Введение к работе
Актуальность проблемы.
Эпидемиологическая ситуация по бруцеллезу в России на протяжении последних лет не имеет тенденции к улучшению. В ряде регионов Российской Федерации вследствие эпизоотического неблагополучия по бруцеллезу и нарушений санитарно-гигиенических норм и правил при ведении животноводства, бруцеллез остается широко распространенной инфекцией и основной причиной значительных экономических потерь в животноводческой отрасли сельского хозяйства, что усугубляется заболеванием людей, которое нередко приводит к потере трудоспособности и инвалидности.
Одним из основных направлений в борьбе с бруцеллезом является его своевременная и эффективная лабораторная диагностика. Современная лабораторная диагностика бруцеллеза основана на бактериологическом, биологическом, серологическом и аллергическом методах. Бактериологический и биологический методы являются наиболее достоверными при выяснении этиологии и путей передачи инфекции, однако, они небезопасны для персонала лабораторий, требуют затрат значительного количества труда и времени для завершения исследований (до 45 дней), нуждаются в высококачественных, дорогостоящих питательных средах и лабораторных животных. При этом положительные результаты бактериологического исследования могут достигать в ряде случаев лишь 30—80 % (Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996; Queipo-Ortuno М. I. et al., 1997).
Серологические методы лабораторного подтверждения бруцеллеза (им-муносуспензионные, иммуноферментные, иммунофлюоресцентные) являются в настоящее время основными. Однако, необходимо отметить, что выраженность различных иммунологических реакций, их сочетание и степень корреляции с тяжестью проявления и прогнозом развития болезни сугубо индивидуальны. При наличии выраженных иммунологических реакций на бруцеллез можно лишь ориентировочно судить об активности и тяжести инфекционного процесса и о возможности подтвердить этиологию заболевания (Пинигин А. Ф., 1960; Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996). Кроме того, серологические тесты обладают недостаточной специфичностью вследствие структурной общности антигенов бруцелл и ряда других грамотрицатель-ных микроорганизмов (Первушин Б. П., 1962; Желудков М. М., 1982; Желудков М. М., 1983; Соколова Е. Е. 1986; Кулаков Ю. К. с соавт., 1989; Кулаков Ю. К. с соавт., 1992; Corbel М. J., 1997), а иммунохимические методы обнаружения антигенов бруцелл обеспечивают также и невысокий уровень чувствительности — 104—105 м. к./мл и более (Чернышева М. И., Асланян Р. Г., 1975; Заревина Л. И. с соавт., 1986; Загоскина Т. Ю., 1990).
Внутрикожная аллергическая проба в отличие от серологических тестов является более специфичным и чувствительным методом диагностики бруцеллеза, но в 70—85 % случаев она становится положительной только к концу первого месяца заболевания, при этом ее постановка у инфицированного человека вызывает усиление сенсибилизации с возникновением общих и очаговых реакций (Кайтмазова Е. И., Чернышева М. И., 1972).
Принимая во внимание вышеизложенное, становится очевидной необходимость разработки новых методических подходов для лабораторной диагностики бруцеллеза, которые превосходили бы существующие методы по чувствительности, специфичности и быстроте выполнения.
Таким критериям наиболее полно соответствует метод молекулярной диагностики на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время диагностический подход с использованием метода ПЦР является наиболее эффективным средством инфекционного контроля, поскольку позволяет обнаруживать единичные клетки инфекционных агентов посредством заданного ферментативного увеличения специфичного участка генома микроорганизмов, что делает возможным исследование образцов разнообразного диагностического Материала в короткий промежуток времени (4— 6 часов).
Адаптация метода ПЦР для целей детекции и идентификации бруцелл осуществляется с начала 90-х Годов (Кулаков О. К. с соавт., 1992; Кули-ченко А. Н. с соавт., 1994; Fekete A. et al., 1990; Fekete A. et al., 1992; Herman L., De Rldder H., 1992; Baily G. et al., 1992; Bricker B. J., Hailing S. M., 1994) и продолжается до настоящего времени (Sifuentes-Rincon А. М. et al., 1997; Fox К. F. et al., 1998).
В последнее время рядом исследователей показана возможность успешного применения ПЦР для Подтверждения диагноза острого и хронического бруцеллеза у людей, с использованием в качестве диагностического материала периферической крови (Гаранина С. Б., 1996; Queipo-Ortuno М. I. et al., 1997), мочи и слюны (Гаранина С. Б., 1996), мононукЛеаров периферической крови (Matar G. М. et al., 1996; Morata P. et al., 1998).
Однако, вопросы молекулярной диагностики бруцеллеза с использованием метода ПЦР нельзя считать решенными в полной Мере. Доминирующее число исследований были проведены в области разработки праймеров и изучения потенциальных возможностей метода ПЦР для целей детекции и идентификации бруцелл на основе анализа препаратов ДНК, полученных из чистых культур бруцелл. При этом практически отсутствуют данные, касающиеся использования образцов сывороток крови, которые можно рассматривать в качестве диагностического материала, полученного от людей больных бруцеллезом или с подозрением на бруцеллез. Также во всестороннем изучении нуждаются вопросы молекулярной диагностики посредст-
вом ПЦР острой и хронической форм бруцеллезной инфекции у людей, поскольку исследования в этой области находятся на начальном этапе развития. Таким образом, вышеизложенное свидетельствует об актуальности и перспективности применения ПЦР в качестве метода молекулярной диагностики бруцеллеза и определяет необходимость разработки практических аспектов использования ПЦР для эффективной лабораторной диагностики бруцеллеза.
