Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1 Фитазы бактерий как основа новых биотехнологий 12
1.1 Классификация и свойства фитаз 14
1.1.1 Гистидиновые кислые фитазы (HAPs) 16
1.1.2 -Пропеллерные фитазы (BPPs) 19
1.1.3 Цистеиновые фосфатазы (CPs) 21
1.1.4 Пурпурнокислые фитазы (РАРs)
1.2 Распространенность фитаз в живой природе 25
1.3 Биологические функции фитаз
2 Распространенность фитата, локализация и функции 35
3 Гетерологичные системы экспрессии на основе генов фитаз 46
3.1 Оптимизация гетерологичной экспрессии фитаз в растениях 51
3.2 Кодон-оптимизация генов для гетерологичной экспрессии 52
3.3 Свойства рекомбинантных фитаз, экспрессируемых растениями 54
4 Агробактериальная трансформация растений 56
4.1 Бинарные векторные системы 64
4.2 Arabidopsis thaliana – модельный организм для изучения рекомбинантной экспрессии 67
Заключение 69
Экспериментальная часть 71
Материалы и методы 71
1 Штаммы и культуры бактрий з
2 Плазмиды и конструкции экспрессионных систем 71
3 Трансформация бактерий 75
4 Растения Arabidopsis thaliana 77
5 Агробактериальная трансформация растений 78
6 Выделение геномной ДНК растений 79
7 Выделение тотальной РНК растений 81
8 Получение кДНК 82
9 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 10 Электрофорез ДНК 85
11 Выделение белкового экстракта из тканей растений 85
12 Электрофорез в ПААГ 86
13 Вестерн-блоттинг 86
14 Определение фитазной активности 87
15 Характеристика растений при росте на средах
с разными источниками фосфора 88
16 Геноинформатика 90
17 Статистическая и компьютерная обработка данных 90
Результаты 91
1 Получение растений Arabidopsis thaliana с интегрированным геном бактериальной фитазы Pantoea agglomerans под управлением конститутивного промотора 91
1.1 Создание гетерологичного вектора экспрессии гена бактериальной фитазы 91
1.2 Получение рекомбинантного штамма Agrobacterium tumefaciens с интегрированным геном бактериальной фитазы 96
1.3 Агробактериальная трансформация растений A. thaliana и получение гомозиготных по интегрированному гену фитазы линий растений 97
2 Анализ экспрессии гена бактериальной фитазы в растениях A. thaliana 101
2.1 Экспрессия бактериальной фитазы в растениях на транскрипционном и трансляционном уровне 101
2.2 Активность бактериальной фитазы, экспрессируемой растениями 105
3 Характеристика растений, экспрессирующих модифицированную бактериальную фитазу 107
3.1 Влияние гетерологичной экспрессии на жизнеспособность семян растений 107
3.2 Влияние гетерологичной экспрессии на рост и морфологию модифицированных растений 108
3.3 Содержание фосфора в тканях растений при росте на среде с фитатом 118
Обсуждение результатов 122
Заключение 133
Список сокращений 135
Список литературы
- -Пропеллерные фитазы (BPPs)
- Кодон-оптимизация генов для гетерологичной экспрессии
- Агробактериальная трансформация растений
- Получение рекомбинантного штамма Agrobacterium tumefaciens с интегрированным геном бактериальной фитазы
Введение к работе
Актуальность работы. В жизнедеятельности организмов важную роль
играют минеральные элементы, дефицит которых может привести к
необратимым последствиям. Жизненноважным элементом для клетки
является фосфор. Он выполняет структурную и регуляторную функции,
включаясь в молекулы нуклеиновых кислот, липидов мембран, АТФ, а также
внутриклеточной сигнальной системы. Уровень фосфора поддерживается
транспортом ионов из окружающей среды. Микроорганизмы и растения
получают ионы фосфора из различных источников, для растений
поступление фосфора обеспечивается корневым питанием.
