Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
Глава 1. Иммуногомеостатическая роль кишечной микробиоты 12
Глава 2. Микробиологические факторы канцерогенеза и противоопухолевой защиты 21
Глава 3. Пробиотики как средство коррекции микробиологических и иммунных расстройств и предотвращения послеоперационных инфекционных осложнений у больных колоректальным раком 25
Глава 4. Бион 3 – современный пробиотически-мультивитаминный комплекс с доказанной иммунотропной активностью 32
Материалы и методы исследований .41
1. Общая характеристика больных 41
2. Характеристика исследуемого пробиотически-мультивитаминного комплекса .42
3. Методы исследования
3.1. Методы бактериологического исследования .43
3.2. Методы иммунологического исследования 48
3.3. Методы статистической обработки результатов исследования .49
Результаты собственных исследований 50
Глава 1. Влияние Биона 3 на состояние кишечной микрофлоры у больных колоректальным раком в периоперационном периоде 50
Глава 2. Влияние Биона 3 на системные показатели клеточного иммунитета у больных колоректальным раком в периоперационном периоде 62
Глава 3. Действие Биона 3 на частоту послеоперационных инфекционных осложнений у больных колоректальным раком .72
Заключение 74
Выводы практические рекомендации 82
Список литературы
- Микробиологические факторы канцерогенеза и противоопухолевой защиты
- Характеристика исследуемого пробиотически-мультивитаминного комплекса
- Методы иммунологического исследования
- Влияние Биона 3 на системные показатели клеточного иммунитета у больных колоректальным раком в периоперационном периоде
Микробиологические факторы канцерогенеза и противоопухолевой защиты
Исходя из вышесказанного, становиться понятным, почему резидентные бактерии эволюционировали в направлении не только оптимального потребления жизненно важных ресурсов, но и обеспечения здоровья и долгожительства «хозяина» [8]. По образному выражению О.В.Калюжина, животные, включая человека, заключили со многими из колонизирующих их микробов не только пакт о ненападении, но и договор о взаимопомощи на случай внешних угроз, в том числе исходящих от патогенов [8,13]. Это и явилось филогенетической основой формирования механизмов, благодаря которым симбионты/комменсалы поддерживают противоинфекционную защиту «хозяина». Массовая колонизация ЖКТ микробами была бы невозможной без толерантности со стороны иммунной системы макроорганизма. Совместная эволюция микро- и макроорганизмов привела к возникновению сложных многоуровневых механизмов сохранения и пополнения индигенной микробиоты, которые в дальнейшем обусловили способность кишечной микробиоты защищать «хозяина» от чрезмерных реакций в ответ на собственные и чужеродные (в том числе пищевые) субстанции [8].
В конечном итоге сформировалась система бактериальных сигналов и их восприятия, за счет которых кишечная микробиота поддерживает иммунный гомеостаз человека, причем не только в ЖКТ, но и в организме в целом.
Традиционно филогенез иммунной системы животных, в частности ее адаптивной составляющей, рассматривался в свете длительного эволюционного давления со стороны инфекционных агентов. В этой связи долгое время доминировало мнение, что именно под влиянием постоянных инфекционных угроз возникла сложная система генетической вариабельности антигенсвязывающих участков Т-клеточных рецепторов и иммуноглобулинов, обладающих неограниченными способностями распознавать практически любого нового возбудителя. Как один из аргументов приводилась филогенетическая временная взаимосвязь формирования адаптивного иммунитета с появлением челюстей у рыб [42]. Возникновение челюстей дало животным преимущества в поглощении пищи, позволило увеличить им свои размеры и продлить время жизни, но одновременно повысило риск травматизации и инфицирования, в том числе повторного, пищеварительного тракта. Это и считалось основным толчком развития адаптивного иммунитета и иммунной памяти [76].
