Введение к работе
Актуальность темы.
Род Salmonella включает более 2200 различных сероваров, большинство представителей которых являются патогенными для человека или животных или животных и человека. Сальмонеллезы в настоящее время признаны серьезной проблемой здравоохранения в мире, что связано с значительным ростом заболеваемости этими инфекциями во многих странах. Так, только в США ежегодно регистрируется более 3 млн. заболеваний сальмонеллезами людей, причем эти данные являются заниженными из-за недостаточно полной их регистрации. По имеющимся данным, в нашей стране также наблюдается выраженная тенденция к увеличению числа заболеваний этими инфекциями (примерно на 30-40% ежегодно) (Покровский В.И. и др..1989;Кондрусев А. Н., 1990; Доклад комитета экспертов ВОЗ, 1991;Chalker R., Blazer A., 1989;Chatfield S. et al., 1994).
Эта проблема тесно связана с высоким уровнем заболеваемости сельскохозяйственных животных в связи с тем, что разные серовары сальмонелл вызывают заболевания как у животных, так и у людей (зооантропонозы). Большой материальный ущерб наносят сальмонеллезы в животноводческих хозяйствах Российской Федерации, в которых возбудителями инфекций являются S. typhimurlum, S:dublin и S. ente-ritidls (Черкасский Б. Л. и др., 1995; Черкасский Б. Л. .Рожнова С. Ш., 1995; Доклад комитета экспертов ВОЗ, 1991;Сергевнин В. И. и др.,1991;Rodrlque D.etal.,1990; De Louvolce J.,1993; Rubino S. et al.,1993).
Очевидно, что борьба с сальмонеллезами у животных может привести и к снижению заболеваемости этими инфекциями у людей (общими для человека и животных). Для профилактики кишечных инфекций, вызываемых различными видами энтеробактерий, в частности сальмо-
- г -неллами. у животных и у человека наряду с санитарно-гигиеническими мероприятиями важное значение придается специфической профилактике этих заболеваний - вакцинации (Доклад комитета экспертов ВОЗ,1991; Chatfield S. et al., 1994). Из существующих или разрабатывающихся в настоящее время различных типов вакцинных препаратов против этих инфекций живые сальмонеллезные вакцины та основе аттенуированных мутантов наиболее эффективно используются на практике, обеспечивая создание выраженного как гуморального, так и клеточного иммунитета в организме хозяина .(Robertson R.et al.. 1983;Hormaeche С. et al., 1992;Curtlss R. et al., 1993).
Известно, что патогенность бактерий является сложным биологическим феноменом, проявляющимся вследствие взаимодействия как специфических факторов патогенности, так и различных компонентов бактериальных клеток, играющих существенную роль в их жизнедеятельности. Для получения эффективных вакцинных штаммов необходимы точные знания факторов, определяющих развитие инфекционного процесса при сальмонеллезах и их генетического контроля, которые в отношении этих возбудителей изучены недостаточно. Так, не выяснена до конца роль плазмид в проявлении сальмонеллами вирулентных свойств, не изучен в полной мере генетический контроль синтеза энтеротоксина.
Необходимо, также, подчеркнуть, что в настоящее время имеются лишь отдельные сообщения о значении компонентов жизненно важных для бактерий систем (наружная мембрана, РНК-полимераза, сгр, суа белки и другие (Vaara М., 1992; Botsford J., Harman J.,1992; Llnde К. et al., 1990) для экспрессии вирулентности у сальмонелл. Проведение исследований, направленных на выявление такого типа факторов и изучение их роли в вирулентности патогенных бактерий
может иметь как теоретическое, так и практическое значение в плане разработки эффективных методов получения потенциальных вакцинных штаммов сальмонелл.
Следует отметить, что для оценки значения ряда структур в различных клеточных процессах удобным инструментом являются антибиотики с определенным механизмом действия, позволяющие получать мутанты патогенных бактерий, включая и сальмонеллы, несущие мутации в генах, кодирующих синтез соответствующих структур и исследовать их влияние на вирулентность.
В связи с вышесказанным, целью настоящего исследования являлось изучение влияния мутаций в генах, детерминирующих резистентность к некоторым антибиотикам и синтез отдельных факторов пато-генности сальмонелл, на их вирулентность и разработка принципов аттенуации патогенных бактерий.