Основополагающим фактором в обеспечении растений фосфором является достаточное содержание его легкоусвояемых форм в окружающей среде. В настоящее время сокращение запасов природного неорганического фосфата в форме природных апатитов и фосфоритов является серьезной проблемой для сельского хозяйства [Plaxton, Tran, 2011]. Фосфор накапливается в почве в виде труднорастворимых инозитолфосфатов (фитатов). Входящие в состав фитата фосфатные остатки не усваиваются корнями растений [Belgaroui et al., 2015, 2016]. Таким образом, фитат является лимитирующим фактором роста и развития растений. Кроме того, фитат проявляет и другие антиалиментарные свойства, связывая многие ионы металлов (кальций, цинк, магний, железо), неорганические и органические анионы (нитрат, малат, сульфат), также молекулы белков и сахаров. Хелатированные фитаты, устойчивые к биодеградации, недоступны для большинства живых организмов. Поскольку фитат в больших количествах содержится в почве и в семенах растений, его негативное действие отражается на жизнедеятельности растений и животных.
Кроме отрицательного влияния на питание живых организмов, фитат
имеет пагубное воздействие на окружающую среду. Из остатков
растительных тканей и неусвоенный животными фитат попадает в почву,
вымывается в водоемы и накапливается, что ведет к неконтролируемому
росту цианобактерий, водорослей и дальнейшей эвтрофикации,
проявляющейся в заболачивании водоемов, дефиците кислорода и гибели водной флоры и фауны [Joshi, Satyanarayana, 2015].
Широкая распространенность фитата в окружающей среде
представляет научный и практический интерес в качестве перспективного альтернативного источника фосфора. Это связано с уникальным действием специфических фосфогидролаз – фитаз, которые синтезируются многими почвенными микроорганизмами. Использование фитаз бактерий и микромицетов является эффективным способом утилизации фитата и
повышения доступности фосфата почв. На этой основе развиваются новые биотехнологии, связанные с использованием ферментов микроорганизмов для утилизации труднодоступных фитатов почв и производства кормов для животных.
Цель работы – создание эффективной системы экспрессии
бактериальной фитазы Pantoea agglomerans под управлением
конститутивного вирусного промотора в растениях.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Создать гетерологичную систему экспрессии фитазы P. agglomerans для трансформации растений.
-
Получить растения A. thaliana, гомозиготные по интегрированному гену бактериальной фитазы P. agglomerans.
-
Установить экспрессию гена бактериальной фитазы P. agglomerans в растениях.
-
Определить фитазную активность и локализацию бактериального фермента в тканях растений A. thaliana.
-
Изучить влияние экспрессии бактериальной фитазы на рост и развитие растений.
-
Определить содержание фосфора в тканях растений при росте на средах с разными источниками фосфора.
Научная новизна. Впервые разработана эффективная система конститутивной экспрессии бактериальной гистидиновой кислой фитазы Pantoea agglomerans для растений A. thaliana. Показана способность модифицированных растений экспрессировать активную бактериальную фитазу под контролем конститутивного вирусного промотора во всех тканях. Установлено, что под управлением растительного сигнального пептида экстенсина AtExt бактериальный фермент эффективно экспрессируется в ризосфере корней. Рекомбинантная фитаза, экспрессируемая растениями, не теряет каталитической активности и позволяет растениям расти на среде с фитатом в качестве источника неорганического фосфата, при этом содержание фосфора в тканях растений поддерживается на физиологическом уровне. Установлено, что экспрессия бактериальной фитазы не оказывает негативного влияния на рост и развитие растений.
Практическая значимость работы. Установлено, что синтез бактериальной фитазы способствует усвоению почвенного фитата корнями растений, их росту и развитию в условиях недостатка неорганического фосфата. Новая экспрессионная система может быть использована для преодоления дефицита фосфора в питании растений при их росте в фитатобогащенных почвах, для решения проблемы недоступности фосфора
в кормах растительного происхождения для животных с однокамерным желудком и проблемы эвтрофикации водоемов вследствие выброса недоступного фосфора, содержащегося в растительных остатках. Положения, выносимые на защиту:
-
Получена гетерологичная система экспрессии на основе гена бактериальной фитазы P. agglomerans и конститутивного вирусного промотора.