Вместе с тем в последние годы формулируются альтернативные теории о движущих силах эволюции адаптивного иммунитета [10]. Так, не менее логичными и обоснованными представляются аргументы о том, что комменсалы оказывают еще большее эволюционное давление на иммунную систему, чем возбудители инфекций, и тем самым играют более значимую роль в филогенезе этой системы [45, 69].
В контексте биогенетического закона, в соответствии с которым онтогенез представляет собой краткое повторение филогенеза, примечательны данные о том, что неонатальное и постнатальное заселение микробами ЖКТ человека определяет характер онтогенетического развития мукозального и системного иммунитета, а также эффективность и адекватность противоинфекционного ответа [98].
Если защитная роль кишечной микробиоты непосредственно в ЖКТ, связанная с продукцией бактериоцинов, подкислением окружающей среды, образованием биопленки, конкуренцией c патогенами за питательные и ростовые факторы, т.е. колонизационная резистентность, уже давно не вызывает сомнений [1, 62, 84, 97], то регуляция иммунных реакций за пределами пищеварительного тракта, в частности в дыхательных путях, доказана относительно недавно.
Установлены основные рецепторы врожденного иммунитета, передающие в макроорганизм иммунорегулирующие сигналы от кишечных бактерий. В первую очередь это Toll-подобные рецепторы (TLR) (рис. 1) [8]. TLR2, расположенные на плазмалемме, являются сенсорами липопротеинов и липотейхоевых кислот клеточных стенок бактерий. Поверхностные TLR4/MD2 и TLR5 распознают соответственно липополисахариды клеточной стенки и флагеллин жгутиков грамотрицательных бактерий, в частности Escherichia coli. Эндосомальные TLR9 проводят сигналы от неметилированных СpG последовательностей бактериальной ДНК. Детально описаны внутриклеточные события, происходящие после взаимодействия указанных лигандов и соответствующих TLR и ведущие к активации факторов транскрипции и выработке ключевых цитокинов, обеспечивающих инициацию, стимуляцию и регуляцию иммунных реакций. Способность кишечных бактерий активировать противовирусный ответ в верхних отделах дыхательных путей и роль TLR в распознании комменсал-ассоциированных молекулярных паттернов подтверждены в экспериментах in vivo. В частности продемонстрировано, что кишечные бактерии поддерживают действенный иммунный ответ против вируса гриппа, в том числе потенцируют созревание вирус-специфических CD4+- и СВ8+-Т-клеток у мышей. Вызванное пероральным приемом антибиотиков истощение микробиоты ЖКТ существенно снижало устойчивость к интраназальному инфицированию вирусом гриппа А и увеличивало летальность зараженных животных. Это было обусловлено угнетением функции и миграции дендритных клеток в дыхательных путях, а также подавлением Т- и В-клеточных иммунных реакций. Особого внимания заслуживает то, что в условиях этой мышиной модели in vivo ректальное введение лигандов TLR восстанавливало подавленный антибиотиками противовирусный иммунный ответ и резистентность к интраназальному заражению вирусом гриппа А [64]. Это поддерживает концепцию иммунной солидарности слизистых и тезис о том, что стимулирующие противоинфекционную защиту сигналы, полученные в нижних отделах ЖКТ, передаются в слизистые оболочки других биотопов, включая респираторный тракт.
Характеристика исследуемого пробиотически-мультивитаминного комплекса
Известно нескольких поколений пробиотических препаратов. Если первой генерацией являются монокомпонентные про- и пребиотики, то последнее поколение – это комплексные препараты, которые в своем составе одновременно содержат несколько симбионтных штаммов и пребиотические компоненты. По мнению ведущих специалистов, для достижения выраженного микробиота-корригирующего и иммунотропного действия более рациональным является выбор комплексных препаратов последнего поколения [13].
Разработчики пробиотических препаратов и продуктов не просто выбирают известные по данным литературы штаммы бактерий и создают их умозрительные комбинации, но и проводят тщательный поиск наиболее безопасных и действенных штаммов, обладающих высокой антагонистической активностью по отношению к основным патогенам ЖКТ, устойчивостью к действию соляной кислоты, пищеварительных ферментов и желчных кислот. В случае использования симбиотиков, т.е. комплексов пробиотических штаммов, необходимо учитывать возможность синергизма в реализации одних биологических эффектов и антагонизма – других, что требует дополнительных специальных исследований [39].
