонке DNeasy. Колонку затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем центрифугировали для отбора фильтрата, содержащего грибную ДНК, и растворяли его в буфере AE.
Амплификацию проводили с использованием набора, содержащего HotStarTaq ДНК-полимеразу, ПЦР-буфер (с MgCl2) и смесь дНТФ. В качестве праймеров использовались ITS 1 (с нуклеотидной последовательностью TCCGTAGGTGAACCTGCGG) и ITS 4 (с нуклеотидной последовательностью TCCTCCGCTTATTGATATGC) (Invitrogen), ub T1 (с нуклеотидной последовательностью AACATGCGTGAGATTGTAAGT) и ub T2 (с нуклеотидной последовательностью TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG), Alt-for (с нуклеотидной последовательностью ATGCAGTTCACCACCATCGC) и Alt-rev (с нуклеотидной последовательностью ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC). Праймеры смешивали с реактивами из набора Hotstar Taq Master Mix и образцами ДНК. Затем смесь переносили в ячейки ДНК-амплификатора (BioRad) и запускали процесс амплификации, используя следующий температурный цикл: – первоначальная стадия амплификации при +95 C в течение 15 мин для активации HotStarTaq ДНК-полимеразы; – 35 повторяющихся температурных циклов: денатурация: 1 мин при +95 C, отжиг праймеров: 1 мин при +56 C, элонгация: 1 мин при +72 C; – конечная элонгация в течение 10 мин при +72 C. Очистку продуктов ПЦР проводили с помощью 2%-ого агарозного гель-электрофореза при 75 V в течение 60 мин в буфере TBE. Затем агарозный гель окрашивали с использованием 1%-ого бромистого этидия. Окрашенный фрагмент ДНК размером 500 нуклеотидных последовательностей вырезали из агарозного геля.
Буферный раствор смешивали с продуктом ПЦР и инкубировали при +50 C в течение 10 мин в термомиксире Еppendorf при 1000 об/g. Затем смесь смешивали с соответствующим объемом изопропанола и центрифугировали. Фильтрат удаляли, а колонку дважды промывали буфером с последующим центрифугированием. В коммерческую компанию по секвенированию предоставляли амплифицированную грибную ДНК для определения нуклеотидной последовательности и сравнивали полученные результаты с имеющимися в общедоступных базах данными (GenBank) с помощью программы Blast-Algorithmus. Геноиндикацию представителей доминирующих видов грибов (A. alternata и F. equiseti) дополнительно подтверждали в лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского института защиты растений (г. Санкт-Петербург, Россия). Идентификация бактерий.
Для выделения ДНК бактерий клеточную суспензию центрифугировали при 1200 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, промывали клетки один раз PBS и ресуспендировали с добавлением 200 мкл охлажденного PBS (+4 С). Добавляли 25 мкл OB протеазы (D3496) в концентрации 20 мг/мл раствора, хорошо перемешивали на мешалке и инкубировали при +65 С на водяной бане в течение 5 мин для полного лизиса клеток. Затем добавляли 220 мкл буфера BL, перемешивали на мешалке, инкубировали при +70 С в течение 10 мин. Пробирку Эппендорфа с исследуемым материалом помещали во вторую пробирку объёмом 2 мл и промывали промывочным буфером (750 мкл), разбавленным этанолом, центрифугировали при 8000 об/мин в течение 1 мин, затем при 10000 об/мин в течение 2 мин для высушивания колонки. Высушенный материал помещали в стерильную пробирку объёмом 1,5 мл и добавляли 200 мкл предварительно нагретого буфера для элюции (+70 C). ПЦР-амплификацию 16S рРНК проводили с использованием двух праймеров: 16S-27F (AGAGTTTGATCNTGGYTCAG) и 16S-907R2 (CCGTGAATTCHTTTRAGTTT). ПЦР проводили в амплификационном буфере (MBI Fermentas Inc, Amherst, NY 14226). Амплификацию проводили с использованием следующего температурного профиля: инициация амплификации горячим запуском и добавлением фермента (как описано выше), денатурация при +94 С в течение 60 сек, отжиг при +56 С в течение 2 мин и полимеризация при +72 С в течение 3 мин (45 циклов) с последующей конечной элонгацией при +72 С в течение 10 мин (Bio Rad Laboratories, CA).