-
Бактериальная фитаза P. agglomerans экспрессирована в клеточной стенке клеток растений A. thaliana.
-
Экспрессия бактериальной фитазы позволяет выращивать модифицированные растения на среде с фитатом в качестве единственного источника фосфора, способствует улучшению их роста и развития в условиях дефицита фосфора.
-
Степень достоверности результатов исследований подтверждается многократными экспериментами, проведенными с соблюдением методик, имеющих мировые стандарты; анализ результатов проводили на современном высокоточном оборудовании и с использованием методов статистической обработки данных; результаты обсуждались на многочисленных научных конференциях с ведущими специалистами в данной области; результаты опубликованы в зарубежных научных изданиях, рецензируемых ведущими учеными в данной области.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Международных, Всероссийских и региональных конференциях: V Съезде биохимиков России (Дагомыс, 2016), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS, 2016), международной конференции «Трансляционная Медицина-2016» (Казань, 2016), Всероссийском научном форуме «Наука будущего – наука молодых» (Казань, 2016), Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», РАСН, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 2013, 2016), Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии» (Иркутск, 2015), Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012, 2014), Всероссийской школеконференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2012, 2014), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2013, 2014), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ
(FEBS) «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013), ХIХ и ХХ Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых: «Михаил Ломоносов», (Москва, МГУ, 2012, 2013, 2015), ХХ Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013), Итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань 2015, 2016).
Связь с научными программами и собственный вклад автора в
исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы
повышения конкурентоспособности «Казанского (Приволжского)
федерального университета» среди ведущих мировых научно–
исследовательских центров на базе Open Lab «Микробные биотехнологии». Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ №15-04-01645а, РФФИ № 16-08-00583а, Федеральной целевой программы «Научные и научно - педагогические кадры инновационной России» 2009-2013гг. (ГК № П344, ГК № П406, ГК № П323, ГК № 815, ГК № 1053, ГК № 14.А18.21.0575), а также за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект №14-83 0211/02.11.10083.001).
Личный вклад автора заключается в разработке основной проблемы
исследования, планирования, организации и реализации ее
экспериментального решения, интерпретации результатов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ в том числе 11 статей, 2 тезиса в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертации, 3 публикации перечня РИНЦ, 1 учебно-методическое пособие.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение и список литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 23 рисунка. Библиография содержит 124 наименования статей российских и зарубежных авторов.
-Пропеллерные фитазы (BPPs)
Фитазы (мио-инозитолгексакисфосфат фосфогидролазы) гидродизуют фитат до менее фосфорилированных форм мио-инозитолфосфата (от пента- до моно-инозитолфосфата). При полном гидролизе фитата образуется одна молекула мио-инозитола и шесть молекул фосфата. Интермедиатами частичного гидролиза являются моно-, ди-, три-, тетра- и пента-мио-инозитолфосфаты и остатки фосфорной кислоты [Rao et al., 2009].