Примером эффективного сочетания пробиотических штаммов является комбинация Lactobacillus gasseri PA 16/8, Bifidobacterium bifidum MF 20/5 и Bifidobacterium longum SP 07/3 в составе Биона 3. Эти штаммы являются симбионтами не только по отношению к макроорганизму, но и друг к другу, при этом они действует во многих отношениях синергично. Например, в тест-системах in vitro установлено взаимопотенцируещее действие указанных пробиотических бактерий по угнетению роста патогенов ЖКТ [13]. Выбирая источник симбионтных бактерий, в тех ситуациях, когда разработчики нацелены на обеспечение длительной колонизации вводимыми бактериями ЖКТ, следует отдавать предпочтение донорским человеческим штаммам в сравнении с таковыми молочнокислого происхождения, многие из которых не способны к длительному персистированию в организме человека.
Важным условием достижения действенной иммунной защиты от различных патогенов является поступление в организм достаточного количества жизненно важных витаминов и минералов. В этой связи включение в состав пробиотических препаратов витаминов (А, С, Е и др.) и минералов (цинк, селен, железо и др.) обеспечивает необходимый фундамент для адекватного противоинфекционного иммунитета, в том числе для реализации иммунокорригирующего действия симбионтных бактерий. Сочетанное применение живых симбионтов/комменсалов и микронутриентов является рациональным и в свете убедительных данных о том, что нормализация количественных и качественных показателей микробиоты увеличивает биодоступность минералов и витаминов [13]. Помимо рационального выбора компонентов для пробиотически мультивитаминного препарата или продукта, необходимо обеспечить максимальную биодоступность его составляющих и защиту живых симбионтных бактерий от агрессивных факторов ЖКТ. Перед разработчиками встают вопросы сохранения жизнеспособности пробиотических штаммов не только при прохождения ими желудка и верхних отделов тонкой кишки, но и на этапах производства и хранения готовых лекарственных форм [66]. Примером успешной работы по созданию комплексного пробиотика с иммунотропной активностью, в которой учтены все вышеперечисленные аспекты, может служить разработка компанией Merck KGaA (Германия) препарата Биона 3. Бион 3 содержит комбинацию трех тщательно подобранных штаммов симбионтных бактерий, запатентованных под коммерческим названием Tribion Harmonis: Bifidobacterium bifidum MF 20/5, Bifidobacterium longum SP 07/3, Lactobacillus gasseri PA 16/8. Кроме того, в состав препарата входят пребиотик инулин, 12 витаминов и 12 микроэлементов, необходимые для полноценного функционирования иммунной системы.
Помимо рациональной комбинации симбионтных штаммов и комплексного состава, важным слагаемым эффективности Биона 3 является запатентованная методика таблетирования. Оригинальная трехслойная таблетка с технологией «delayed release» (замедленное высвобождение), покрытая защитной оболочкой, гарантирует одновременно доставку пробиотических штаммов живыми в нижние отделы ЖКТ и высокую биодоступность других компонентов препарата.
Все 3 штамма симбионтных бактерий, включенные в состав Биона 3, были подвергнуты полноценному изучению безопасности с учетом современных международных требований, в частности в соответствии с сформулированным по инициативе European Food Safety Authority (EFSA) руководства Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). Доказано, что B. longum SP 07/3 и B. bifidum MF 20/5 не обладают устойчивостью к антибиотикам (табл. 3).