Задачи исследования:
-
Получить мутанты S. typhimurium, S.dublin, S. enterltldis. S abortus ovis, устойчивые к антибиотикам, действующим на клеточную оболочку бактерий (полимиксин, бицикломицин,ЛИБ-71) и связывающимися с рибосомальными белками (спектиномицин, стрептомицин, неамин) и исследовать их свойства.
-
Определить локализацию мутаций, детерминирующих снижение вирулентности у указанных мутантов, на хромосоме сальмонелл.
-
Изучить действие мутаций, приводящих к нарушению синтеза рибосомальных белков, на точность трансляции генетического материала.
-
Исследовать влияние мутаций, сообщающих устойчивость к спектиномицину, неамину и стрептомицину, на вирулентность штаммов патогенных бактерий: Shigella flexneri. Yersinia pseudotuberculo-
- 4 -sis, Listeria monocytogenes. Legionella pneumophila, Francisella tularensis.
-
Изучить генетический контроль продукции термолабильного эн-теротоксина некоторыми штаммами сальмонелл и оценить значение этого признака для вирулентности и иммуногенности этих бактерий.
-
Исследовать молекулярно-генетические характеристики плазмид вирулентности штаммов S.enteritidis, S.typhimurium и S.dublin, получить производные с вставками транспозона в гены, существенные для проявления ими патогенных свойств.
-
Сконструировать штаммы S.typhimurium, S.dublin,S.enteriti-dis. S.abortus ovis. несущие мутации в различных генах, связанных с вирулентностью этих бактерий и'исследовать их свойства на разных моделях инфекции.
-
Изучить некоторые полученные аттенуированные штаммы сальмонелл в качестве живых вакцин в опытах на различных сельскохозяйственных животных.
Научная новизна
В результате проведенной работы выявлена у S typhimurium, S.dublin, S.enteritidis. S.abortus ovis мутация, сообщающая устойчивость к антибиотику бицикломицину, повреждающему клеточную стенку, приводящая к значительному снижению вирулентности мутантов для мышей на различных моделях. Мутация картирована на хромосоме S. typhimurium у mal Е гена.
Установлено, что неаминрезистентные мутанты исследованных сероваров сальмонелл в зависимости от чувствительности к стрептомицину характеризовались наличием различных мутаций, снижающих их
вирулентность: чувствительные к этому антибиотику несли мутацию пеа А, устойчивые к умеренным концентрациям стрептомицина - пеа и rpsL, к высоким концентрациям - пеа В и rps L. Мутации, приводящие к появлению устойчивости к этим антибиотикам, картированы на хромосоме сальмонелл в rps L - rps Е области.
Установлена зависимость между действием выявленных нами мутаций резистентности к спектиномицину, стрептомицину и неамину на активность амбер супрессора и влиянием на вирулентность: мутации, сообщающие устойчивость к спектиномицину и не влияющие на точность считывания генетической информации, не изменяли вирулентности сальмонелл, тогда как мутации, детерминирующие устойчивость к стрептомицину и неамину и ограничивающие действие амбер супрессора, приводили к снижению вирулентности сальмонелл. Показано общебиологическое значение выявленной закономерности на мутантах такого типа других видов патогенных бактерий - Shigella flexnerl. Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes. Legionella pneumophila, Francisella tularensls.
Впервые показано важное значение для вирулентности S.enteri-tidis плазмиды молекулярной массой 65 МД. Идентифицирован 6.8 кб Eco RI-Hind III фрагмент плазмиды, содержащий гены, связанные с размножением этих бактерий в РЭС. Установлена у части штаммов S.enteritidis. выделенных от больных, птиц и из окружающей среды, интеграция плазмиды молекулярной массой 36 МД в хромосому этих бактерий.
Впервые показано, что плазмида S. typhimurium молекулярной массой 54 МД контролирует синтез термолабильного энтеротоксина, сходного по свойствам с термолабильным энтеротоксином Е.сої і и V.cholerae. Идентифицирован 6, 9 кб Bam HI - Eco RI фрагмент плаз-
- 6 -миды, кодирующий синтез термолабильного энтеротоксина сальмонелл. На модели сальмонелл разработаны способы аттенуации бактерий, основанные на использовании или двух мутаций отдельно, снижающих вирулентность и сообщающих устойчивость к неамину и стрептомицину, бицикломицину и полимиксину или в сочетании с использованием сероварспецифических плазмид с вставкой в их область, связанную с вирулентностью, транспозонов. Получены аттенуированные мутанты сальмонелл различных сероваров. L.pneumophila. L.monocytogenes, Y.pseudotuberculosis, которые характеризовались высокой иммуно-генностью, безопасностью при тестировании,на лабораторных животных и имели маркеры для их дифференциации от других культур.