Классификация фитаз основана на различных критериях. В зависимости от стереоспецифичности фитаз их подразделяют на 3-фитазы (мио-инозитолгексакисфосфат-3-фосфогидролазы, EC 3.1.3.8), 6-фитазы (мио-инозитолгексакисфосфат-6-фосфогидролазы, EC 3.1.3.26), и 5-фитазы (мио-инозитолгексакисфосфат-5-фосфогидролазы, EC 3.1.3.72) [Rao et al., 2009]. 3-фитазы выделены из бактерий и микромицетов (Aspergillus niger, Neurospora crassa, Pseudomonas, Klebsiella sp. ASR1). Для этой группы фитаз характерна инициация гидролиза фитата в d-3 положении остатка фосфата в инозитольном кольце молекулы. 6-Фитазы гидролизуют фитат по шестому остатку фосфата (d-4 (L-6) положение); фитазы этой группы обнаружены у бактерий Escherichia coli, инфузорий Paramecium. В группу 5-фитаз входят ферменты растительного происхождения (Medicago sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum), гидролиз фитата которыми начинается с пятого фосфатного остатка. Основным отличием 6-фитаз от 5-фитаз растительного происхождения в деградации фитата является то, что конечным продуктом последних является мио-инозитол пентакисфосфат [Rao et al., 2009; Yao et al., 2011; Konietzny, Greiner, 2002].
Классификация фитаз проводится на основании рН-оптимума каталитической активности (щелочные и кислые фитазы), на основании механизма катализа (гистидиновые кислые фосфатазы, -пропеллерные фитазы, цистеиновые фосфатазы и пурпурно-кислые фосфатазы), а также на основании стереоспецифиности реакции гидролиза (3-, 5- и 6-фитазы) [Lei, Porress, 2007].
На основании рН-оптимума фитазы могут быть разделены на два обширных класса: кислые и щелочные фитазы [Yao et al., 2011]. По общим биохимическим свойствам (аминокислотная последовательность в активном центре фитазы) и каталитическим механизмам фитазы классифицированы на четыре группы: гистидиновые кислые фосфатазы, -пропеллерные фитазы, пурпурно-кислые фосфатазы и цистеиновые фитазы [Mullaney, Ullah, 2007; Rao et al., 2009]. Группы фитаз НАРs, PAPs и CPs относятся к кислым фитазам; также кислой фитазой является тирозиновая фосфатаза (PTP)-подобная фитаза (инозитолполифосфатаза IPPаза – фитаза phyAme) анаэробной бактерии Megasphaera elsdenii [Yao et al., 2011; Puhl et al., 2009]. Кислые фитазы обнаружены у микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae: E. coli, Pantoea agglomerans, Shigella sp., Enterobacter cloacea [Cottrill et al., 2002; Greiner, 2004; Kalsi et al., 2016; Pal Roy et al., 2016]. В группу гистидиновых кислых фитаз входят грибные и бактериальные ферменты. Фитазы HAPs выделены из микромицетов рода Aspergillus, бактерий E. coli. Цистеиновые фитазы являются новым классом фитаз, впервые описанным для анаэробных бактерий Selenomonas ruminantium, обитающих в пищеварительном тракте жвачных животных [Yanke et al, 1999; Chu et al., 2004]. Группа -пропеллерных фитаз объединяет в основном ферменты бактерий рода Bacillus; -пропеллерная фитаза впервые выделена из клеток грамположительных спорообразующих почвенных бактерий рода Bacillus [Keruovo et al., 1998; Yao et al., 2011]. Название связано с наличием в структуре фитаз этой группы структуры 6-лопастного -складчатого слоя [Rao et al., 2009].
Большинство ферментов, относящихся к 3-фитазам, обнаруживают гомологию с BPPs или HAPs. 5-Фитаза из растительной пыльцы хотя и имеет конформацию, сходную с HAPs, однако у нее отсутствует консервативная последовательность активного центра, характерная для этой группы фитаз. Наибольшая гомология 5-фитаз прослеживается с множественными инозитол-полифосфат фосфатазами (multiple inositol polyphosphate phosphatase, MINPP) из тканей млекопитающих (человека, крыс). Некоторые фитазы групп PAPs, HAPs относят к 6-фитазам [Bohn et al., 2008; Mehta et al., 2006].