Методы иммунологического исследования
Как показали наши исследования, у больных КРР имелись значительные микроэкологические изменения в толстой кишке, обусловленные или, по крайней мере, связанные с основным заболеванием. Эти изменения, как правило, выражались в значительном сокращении симбиотической молочнокислой микрофлоры и кишечных палочек с полноценными биологическими свойствами. В тоже время в кишечном микробиоценозе отмечалась экспансия условно-патогенных цитратассимилирующих энтеробактерий, штаммов золотистого стафилококка, штаммов кишечной палочки и энтерококка с гемолитическими свойствами и грибов Candida spp.
Указанные дисбиотические изменения отмечались у большинства больных уже в предоперационном периоде и под влиянием операции и периоперационной антибиотикопрофилактики усугублялись в дальнейшем.
У большинства больных КРР при поступлении в стационар абсолютное и относительное содержание лимфоцитов и их ключевых популяций в периферической крови и фагоцитарная активность нейтрофилов были в пределах нормальных референсных значений. Однако в раннем послеоперационном периоде отмечено существенное падение числа NK-клеток, Т-клеток и их субпопуляций, а также функциональной активности нейтрофилов. Через 1 месяц после хирургического вмешательства полного восстановления изменённых показателей не происходило.
Вполне ожидаемой явилась выявленная нами способность пробиотически-мультивитаминного комплекса корригировать расстройства кишечной микробиоты. Бион 3 увеличивал содержание бифидобактерий и лактобацилл в фекалиях, при этом уменьшая число представителей условно-патогенной микрофлоры. Это можно расценить как положительный прогностический фактор в отношении не только противоинфекционной защиты, но и исхода основного заболевания.
Курсовое применение Биона 3 до и после хирургического вмешательства в целом снижало степень падения количественных показателей клеточного иммунитета в раннем послеоперационном периоде, а в позднем послеоперационном периоде способствовало нормализации измененных иммунологических показателей. В конечном итоге в периферической крови больных КРР на фоне приема Биона 3 в большей степени, чем в контроле, увеличивалось абсолютное число CD3+-, CD3+CD4+-и CD3+CD8+-клеток, а средний уровень CD3-CD16+CD56+-лимфоцитов был выше, чем 0,25106 клеток/мл, что в совокупности является положительным фактором прогноза течения основного заболевания [80, 90].
Важно то, что отмеченная выше способность Биона 3 нивелировать у больных КРР микробиологические и иммунные нарушения, вызванные как основным заболеванием, так и проводимым лечением, коррелировала с эффективностью пробиотически-мультивитаминного комплекса в качестве средства профилактики послеоперационных инфекционных осложнений.
В настоящее время за рубежом общепринят термин для обозначения инфекционных осложнений в зоне оперативного вмешательства – «инфекции области хирургического вмешательства» (ИОХВ) (в исходном англоязычном варианте – Surgical Site Infections).
Он был введен в практику Национальной системы наблюдения за нозокомиальными инфекциями Центров по контролю и профилактике заболеваний США (NNIS CDC) в 1992 году, тогда же были разработаны классификация и определяющие критерии ИОХВ [26].
Под ИОХВ понимают инфекцию области хирургического разреза, органа или полости, возникающую в течение первых 30 дней послеоперационного периода (при наличии имплантанта – до года). В зависимости от глубины поражения и вовлечения анатомических структур выделяют: - поверхностные ИОХВ разреза (кожа, подкожная клетчатка); - глубокие ИОХВ разреза (фасция, мышцы); - ИОХВ органа/полости.
Несмотря на совершенствование мер инфекционного контроля, проблема ИОХВ продолжает оставаться актуальной вплоть до настоящего времени.
Развитие инфекции значимо замедляет заживление хирургической раны в послеоперационном периоде, ухудшает состояние пациентов и прогноз, а также повышает нагрузку на систему здравоохранения и финансовые затраты. Возникновение ИОХВ удлиняет сроки госпитализации в среднем на 7-10 суток и увеличивает затраты на лечение на 10-20% [26].
