Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Пробиотики: микроэкологические основы, проблемы и перспективы производства 13
1.1. Значение и функции нормальной микрофлоры организма человека, роль лактобактерий 13
1.2. Актуальные вопросы изготовления и контроля пробиотических препаратов 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 56
ГЛАВА 3. Совершенствование способа получения пробиотических препаратов 72
3.1. Унификация глубинного культивирования производственных бактериальных штаммов 73
3.2. Повышение эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков 84
3.3. Разработка альтернативных способов стабилизации бактериальных культур и изготовление лекарственных форм пробиотиков 97
ГЛАВА 4. Оптимизация контроля специфической активности пробиотиков 110
4.1. Разработка унифицированного комплекса питательных сред для определения специфической активности пробиотиков 110
4.2. Оптимизация теста отсроченного антагонизма на плотной питательной среде 124
4.3. Использование реакции ингибирования микробиолюминесценции для определения антагонистической активности пробиотиков 136
ГЛАВА 5. Разработка комплексного пробиотического препарата «лактобактерин-билс» 148
5.1. Конструирование бактериальной композиции: сравнительная характеристика и оценка совместимости производственных штаммов лактобактерий 149
5.2. Особенности технологии и методы контроля комплексного препарата 164
5.3. Сравнительная характеристика биологических свойств лактобактерина-БИЛС и препаратов-аналогов 171
ГЛАВА 6. Получение пробиотического препарата «микростим» из культуральной жидкости лактобактерий 179
6.1. Разработка технологии и физико-химические параметры препарата 179
6.2. Исследование влияния микростима на микроорганизмы . 193
6.3. Основные направления использования культуральной жидкости лактобактерий в технологии пробиотиков 209
Заключение 212
Выводы 233
Список литературы 235
- Значение и функции нормальной микрофлоры организма человека, роль лактобактерий
- Унификация глубинного культивирования производственных бактериальных штаммов
- Разработка унифицированного комплекса питательных сред для определения специфической активности пробиотиков
- Конструирование бактериальной композиции: сравнительная характеристика и оценка совместимости производственных штаммов лактобактерий
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современные условия жизнедеятельности человека характеризуются постоянным влиянием неблагоприятных био-, техно- и социогенных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности микроэкологической системы макроорганизма [11, 31, 68, 229, 362]. Нарушения микробиоценоза играют существенную роль в патогенезе большого количества заболевания различной этиологии, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиозов как общемедицинскую [21, 89, 107, 157, 202, 220, 239]. Этим обусловлена необходимость обеспечения практического здравоохранения широким арсеналом эффективных и доступных пробиотических препаратов, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов человека [94, 102, 133, 158, 226, 287, 375]. Актуальной задачей для отечественного производства пробиотиков является выпуск конкурентоспособных препаратов, которые по своим потребительским характеристикам не должны уступать импортным аналогам. Основными направлениями прикладных исследований в области пробиотиков являются: разработка новых препаратов с повышенной биологической активностью, новых лекарственных форм и оптимизация технологического процесса [75, 134, 153, 156, 195]. Массовый выпуск препаратов для бактериотерапии вызывает также необходимость оптимизации способов их контроля [147].
Клинические исследования последних лет открывают новые стороны позитивного воздействия пробиотиков на физическое состояние человека [33, 119, 313, 339]. Это позволяет расширять сферу их применения (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология и др.) и определяет необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации и требованиям к потребительским свойствам препаратов (суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы, таблетки) [165, 177, 290, 353]. В связи с этим разработка и усовершенствование технологий указанных фармакопейных
форм, являются актуальными для производства пробиотиков, которые выпускаются в основном в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах).
Проблема повышения эффективности производства пробиотических препаратов предполагает решение задач, связанных с усовершенствованием всех стадий технологического процесса, включая накопление биомассы, стабилизацию бактериальных культур и изготовление лекарственных форм. В условиях массового производства пробиотиков актуальна проблема оптимизации способов и методических подходов, используемых при контроле их специфической активности [147]. Решению данной проблемы будет способствовать разработка адекватных, малозатратных и экспрессных тестов биоиндикации [170].
Эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав [12, 37, 63, 123, 164, 225]. Повышение и расширение спектра биологической активности пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы. Создание препаратов многовидового микробного состава является перспективным направлением в бактериотерапии [11, 185].
При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе биологически активных метаболитов бактерий - представителей нормальной микрофлоры организма человека [43, 45]. Экзометаболиты индигенных бактерий стимулируют рост резидентной микрофлоры, подавляют патогенные микроорганизмы, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки и оказывают иммуномодулирующее действие [27, 39, 227, 327, 343, 370, 380]. В связи с известной биологической активностью метаболитов лактобактерий [32, 48J 119, 255, 278, 292, 329] и потребностью практической медицины в препаратах, обладающих комплексным пробиотическим и иммуномодулирующим
действием, разработка нового лекарственного средства на основе продуктов жизнедеятельности лактобактерий является весьма актуальной.
Цель настоящего исследования - усовершенствование способов получения и контроля пробиотиков, разработка новых препаратов на основе лактобактерий и их метаболитов.
Основные задачи исследования:
Разработать эффективные технологические приемы накопления биомассы, стабилизации бактериальных культур и приготовления лекарственных форм, а также унифицировать однотипные операции, применяемые при изготовлении различных пробиотических препаратов: лактобактерина, ацилакта, бифидумбактерина, бификола, колибактерина.