Кодон-оптимизация генов для гетерологичной экспрессии
Фитат накапливается на последних стадиях жизненного цикла растений и возвращается в почву, если не был усвоен организмами [Haefner et al., 2005]. Путь попадания фитата в почву связан с растительноядными животными, поскольку многие из них не могут усваивать фитат. Инозитолфосфаты составляют от 2 до 60% отходов жизнедеятельности животных. Фитат попадает в почву вместе с отмершими растительными тканями. По подсчетам, на фосфорилированный инозитол приходится 3-7 % органического фосфора сена, а также небольшая часть фосфата клеток бактерий, грибов и корней высших растений [Turner et al., 2002].
Инозитолфосфаты составляют большую часть всех моноэфиров почв и фосфорных соединений в целом и представляют собой смесь полифосфатов, содержащих четыре из девяти известных стереоизомеров инозитолфосфата, а именно: мио-, сцилло-, хиро- и нео-инозитолфосфаты, причем доминирующим является мио-инозитолгексакисфосфат [Doolette, 2010]. В некоторых случаях содержание фитата может достигать 20-50% от общего органического фосфора в почве [Yip et al., 2003]. Три других фосфорилированных стереоизомера располагаются в порядке их распространенности в почве: сцилло- D-хиро нео и редко обнаруживаются в биологических тканях. Инозитолфосфаты с низким содержанием фосфатных групп (от монофосфатов до тетрафосфатов) обнаруживают в почве значительно реже. Таким образом, наибольшее распространение среди всех фосфорных органических соединений почв имеют высшие инозитолфосфаты – мио-инозитолгексафосфат и сцилло инозитолгексафосфат [Doolette, 2010].
Количество инозитолфосфатов различается в зависимости от типа почв, содержания в них органического вещества. Так, лесные почвы содержат больше фитата, чем пустынные почвы. В почве фитат, как и многие другие моноэфиры, взаимодействует с различными соединениями и ионами. Например, он способен связываться с глинами, гуминовыми соединениями, что обусловлено наличием шести остатков фосфата в структуре фитата. Подобное поведение фитата делает его менее реакционно способным и мало доступным для ферментативного расщепления. Стабильность мио-инозитолфосфата по сравнению с другими органическими соединениями фосфора объясняет его высокое содержание в почвах.
Круговорот фосфора в почвах определяется в большей степени иммобилизацией и минерализацией органических и неорганических соединений фосфора. Низкая растворимость фитата почв играет основную роль в ограничении ассимиляции фосфора растениями. Иммобилизация может быть связана как с биологической конверсией неорганического фосфата в органический, так и с процессами сорбции, преципитации и комплексообразования неорганического фосфата. Минерализация органического фосфора связана с активностью почвенных микроорганизмов, а также растительных ферментов, секретируемых корнями, что влияет на способность растений усваивать фосфор [Doolette, 2010]. Поскольку органические фосфаты в форме фитата не могут быть усвоены корнями, фитат является главным лимитирующим фактором роста и развития растений [Yip, 2003].
Важным свойством инозитолфосфатов является их хелатирующая способность. Инозитолфосфаты представляют собой семейство сильных природных полианионных хелаторов биологически важных катионов металлов. Расположенные рядом фосфатные группы мио-инозитола способны формировать внутримолекулярные связи с катионами двух- и трехвалентных металлов Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Al3+, Mn2+, создавая стабильные хелатные комплексы [Oh et al., 2004; Rao et al., 2009; Kim et al., 2010]. Возможно образование межмолекулярных связей, в которых фосфатные остатки двух и более молекул фитата связывают один катион (Ca2+ или Fe3+), в результате чего образуются полимерные соединения [Dao, 2007]. Взаимодействие аниона фитата с катионами может приводить к преципитации катион-фитатного комплекса, хотя этот процесс завитсит от соотношения катионов, их валентности и рН. Большинство хелатов с двухвалентными катионами растворимы при рН меньших 3.5, с максимумом растворимоcти при рН от 4.0 до 7.0. хелаты моновалентных катионов таких, как натрий и калий, растворимы при любых значениях рН [Selle et al., 2000]. Тем не менее, фитат чаще встречается в виде осадка и большое влияние на растворимость оказывает не только рН среды, но и повышенная концентрация двувалентных катионов. Известно, что в растительных тканях фитат представлен в основном нерастворимыми кальциевыми, калиевыми и магниевыми солями, однако, следует учитывать, что понятие нерастворимости не абсолютно, так как в течение созревания семян соли фитата мобилизуются, переходя в растворимую форму [Shears, Turner, 2007].