У пациентов с ИОХВ на 60% повышается вероятность пребывания в блоке интенсивной терапии, а при развитии инфекции после выписки из стационара в 5 раз увеличивается вероятность повторной госпитализации ИОХВ повышают относительный риск развития летального исхода у хирургических пациентов в среднем 2,2 раза. Вклад данной патологии в структуру послеоперационной летальности достигает 75-77%. Нельзя не отметить, что, хотя на долю ИОХВ органа/полости приходится только треть от всех ИОХВ, они являются причиной 93% летальных исходов, а также приводят к значительно более высокой стоимости курса терапии [26].
В настоящее время самым распространенным методом профилактики ИОХВ является периоперационная антибиотикопрофилактика (ПАП) [27].
Однако, как показало время, применение только одних антибактериальных препаратов не является оптимальным средством профилактики ИОХВ у больных хирургической патологией. По данным NNIS CDC, ИОХВ продолжают оставаться вторыми по частоте (20%) и третьими по затратам среди всех нозокомиальных инфекций и составляют 38-40% случаев инфекции у хирургических пациентов. Частота возникновения ИОХВ варьируется, по данным зарубежных авторов, от 5 до 25%, в зависимости от вида оперативного вмешательства и состояния пациента, причем около 2/3 из них локализуются в области разреза и лишь 1/3 затрагивает орган или полость в области хирургического доступа [26].
Если рассматривать проблему ИОХВ в отношении онкологического стационара, то здесь ситуация еще более критическая, и связано это как с самими опухолевыми заболеваниями, так и с методами их лечения. В 80-е годы прошлого века бактериальная инфекция являлась непосредственной причиной смерти 87% больных лимфомами и 93% больных солидными опухолями [28].
Можно выделить несколько факторов, предрасполагающих к более частому развитию инфекционных процессов у онкологических больных, и хотя большинство из них связано с влиянием злокачественной опухоли на организм, отчасти они обусловлены и проводимым лечением. Так, хирургическое лечение, химиотерапия и облучение влияют на состояние естественных анатомических барьеров, обеспечивающих устойчивость организма к инвазии инфекционных агентов из внешней среды или изменению патогенности представителей микрофлоры, постоянно обитающих на коже и слизистых оболочках. Следует добавить, что химиотерапия и облучение угнетают иммунную защиту организма больного [28].
Влияние Биона 3 на системные показатели клеточного иммунитета у больных колоректальным раком в периоперационном периоде
Также выявлены отличия между группами по динамике содержания CD3+CD4+-клеток в периферической крови (табл. 13).
В контрольной группе в раннем послеоперационном периоде наблюдалось значительное падение абсолютного числа этих клеток (-43%). Среднее значение этого показателя выходило за нижнюю границу нормальных значений. В это же время у больных, получавших Бион 3, снижение содержания CD3+CD4+-лимфоцитов было менее выраженным (-22%), при этом и абсолютное, и относительное число этих клеток было достоверно выше, чем в контроле. В позднем послеоперационном периоде в группе сравнения содержание CD3+CD4+-лимфоцитов возрастало, но их абсолютное число оставалось на более низком уровне, чем при поступлении в стационар. В основной группе выявлено полное восстановление этого показателя до предоперационного уровня. Динамика абсолютного содержания CD3+CD8+-лимфоцитов в периферической крови у больных обеих групп в целом была однотипной: снижение числа этих клеток, наблюдавшееся в раннем послеоперационном периоде, через 1 месяц после хирургического вмешательства сменялось ростом этого показателя, который, тем не менее, оставался на более низком уровне, чем при поступлении (табл. 14).
В основной группе, несмотря на выраженное падение абсолютного числа CD3+CD8+-клеток в раннем послеоперационном периоде (-60% в сравнении с -53% в группе сравнения), через 1 месяц после хирургического вмешательства их содержание было достоверно выше такового в контрольной группе. Отличительной особенностью группы сравнения был нисходящий тренд относительного количества CD3+CD8+-лимфоцитов, сохраняющийся и в позднем послеоперационном периоде, тогда как в основной группе больных, получавших Бион 3, через 1 месяц после резекции опухоли этот тренд менял свой вектор.