Особенности микробных ассоциаций здоровых и поражённых побегов яблонь
На первом этапе работы было необходимо сравнить микробные ассоциации здоровых и поражённых побегов яблонь разных сортов и выявить спектр видов, встречающихся только на поражённых побегах или преобладающих на них. С этой целью вначале были исследованы яблони сортов Беркутовское, Уэлси и Голден Делишес возраста 10-15 лет, произрастающие в Саратовском районе в схожих природно-климатических условиях. Для сравнения были взяты три группы деревьев: здоровые яблони из фермерских садов в окр. с. Багаевка, в которых вообще отсутствовали деревья с интересующими нас поражениями, яблони с характерными признаками микозного усыхания из заброшенных садов ОПХ и яблони без признаков поражения микозами, но произрастающие в непосредственной близости от поражённых деревьев в тех же садах ОПХ (рис. 7). Было исследовано по 30 побегов деревьев каждого сорта из каждой группы. Всего было проанализировано 270 побегов.
У яблонь сорта Беркутовское из всех групп наиболее часто на поверхности побегов встречались бактерии B. subtilis (встречаемость в пробах 63,4-86,7%) (табл. 5). Этот же вид имел и стабильно высокие количественные показатели на поверхности побегов (104 КОЕ/см2). Некоторые виды бактерий также изолировались с поверхности растений всех трёх групп, но их встречаемость увеличивалась у поражённых побегов. Такая закономерность была выявлена у B. amyloliquefaciens, B. pumilus, P. agglomerans. Следует отметить, что частота встречаемости и основного бактериального доминанта B. subtilis также увеличивалась у поражённых побегов по сравнению со здоровыми. Однако среди бактериальных ассоциантов мы не обнаружили ни одного вида, который массово изолировался бы из всех поражённых побегов.
Совершенно иные изменения наблюдались в грибной составляющей микробоценозов здоровых и поражённых побегов. На здоровых побегах массово встречались F. tricinctum и P. fungicola. На поражённых побегах и на здоровых деревьях, произрастающих в непосредственной близости от поражённых, видовой состав грибной микрофлоры менялся, и на их поверхности преобладали A. alternatа, A. tubingensis, F. equiseti. Высокие показатели встречаемости сохранялись и у F. tricinctum. Один вид грибов – A. alternatа – изолировался из 100% проб поражённых побегов, причём во всех пробах он имел высокие количественные показатели (103-104 КОЕ/см2). Таблица 5 – Сравнительная характеристика микробных ассоциаций поверхности здоровых и поражённых микозами побегов яблонь сорта Беркутовское
Наибольшее видовое разнообразие было отмечено на поверхности пораженных побегов (19 видов). Увеличение видового разнообразия произошло как за счёт бактериального, так и грибного компонента микробоценозов. Идексы общности видового состава поверхности побегов деревьев трёх сравниваемых групп оставались примерно одинаковыми и варьировали в пределах 46,7 – 52,6% (рис. 8).