Хелатирующие свойства фитата проявляются при его взаимодействии с другими питательными элементами помимо фосфора и минералов. За счет большого отрицательного заряда фитат связывается и образует комплексы с положительно заряженными молекулами, такими как низкомолекулярные углероды (крахмал) и белки как в кислых, так и в щелочных условиях [Selle et al., 2000; Rao et al., 2009]. Связывание белка с фитатом ведет к изменению структуры, растворимости белка, к изменению в доступности молекул белка для протеолиза, а также активности – в случае ферментов [Rao et al., 2009]. Существование фитат-белковых комплексов впервые показано в экстрактах семян хлопка. Принято считать, что фитат вступает в связь с молекулами белка с образованием двух различных комплексов в зависимости от рН. Двойные фитат-белковые комплексы образуются при кислых значениях рН, а тройные комплексы из белка, фитата и минерала формируются через катионные мостики в условиях нейтральных рН. Таким образом, гидролиз фитата ведет к высвобождению белков и фосфата. Связь фитата с белками имеет практическое и экономическое значение: включение кормовых добавок в рацион сельскохозяйственных животных направлено на повышение усвоения фитат-связанного фосфора, а также других питательных элементов. Подтверждением эффективности данной технологии являются результаты кормления домашней птицы и свиней добавками фитаз [Selle et al., 2000].
Агробактериальная трансформация растений
В работе использовали растения Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Columbia, далее WT). Семена растения предоставлены Е.В. Шакировым (University of Texas at Austin, Austin, USA). Растения выращивали в ростовых камерах (Binder; Sanyo). Условия роста растений на почве: семена, предварительно выдержанные 2-3 суток при 4 С, высаживали в стерильную увлажненную почву. Условия роста A. thaliana: фотопериод 16 ч. день/ 8 ч. ночь, 20-22 С, влажность воздуха 60%, влажность почвы поддерживалась на высоком уровне; полив проводили каждые двое суток. Режим стерилизации почвы: автоклавирование при 1 атм., 121 С, 20 мин.
Выращивание растений в стерильных условиях на чашках Петри. Для селекции и проращивания растений семена высевали стерильно на чашки Петри с использованием среды MS (Murashige and Skoog Basal Medium, Sigma Aldrich): 50% MS, 2% сахароза, 0.7% агар с добавлением гербицида BASTA в концентрации 25 мкг/мл [Murashige, Skoog, 1986]. В среду MS дополнительно вносили антибиотик ванкомицин (100 мкг/ мл) для угнетения развития контаминантной микрофлоры. Перед посевом семена стерилизовали по следующей методике: промывание 70% этанолом – 1 мин, промывание 50% раствором гипохлорида натрия с добавлением 0.5% Тритон-Х100 –7 мин, промывание стерильной дистиллированной водой 5 раз до полного удаления гипохлорида натрия. Стерильные семена растений высевали на среду MS на чашки Петри и выращивали 7-10 дней.