Практическая значимость работы
С помощью разработанных методов аттенуации патогенных бактерий получены аттенуированные штаммы S. typhimurium, S.dublin. S.enteritidis, S. abortus ovis, обладающие высокой иммуноген-ностью, безопасные и стабильные в отношении уровня остаточной вирулентности.
Полученные аттенуированные генетически безопасные мутанты сальмонелл были использованы в качестве штаммов-носителей реком-бинантных плазмид в экспериментах, проведенных в Всероссийском центре прикладной микробиологии.
Получены с помощью одного из разработанных способов аттенуированные штаммы S.dublin 13-20 NS (против сальмонеллеза телят) и S.abortus ovis 17НС (против аборта овец), устойчивые к антибиотикам неамину и стрептомицину (умеренные концентрации). Живые вакцины из штаммов S.dublin 13-20 NS и S.abortus ovis 17НС были де-
- 7 -тально исследованы в опытах на сельскохозяйственных животных и показали стабильность остаточной вирулентности, высокую иммуно-генность, безопасность использования. Широкие испытания живых вакцин из полученных штаммов сальмонелл в неблагополучных по сальмонеллезам хозяйствах выявили их высокую эффективность. Разработана и утверждена научно-техническая документация на производство живых вакцин из штаммов S.dublln 13-20 HS и S.abortus ovls 17НС. В настоящее время эти вакцинные штаммы широко используются в хозяйствах Казахстана для профилактики сальмонеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных.
Утверждены методические рекомендации о применении вакцин из указанных штаммов для профилактики сальмонеллеза у животных.
Получено 5 авторских свидетельств на изобретения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Современные проблемы профилактики зоонозных болезней и пути их решения", г.Гродно, 1987 г.; на X Мечниковской конференции молодых ученых-медиков "Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии ". г.Одесса, 1987 г.; на 2-ой Всесоюзной конференции " Бактериальные токсины", г. Юрмала, 1989 г.; на VI Всероссийском съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов, паразитологов им.И. И.Мечникова, г.Горький, 1991г.; на проблемной комиссии НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи "Генетика и молекулярная биология бактерий", 1991 г.; на Международном симпозиуме " Пищевые зоонозы - сальмонеллезы,кампилобакте-риоз.иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики", г.Москва, 1995 г.; на 5 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезным инфекциям, г.Москва, 1990 г.; на 1 конгрессе Международного общества по эндотоксинам, США (Сан-Дй-
- 8 -его), 1990 г.; на Международной конференции " Медицинская биотех- ' нология, иммунизация и СПИД", Ленинград, 1991 г.; на совещании рабочей группы экспертов ВОЗ по проблеме иммунизации животных против сальмонеллезных инфекций, Германия (Йена), 1993 г.; на 2 конференции Международного общества по эндотоксинам, Вена, 1992 г.; на Международной конференции " Вакцины против кишечных инфекций", Англия (Кембридж), 1992 г.; на XXIV национальном конгрессе по микробиологии, Мексика (Гвадалахара), .1993 г.;на 3 конференции Международного общества по эндотоксинам, Хельсинки, 1994 г.; на 3 Международной конференции Кембриджского института "Вакцины:новые технологии и применения", США (Александрия), 1995 г.; на 4 Между- . народной конференции Кембриджского института "Вакцины: новые технологии и применения", США (Мак Лин), 1996 г.; на 7 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (1995г., Вена, Австрия), на юбилейных чтениях, посвященных 90-летию со дня рождения В. Д. Тимакова. в НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи. 1995 г.; на конференции Отдела медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН. 1996 г.
Публикации. По теме диссертацииопубликована 31 печатная работа, утверждены 1 методические рекомендации, получено 5 авторских свидетельств.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введе-ниє, 3 главы обзора литературы, 9 глав результатов собственных исследований, обсуждение. Отдельная глава включает описание методов исследования. Заключают диссертацию выводы и список цитированной литературы, содержащий 28 наименований отечественных и 193 зарубежных работ. Работа изложена на 302 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 57 таблицами.