При сравнении микробоценозов внутренних тканей здоровых и поражённых побегов сорта Беркутовское оказалось, что в отличие от поверхности, во внутренней среде доминируют исключительно бактериальные ассоцианты. Причём эта закономерность была характерна как для здоровых, так и для поражённых побегов (табл. 6). Во внутренней среде побегов доминирующее положение сохранял B. subtilis (встречаемость 46,7-50,0%), причём его концентрация в тканях могла достигать 105 КОЕ/г. Достаточно стабильно из внутренних тканей выделялись также B. megaterium, B. simplex и P. agglomerans. Частота их выделения из внутренних тканей здоровых и поражённых побегов несколько варьировала, но каких-либо закономерностей выявлено не было. Два вида – B. amyloliquefaciens и B. methylotrophicus – обнаруживались только во внутренних тканях побегов деревьев из поражённых садов, причём в тканях поражённых побегов эти виды имели достаточно высокие показатели встречаемости (50,0 и 23,4% соответственно) и численности (до 105 КОЕ/г). Таблица 6 – Сравнительная характеристика микробных ассоциаций внутренних тканей здоровых и поражённых микозами побегов яблонь сорта Беркутовское
Из грибных ассоциантов стабильно изолировался лишь Penicillium sp., который в небольшом количестве присутствовал во внутренней среде как здоровых, так и поражённых побегов. Основной грибной доминант поверхности побегов A. alternatа оказался способен проникать во внутренние ткани поражённых растений, причём его встречаемость здесь составляла 23,4%, а количественные показатели – 103 КОЕ/г.
Видовое разнообразие микробоценозов внутренних тканей здоровых и поражённых побегов было схожим (7-8 видов). Однако наиболее близкими оказались микробные ассоциации внутренних тканей здоровых и поражённых побегов деревьев, произрастающих на одной территории (индекс общности 87,5%) (рис. 9).
Основные вторичные метаболиты грибов, доминирующих в выявленном микокомплексе
В результате проведённых исследований было установлено, что на поражённых побегах выделяется достаточно стабильный комплекс микроорганизмов. Однако предыдущие исследования проводились в летний период и не давали представления о способности выявленных ассоциантов сохраняться в данной экологической нише в межвегетационный период. Поэтому на следующем этапе работы мы изучили динамику качественных и количественных характеристик микробных ассоциаций скелетных частей яблонь в течение года. Модельными объектами послужили поражённые деревья трёх сортов (Беркутовское, Голден Делишес и Уэлси) из садов Саратовского ОПХ. В течение года ежемесячно исследовалось по 10 деревьев каждого сорта.
На поверхности яблонь сорта Беркутовское в течение всего года присутствовали бактерии B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. subtilis, M. lacticum, грибы A. alternatа, C. cladosporioides и F. tricinctum. Максимальных количественных показателей на поверхности побегов бактериальные ассоцианты достигали в летний период, грибы – в летне-осенний период (табл. 21). Из внутренней среды побегов яблонь этого сорта стабильно изолировались B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus, B. subtilis, A. alternatа (табл. 22). Интересен тот факт, что из внутренних тканей побегов сорта Беркутовское в течение всего года массово изолировался B. methylotrophicus, который на поверхности яблонь этого сорта встречался единично, но доминировал на поверхности яблонь других сортов, произрастающих рядом. Концентрация бактериальных ассоциантов во внутренних тканях побегов сохранялась относительно стабильной в течение всего вегетационного периода, понижаясь зимой. Грибы максимальных количественных показателей достигали в осенний период. Таблица 21 – Сезонная динамика микробной ассоциации поверхности поражённых побегов яблонь сорта Беркутовское зима весна лето осень Микроорганизмы Bacillus amyloliquefaciens 20,0 10-102 30,0 102 36,7 10-102 26,8 10-102