Выращивание растений в гидропонной системе. Эксперименты по росту растений на различных источниках фосфора проводили в гидропонных установках с жидкой минеральной средой. Гидропонная установка состояла из светонепроницаемого контейнера объемом 600 мл и крышки с 12 лунками для растений, отстоящими друг от друга на расстояние 1.5 см. В каждую лунку помещали пластиковый эппендорф объемом 200 мкл с предварительно срезанным дном для выхода корней в жидкую среду; эппендорф заполняли 0.7% агаром. Контейнеры предварительно стерилизовали автоклавированием. Растения растили на жидкой минеральной среде с рН 5.5 следующего состава (моль/л): KNO3 -5.10х10-3, Ca(NO3)2х4H2O - 1.01х10-3, MgSO4х7H2O - 4.98х10-4, NH4NO3 – 2.93х10-5, NaOH - 3.13х10-5, EDTA - 2.23х10-5, FeSO4х7H2O - 2.24х10-5, раствор микроэлементов. Раствор микроэлементов (г/л): H3BO3 - 2.86, MnCl2х4H2O - 1.81, ZnSO4х7H2O - 0.22, CuSO4х5H2O - 0.08, Co(NO3)2х6H2O - 0.003, NaMoO4 - 0.025 [Tocquin et al., 2003]. В качестве источника фосфора добавляли 0.8 М Na2HPO4 или 0.133 М фитат натрия (myo-inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt, Sigma Aldrich). Фитат натрия стерилизовали фильтрованием и вносили в стерильную минеральную среду после ее остывания. Стерильной средой комнатной температуры заполняли гидропонные контейнеры. Семена растений предварительно высевали на стерильные чашки Петри со средой MS и проращивали в течение 10 сут до образования первых настоящих листьев и неразветвленного корня. Далее в каждую ячейку контейнера пересаживали по одному растению и покрывали контейнер целлофановой пленкой; пленку снимали через 4-5 сут. Растения выращивали в течение 35 сут в климатической камере при стандартных условиях.
Трансформацию растений A. thaliana проводили методом агробактериальной трансформации путем макания цветков и бутонов растений в суспензию агробактерий («floral-dip» метод, рисунок 5) [Clough, Bent, 1998]. Для проведения трансформации растения выращивали в оптимальных условиях в течение 18-21 дней до стадии образования бутонов и цветков. Культуры бактерий A. tumefaciens GV3101 (pCBK05) и GV3101 (pCEV04) выращивали в 500 мл LB с добавлением антибиотиков (Gm и Km 100 и 50 мкг/мл, соответственно) при 30 С в течение 12 ч. Далее клетки осаждали центрифугированием при 5.5 тыс g в течение 30 мин при комнатной температуре. Осажденные клетки ресуспендировали в 500 мл 5% сахарозы с добавлением 0.04% детергента-пенообразователя Silwet. Соцветия растущих на почве интактных растений окунали в суспензию агробактерий на 2 минуты. Далее растения помещали в контейнер и покрывали целлофановой пленкой на 3 сут для избегания испарения влаги и высыхания почвы. Далее трансформированные растения выращивали в стандартных условиях.
Выделение геномной ДНК растений Выделение геномной ДНК растений проводили по стандартной методике с использованием буфера СТАВ. СТАВ-буфер: 2% СТАВ (гексаадециклиметиламмониумбромид), 100 мМ Трис-HCl, 20 мМ ЕDTA, 1.4 М NaCl, 0.2% -меркаптоэтанол. Растительную ткань гомогенезировали с помощью пестика в 600 мкл СТАВ-буфера и инкубировали при 60 С в течение 1 ч. Добавляли 600 мкл хлороформа и осаждали центрифугированием при 13 тыс. об/мин в течение 15 мин. Отбирали 500 мкл супернатанта, добавляли 500 мкл изопропанола. Разделяли смесь центрифугированием и сливали изопропанол. Добавляли 100 мкл 70% этанола, центрифугировали. Для полного испарения жидкости оставляли пробы открытыми. Добавляли 50 мкл воды, 1 мкл РНКазы и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. Готовые пробы хранили при 4 С.
Получение рекомбинантного штамма Agrobacterium tumefaciens с интегрированным геном бактериальной фитазы
Кроме того, необходимо наличие репортерных генов и других генетических элементов, позволяющих увеличить эффективность процесса трансформации.
