Введение к работе
Актуальность проблемы.
Planctomycetes - это обособленная филогенетическая группа в пределах домена Bacteria, объединяющая почкующиеся организмы с необычной морфологией и ультраструктурой клеток, не имеющие пептидогликана в составе клеточной стенки и обладающие рядом характеристик, несвойственных другим бактериям (Konig et al., 1984; Schlesner & Stackebrandt, 1986; Liesack et al., 1986; Fuerst, 1995, 2004; Ward et al., 2006).
Первый представитель этой группы бактерий, Planctomyces bekefii, был описан Гимези в 1924 г. при микроскопическом анализе проб воды (Gimesi, 1924). Этот морфологически уникальный организм является типовым видом рода Planctomyces, однако он до сих пор не получен в культуре, равно как и ряд других видов этого рода. Первый изолят этих сложных в культивировании бактерий удалось получить лишь в 1973 г. Стэйли, применившему для их выделения разбавленные питательные среды (Staley, 1973). В дальнейшем, для выделения планктомицетов был разработан целый ряд сред и подходов, позволивших изолировать представителей этой группы бактерий из различных водных и наземных местообитаний (Schmidt et al., 1978; Schlesner, 1994; Fuerst, 1997; Wang et al., 2002; Elshahed et al., 2007). Тем не менее, до недавнего времени число узаконенных таксонов планктомицетов включало лишь 6 родов (Planctomyces, Gemmata, Isosphaera, Pirellula, Rhodopirellula, Blastopirellula) и 10 видов (Ward et al., 2006).
Физиологическое и метаболическое разнообразие организмов в пределах Planctomycetes остается слабо изученным. Все полученные в чистых культурах планктомицеты являются аэробными хемоорганотрофами. Ряд штаммов способен к сбраживанию углеводов (Hirsch & Mtiller, 1985; Schlesner, 1986). Знания о существующих метаболических типах планктомицетов были недавно пополнены открытием анаэробных автотрофных представителей этой группы бактерий, осуществляющих процесс анаэробного окисления аммония - «Anammox» (Strous et al., 1999; Jetten et al., 2005; Kartal et al., 2007). Первоначально, эти организмы были обнаружены в очистных биореакторах, однако дальнейшие исследования с применением молекулярных методов выявили их широкое распространение в морских водоемах и эстуариях (Kuypers et al., 2002; Schmid et al., 2002; Schubert et al., 2006). «Anammox»-планктомицеты пока не выделены в чистых культурах и имеют статус "Candidatus", однако их характеристики детально изучены. Число известных экофизиологических типов планктомицетов также невелико. За исключением умеренного термофила Isosphaera pallida (Giovannoni et al., 1987), все известные до недавнего времени планктомицеты являлись мезофиллами и нейтрофилами.
Сложность культивирования планктомицетов долгое время сдерживала накопление знаний об их распространении в природных экосистемах. Считалось, что эти организмы типичны только для водных местообитаний. С введением в практику новых молекулярных подходов, позволяющих идентифицировать микроорганизмы in
situ, без их культивирования, было обнаружено, что планктомицеты являются одной из численно репрезентативных групп бактерий как в водных, так и наземных местообитаниях с различными физико-химическими характеристиками (Zarda et al., 1997; Neef et al., 1998; Derakshani et al., 2001; Kirkpatrick et al., 2006). Применение молекулярных методов для исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов сфагновых болот, представляющих одну из доминирующих наземных экосистем Северного полушария, выявило, что планктомицеты являются важным компонентом их микробного сообщества (Dedysh et al., 2006). Это было неожиданной находкой, так как сфагновые болота имеют кислую реакцию среды (рН 3.5-5.5), а все ранее описанные планктомицеты были способны расти в диапазоне рН 6.0-8.5. В ходе дальнейших исследований было получено несколько изолятов болотных планктомицетов (Куличевская и др., 2006), что открывало возможности изучения их физиологии, экологии и природы осуществляемых ими процессов.
Таким образом, настоящее исследование было направлено на исследование ранее неизвестных ацидофильных представителей филогенетической группы Planctomycetes, населяющих одну из важнейших наземных экосистем бореальной и тундровой зон Северного полушария.
Цели и задачи исследования.
Цель работы - изучить филогенетическое разнообразие и функциональную роль планктомицетов в микробных сообществах сфагновых болот.
Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
Определить численность планктомицетов в сфагновых болотах различного трофического статуса и уровня кислотности, а также характер распределения этих бактерий по профилю болот.
Оценить филогенетическое разнообразие планктомицетов в болотах.
Охарактеризовать чистые культуры болотных планктомицетов и определить их таксономический статус.
Установить функциональную роль планктомицетов в микробных сообществах сфагновых болот.
Научная новизна и значимость работы.
С помощью метода in situ гибридизации с флуоресцентно-мечеными 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами, разработанными для детекции представителей филогенетической группы Planctomycetes (метод FISH), было установлено, что планктомицеты являются неотъемлемым и численно важным компонентом микробного сообщества сфагновых болот севера России, составляя до 14% общей численности бактерий в этих экосистемах.
Впервые осуществлена оценка филогенетического разнообразия планктомицетов в сфагновых болотах путем формирования и анализа библиотеки клонов генов 16S рРНК этих бактерий. Показано, что болотные планктомицеты филогенетически
отличны от ранее изученных представителей Planctomycetes. Впервые проведена дифференцированная оценка популяционной численности отдельных групп планктомицетов с использованием набора 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов, разработанных для отдельных групп болотных планктомицетов. Выявлено четкое различие состава сообществ планктомицетов, населяющих аэробную и микроаэробно-анаэробную части профиля сфагновых болот. Описано и узаконено 2 новых рода и 2 новых вида порядка Planctomycetales: Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov. и Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov. Это первые ацидофильные организмы, выявленные в пределах Planctomycetales. Установлена способность ацидофильных планктомицетов к деградации широкого спектра биополимеров - ксилана, пектина, эскулина, пуллулана, хондроитин-сульфата, ламинарина и фукоидана, что свидетельствует об их участии в процессах трансформации органического вещества в кислых болотных экосистемах. Типовые штаммы новых родов и видов депонированы в международных коллекциях микроорганизмов АТСС, DSMZ и ВКМ.
Практическая значимость.
Сформирована база данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК планктомицетов, населяющих северные сфагновые болота. База данных может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.
Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для дифференцированной детекции основных групп болотных планктомицетов, в том числе зонды для ацидофильных планктомицетов Schlesneria paludicola, Singulisphaera acidiphila и ''Zavarzinella formosa'.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:
European Large Lakes Symposium, Tartu, Estonia, 2006.
Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии: II Международная молодежная школа-конференция», Москва, ИНМИ РАН, 2006.
10-th International Symposium on Wetland Biogeochemistry: Frontiers in Biogeochemistry, Annapolis, Maryland, USA, 2007.
10-th Symposium on Aquatic Microbial Ecology, Faro, Portugal, 2007.
Публикации.
Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 5 тезисах.
Объем и структура диссертации.