В микробной ассоциации поверхности поражённых побегов яблонь сорта Голден Делишес в течение всего года прослеживалось доминирование трёх видов бактерий: B. methylotrophicus, B. pumilus, B. subtilis и трёх видов грибов: A. alternatа, F. equiseti и F. tricinctum (табл. 23) Другие микроорганизмы массово изолировались только в определённые периоды года: E. uredowora, M. lacticum и Pimelobacter simplex – весной, P. agglomerans – в летний период. Грибы A. tubingensis и C. cladosporioides выделялись в течение всего года, но высокой численности достигали в разные периоды: A. tubingensis – в осенний, а C. cladosporioides – в летний. Таблица – Сезонная динамика микробной ассоциации поверхности поражённых побегов яблонь сорта Голден Делишес зима весна лето осень Микроорганизмы Bacillus amyloliquefaciens 0 0 6,7 10 6,7 10 0 В. methylotrophicus 26,8 10-103 43,4 10-104 56,7 10-103 50,0 102 В. pumilus 16,7 102 26,8 103 30,0 102-104 26,8 103 В. subtilis 33,4 103-104 36,7 103-104 83,4 103-104 20,0 103-104 В. megaterium 0 0 0 0 13,4 102 0 Brevibacterium halotolerans 6,7 103 0 0 6,7 102 0 Erwinia chrysanthemi 0 0 6,7 103 13,4 103 0 E. uredowora 0 0 26,8 103 13,4 103 0 Microbacterium lacticum 13,4 103 43,4 104 0 0 0 Pantoea agglomerans 0 0 6,7 10-103 26,8 103-104 0 Pimelobacter simplex 0 0 43,4 102 13,4 102-103 0 Staphylococcus xylosus 6,7 10 0 0 0 0 6,7 102 Alternaria alternata 100,0 103-104 100,0 104 100,0 103-104 100,0 104 Aspergillus tubingensis 20,0 10 16,7 10 16,7 10 26,8 Cladosporium cladosporioides 13,4 10 16,7 102 26,8 102 13,4 F.usarium equiseti 26,8 10 53,4 102 63,4 102 43,4 102 F. tricinctum 20,0 10 53,4 102 43,4 102 43,4 Phoma fungicola 3,4 10 0 0 13,4 10 16,7 Trichoderma harzianum 3,4 10 0 0 3,4 10 0 0 Вы делено видов всего 13 14 17 10 Во внутренних тканях побегов этого сорта в течение всего года сохранялись бактерии B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus, B. subtilis, грибы A. alternata и F. equiseti, но их встречаемость в течение года была неравномерной и могла увеличиваться в 2-4 раза по сравнению с предыдущим периодом (табл. 24). Таблица 24 – Сезонная динамика микробной ассоциации внутренних тканей поражённых побегов яблонь сорта Голден Делишес зима весна лето осень Микроорганизмы Bacillus amyloliquefaciens 26,8 104-105 36,7 102-105 46,8 102-105 33,4 102-105 В. megaterium 13,4 104 0 0 26,8 104-105 0 В. methylotrophicus 36,7 102-104 76,7 102-105 63,4 102-105 23,4 102-104 В. subtilis 13,4 103 33,4 103-104 46,8 102-105 20,0 103 Pantoea agglomerans 10,0 104 0 0 36,7 105 0 Pimelobacter simplex 3,4 102 13,4 104 0 0 3,4 102 Staphylococcus xylosus 13,4 103 6,7 104 3,4 103 0 Alternaria alternata 16,7 103 20,0 103-105 26,8 103 23,4 104 Fusarium equiseti 10,0 102 16,7 103 20,0 103 20,0 103 F. tricinctum 10,0 102 6,7 102 0 0 13,4 102 Penicillium spp. 16,7 102 53,4 102-104 26,8 102 33,4 102 Phoma fungicola 0 0 6,7 103 0 0 6,7 102 Вы делено видов всего 11 10 9 9 На поверхности поражённых побегов сорта Уэлси доминирующее положение в течение всего года занимали B. methylotrophicus, B. pumilus, B. subtilis, P. agglomerans. У яблонь сорта Уэлси последний вид массово встречался на поверхности побегов в течение всего года, в то время как у яблонь других сортов P. agglomerans имел высокие количественные показатели только в летний период. B. amyloliquefaciens, относящийся к группе доминантов у яблонь сорта Беркутовское, у Уэлси также встречался регулярно в течение года, но в незначительном количестве. Из грибов на поверхности побегов Уэлси стабильно сохраняли доминирующее положение A. alternata, F. equiseti, F. tricinctum. Встречаемость двух последних видов несколько снижалась в весенний период