Таким образом, основным при трансформации агробактериальным вектором является выбор совместимых селективных маркеров и подходящих сайтов клонирования. Однако при клонировании больших фрагментов ДНК (более 15 тыс.п.о.) большее значение имеет способность вектора поддерживаться в клетках рекомбинантных агробактерий в активном состоянии [Komari et al., 2006].
В 1983 г. показано, что Т-ДНК и гены vir могут находится в агробактерии на двух разных репликонах (в транс-положении), и при этом происходит эффективный перенос в растения Т-ДНК. Основанный на этом подход назван бинарной векторной системой. Плазмиду, содержащую Т-ДНК, называют бинарным вектором, а плазмиду, несущую гены vir – помощником (хелпером). Хелперная плазмида представляет собой Ti-плазмду с делецией всей Т-ДНК или ее части, то есть она обеспечивает все функции переноса Т-ДНК, но не содержит последней. С другой стороны, бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации и для E. coli и для A. tumefaciens, но не несет генов вирулентности, представляя собой челночный вектор E. coli - A. tumefaciens (рисунок 3). Все стадии клонирования проводят в клетках E.coli, а затем бинарный вектор вводят в штамм A. tumefaciens, который уже несет плазмиду-хелпер [Щелкунов, 2004]. Использование бинарных векторов является стандартной методикой для модификации высших растений путем агробактериальной трансформации. Кроме бинарных векторов создаются супер-бинарные векторы, в состав которых входят дополнительные гены вирулентности из Ti-плазмид, что позволяет достигать более высокой частоты трансформации. В супер-бинарных векторных системах, ДНК фрагменты, содержащие последоваетльности генов virB, virE и virG, полученные из плазмиды pTiBo542, встроены в малый Т-ДНК-несущий вектор. Супер-бинарные вектора обладают высокой эффективностью трансформации различных видов растений и играют важную роль в получении модифицированных злаковых культур, плохо поддающихся трансформации [Komari et al., 2006].
Наиболее эффективным методом внедрения чужеродной ДНК в составе рекомбинантного бинарного вектора в клетки агробактерий является электропорация. Гидрофильные поры, образующиеся в мембране клеток бактерий под действием электрического заряда, позволяют большим молекулам, таким как ДНК, проникать внутрь клетки. Также важным фактором является способность клеток восстанавливаться после электропорации. Другие методы, такие как трансформация путем замораживания/оттаивания, а также метод Triparental mating, основанный на конъюгации бактерий, либо менее эффективны, либо более сложны в воспроизведении [Wise et al., 2006]. Рисунок 3 – структура бинарного вектора агробактериальной трансформации растений. RB, LB – концевые повторы Т-ДНК плазмиды Ti; oriV, tfrA – генетические элементы плазмиды с широким кругом хозяев RP4, обеспечивающие ее репликацию; nptIII – ген устойчивости к канамицину, функционирующий в бактериях; pubi3-nptIIubi3 – гибридный ген, экспрессирующийся в растениях, устойчивость к канамицину; pubi3 ,tubi3 промотор и терминатор гена ubi3, кодирующего убиквитин [Щелкунов, 2004].
Одним из наиболее широко используемых эукариотических модельных объектов в биологии является растение семейства крестоцветных Arabidopsis thaliana. Использование арабидопсиса в научных исследованиях в первую очередь обусловлено особенностями генетической организации данного растения. Диплоидный геном арабидопсиса один из самых маленьких среди эукариот, содержит пять хромосом и состоит из 125 – 150 млн. п.о. В геноме закодировано менее 30 тыс. белков. A. thaliana – первый растительный организм, чей геном был полностью секвенирован, что делает данное растение удобным для генетических исследований и манипуляций с геномом. Кроме того, арабидопсис имеет очень короткий жизненный цикл, позволяющий быстро получать растения разных стадий развития и новые поколения растений. Еще одним существенным положительным свойством является то, что A. thaliana – самоопыляемое растение, что облегчает работу по выявлению гомо- и гетерозиготных организмов и является важным при трансформации растений [Weigel et al., 2009].