Цель работы.
Разработать и применить новые методические подходы для осуществления молекулярной диагностики бруцеллеза у людей посредством ПЦР с использованием в качестве диагностического материала образцов сывороток крови.
Задачи работы.
-
Определить оптимальный режим осуществления ПЦР с выбранными праймерами для обнаружения ДНК бруцелл.
-
Применить установленные параметры проведения ПЦР для тестирования препаратов ДНК эпидемиологически значимых видов бруцелл.
-
Разработать эффективные способы экстракции ДНК из бруцелл, присутствующих в модельном диагностическом материале (сыворотке крови), пригодные для осуществления молекулярной диагностики бруцеллеза посредством ПЦР.
-
Тестировать в ПЦР образцы нативных сывороток крови, полученных от людей, предположительно инфицированных вследствие профессионального контакта с больным бруцеллезом крупным рогатым скотом (крс).
-
Изучить возможность применения образцов сывороток крови для молекулярной диагностики острого и хронического бруцеллеза у человека.
-
Применить метод ПЦР с использованием в качестве диагностического материала образцов сывороток крови для молекулярной диагностики хронического и резидуального бруцеллеза у людей.
Научная новизна.
Впервые для молекулярной диагностики бруцеллеза посредством ПЦР разработаны новые и эффективные методы экстракции ДНК из бруцелл, в присутствии сыворотки крови. Методы основаны на щелочном разрушении клеточной стенки бруцелл, но без участия протеолитических ферментов, детергентов и депротеинизирующих агентов (фенол, хлороформ) или этапа нейтрализации кислотой.
Впервые для молекулярной диагностики бруцеллеза с помощью ПЦР в качестве исследуемого материала использованы образцы сывороток крови.
Впервые посредством тестирования в ПЦР образцов сывороток крови установлено, что степень инфицирования животноводов, работающих в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах крс, составляет 77,6 %.
Впервые с помощью ПЦР показана возможность обнаружения ДНК бруцелл в образцах сывороток крови, полученных от больного человека с острой формой бруцеллеза, и от больных людей с хронической формой.
Получены новые данные о информативности метода ПЦР и комплекса традиционных серологических тестов (реакция Хеддльсона, реакция Кум-бса, реакция агглютинации (Райта), реакция пассивной гемагглютинации) при хроническом бруцеллезе у людей.
Практическая значимость.
-
Усовершенствована лабораторная диагностика бруцеллеза у людей.
-
Разработанные нами методы экстракции ДНК посредством щелочного лизиса в Присутствии 0,3 М NaCl и щелочного лизиса-осаждения применяются: в клинико-лабораторной диагностике бруцеллеза, осуществляемой отделом зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ) в сотрудничестве с инфекционной больницей г. Иркутска; в исследованиях, проводимых в отделе микробиологии чумы с группой подготовки кадров, отделе зоонозных инфекций и эпидемиологическом отделе Иркутского НИПЧИ, а также используются в Молекулярной диагностике различных бактериальных и вирусных инфекций, выполняемой на базе отдела микробиологии чумы с группой подготовки кадров Иркутского НИПЧИ.
3. Составлены «Методические рекомендации по детекции бруцелл в
различном биологическом материале с помощью полимеразной цепной ре
акции», утвержденные Первым заместителем Министра здравоохранения
России Г. Г. Онищенко (03.02.97).
4. Решением Российского агентства по патентам и товарным знакам
выдан патент на изобретение «Способ выделения ДНК из микроорганиз
мов и клеток животных, пригодной для постановки полимеразной цепной
реакции» № 2129610 от 27 апреля 1999 г. (приоритет от 04.04.97).
Апробация работы.
Материалы диссертации представлены: на юбилейной Научно-практической конференции, посвященной 75-летию Омского научно-исследовательского института природно-очаговых инфекций (Омск, 1996 г.); на научной конференции по проблемам зоонозных и других инфекционных болезней (Ставрополь, 1996 г.); на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); на научных конференциях Иркутского Научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (1996, 1997 гг.); на конференции, посвященной 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области (Иркутск, 1997 г.).
Публикации.
Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.
Положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Для высокочувствительного и специфичного обнаружения ДНК бруцелл посредством ПЦР с выбранными праймерами Brul и Вш2 оптимален экспериментально установленный режим осуществления реакции.
-
Применение праймеров Brul и Bru2 позволяет осуществлять молекулярную детекцию ДНК бруцелл эпидемиологически значимых видов.
3. Методы экстракции ДНК, основанные на использовании щелочи для
лизиса клеточной стенки бруцелл, являются эффективными и доступными
способами получения из модельного диагностического материала препара
тов ДНК бруцелл, пригодных для исследования в ПЦР.
-
В сравнении с традиционными иммунологическими тестами применение ПЦР позволяет с большей информативностью выявлять инфицированных животноводов из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крс.
-
Для молекулярной диагностики хронического бруцеллеза у человека в качестве диагностического Материала пригодно использование образцов сывороток крови.
-
Исследование образцов сывороток крови, полученных от людей с хроническим бруцеллезом с помощью ПЦР и комплекса серологических тестов (реакция Хеддльсона, реакция Кумбса, реакция агглютинации (Райта), реакция пассивной гемагглютинации) обеспечивает выявление одинакового количества позитивных и негативных образцов (77,8 % и 22,2 % соответственно), но при этом в обоих методах диагностики имеются расхождения в части позитивных результатов (28,5 %).
Объем и структура диссертации.