У больных контрольной группы это соотношение постепенно возрастало в течение всего послеоперационного периода. У пациентов, принимавших Бион 3, иммунорегуляторный индекс через 3-5 дней после хирургического вмешательства резко возрастал (+105%), а через 1 месяц несколько снижался, оставаясь при этом на уровне, превышающем исходные показатели. В позднем послеоперационном периоде различий этого показателя между группами не выявлено.
Соотношение субпопуляций лимфоцитов меняется при многих, в том числе онкологических, заболеваниях и в ряде случаев может служить независимым критерием как прогноза течения этих заболеваний, так и эффективности проводимого лечения. В частности, доказано, что соотношение CD3+CD4+/CD3+CD8+ в предоперационном периоде может использоваться как прогностический критерий у больных колоректальным раком: при его высоком уровне показатели выживаемости больных существенно выше [90]. В этой связи заслуживает внимания факт значительного увеличения иммунорегуляторного индекса в раннем послеоперационном периоде у больных, принимавших Бион 3.
Помимо Т-лимфоцитов, существенное значение как для противоинфекционной защиты, так и для реализации противоопухолевого ответа, имеет популяция естественных киллерных (NK) клеток, характеризующихся иммунофенотипом CD3-CD16+CD56+. Известно, что их высокий уровень в предоперационном периоде ассоциирован с большей выживаемостью/продолжительностью жизни больных колоректальным раком [90]. При поступлении у большинства обследованных больных абсолютное и относительное число CD3-CD16+CD56+-лимфоцитов в периферической крови было в пределах нормальных референсных значений (табл. 16).
В обеих группах выявлены восходящий тренд относительного содержания NK-клеток в раннем послеоперационном периоде и возврат этого показателя на исходный уровень через 1 месяц после резекции опухоли. У больных контрольной группы в раннем послеоперационном периоде абсолютное количество CD3-CD16+CD56+-лимфоцитов существенно снижалось, тогда как в основной группе отмечена лишь тенденция к его снижению. В позднем послеоперационном периоде абсолютное число NK-клеток возрастало в обеих группах, однако у больных, получавших Бион 3, восстановление количества этих клеток было более полным. Подчеркнем, что среднее абсолютное число CD3-CD16+CD56+-лимфоцитов у пациентов контрольной группы через 1 месяц после операции было ниже условного порогового значения (0,25106 клеток/мл), что считается неблагоприятным прогностическим фактором [ 80]. У больных, принимавших Бион 3, в позднем послеоперационном периоде среднее количество NK-клеток было несколько выше указанного порогового уровня. Роль естественных киллерных Т-клеток (NKT) с иммунофенотипом CD3+CD16+CD56+ при опухолевых заболеваниях противоречива. Считается, что в функциональном отношении существуют, как минимум, две субпопуляции NKT-клеток, одна из которых стимулирует иммунный, в том числе противоопухолевый, ответ, другая – подавляет его. Тем не менее, в целом повышенное число CD3+CD16+CD56+-клеток может рассматриваться как благоприятный прогностический фактор при колоректальном раке, а низкое содержание этих клеток в печени ассоциировано с развитием печеночных метастазов при карциномах толстой и прямой кишки, а также желудка [20].
В группе сравнения и у больных, получавших Бион 3, абсолютное число естественных киллерных CD3+CD16+CD56+-Т-клеток (NKT) в раннем послеоперационном периоде снижалось примерно вдвое, а относительное количество этих клеток уменьшалось на 16% и 27%, соответственно (табл. 17).
В позднем послеоперационном периоде абсолютное содержание CD3+CD16+CD56+-клеток несколько увеличивалось в обеих группах. Несмотря на отсутствие существенных различий этого показателя между группами, через 1 месяц после хирургического вмешательства в контрольной группе уровень NKT-клеток был достоверно ниже, чем при поступлении в стационар, тогда как у больных, получавших Бион 3, число этих лимфоцитов статистически значимо не отличалось от их исходного количества.