Разработать унифицированный комплекс сывороточно-дрожжевых питательных сред для контроля специфической активности пробиотиков и новые способы определения их антагонистических свойств, позволяющие ограничить использование патогенных тест-штаммов.
Провести сравнительную оценку биологических и технологических свойств известных производственных штаммов лактобактерий, сконструировать бактериальную композицию с учетом их совместимости и разработать технологию комплексного пробиотика с повышенной биологической активностью.
Разработать способы выделения и стабилизации низкомолекулярных метаболитов лактобактерий для получения нового пробиотического препарата, исследовать его биологическую активность.
Научная новизна. Разработан научно-методологический подход к оптимизации производства пробиотиков, сочетающий использование принципов технологической унификации и учета биологической специфики получаемых препаратов.
Обоснована возможность унификации процесса глубинного реакторного культивирования производственных штаммов бактерий с использованием универсальных основ применяемых питательных сред и рабочих растворов.
Для улучшения биологических показателей сухой биомассы разработаны приемы подготовки бактериальных суспензий к лиофилизации, основанные на комплексном применении трофических и протективных свойств обезжиренного молока. Сконструированы составы защитных сред для использования единого режима сублимационного высушивания. Установлено, что применение ксеропротектора, содержащего аэросил, способствует улучшению технологических характеристик лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения сухой биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления препарата «Лактобактерин порошок».
В качестве альтернативы сублимационному высушиванию предложен
способ стабилизации жидкой бактериальной культуры, обеспечивающий
длительное сохранение жизнеспособности клеток и предназначенный для
изготовления мягких лекарственных форм пробиотиков. На основе
разработанного способа получен препарат «Лактобактерин, суппозитории
вагинальные» (патент на изобретение РФ № 2132690, приоритет от
30.01.1997), а также мазь на основе лактобактерий «Эмулакт» (патент на
изобретение РФ № 2183963, приоритет от 10.08.1999). Показана возможность
получения стабильной микрогранулированной биомассы
иммобилизированных лакто-, коли- и бифидобактерий (патент на изобретение РФ № 2076722, приоритет от 29.06.1994).
Для контроля специфической активности пробиотиков сконструирован унифицированный комплекс жидких, полужидких и плотных питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата. Разработан способ контроля пробиотических препаратов с применением непатогенных культур в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (патент на изобретение РФ № 2177152, приоритет от 02.12.1999) и предложен новый методический подход для оценки его результатов. Показана возможность использования данного теста для исследования совместимости штаммов в бактериальных композициях. Разработан оригинальный способ определения антагонистической активности пробиотиков на основе реакции
угнетения микробиолюминесценции (патент на изобретение РФ № 2187801, приоритет от 10.07.2000) и предложен экспресс-тест для его практического применения.
Сконструирована бактериальная композиция из известных производственных штаммов лактобактерий и разработан способ получения на ее основе нового комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью (патент на изобретение РФ № 2200566, приоритет от 26.06.2001). Предложен способ выделения и стабилизации метаболитов лактобактерий (патент на изобретение РФ № 2224018, приоритет от 21.11.2001), с помощью которого получен новый препарат «Микростим», обладающий широким спектром бактериотропного действия. Показана возможность использования метаболитов лактобактерий в технологии пробиотиков при накоплении биомассы и изготовлении лекарственных форм (патент на изобретение РФ № 2187994, приоритет от 26.10.2000).
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют существующее представление о биотехнологическом потенциале производственных штаммов бактерий, а также о возможных способах стабилизации бактериальных культур и методах исследования их антагонистических свойств, методологии конструирования комплексных пробиотических препаратов, диапазоне бактериотропного действия метаболитов лактобактерий и перспективах их применения. Определены закономерности процесса накопления биомассы и стабилизации бактериальных культур в условиях унификации однотипных технологических операций. Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения адекватной информации об антагонистической активности пробиотиков без использования патогенных тест-культур.
Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными и экономичными технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления и контроля пробиотиков к условиям
массового производства препаратов, а также созданием новых пробиотических препаратов, позволяющих расширить спектр лекарственных средств для нормализации микроэкологического статуса человека.
Разработанные способы накопления биомассы и стабилизации бактериальных культур используются в производстве пробиотиков и включены в нормативную документацию на препараты: «Лактобактерин сухой», «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», «Бифидумбактерин сухой», выпускаемые в Пермском НПО «Биомед». Предложенные методические подходы при контроле антагонистической активности пробиотиков отражены в проектах новых редакций фармакопейных статей предприятия на препараты, включая «Колибактерин сухой» и «Бификол сухой».
Разработана технология новой лекарственной формы лактобактерина -дозированный порошок в пакетах. Предложен состав и технология нового комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой». В результате исследования биологической активности препарата выявлены его существенные преимущества по сравнению с лактобактерином и ацилактом. Показана возможность использования экзометаболитов лактобактерий для получения пробиотиков. Охарактеризована биологическая активность разработанного препарата «Микростим», содержащего метаболиты лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ.
Положения, выносимые на защиту
Использование разработанных технологических приемов, включающих применение унифицированных питательных и защитных сред, а также различных вариантов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм пробиотиков, отвечает потребностям массового производства пробиотических препаратов и способствует повышению его экономической эффективности.
Для проведения контроля специфической активности пробиотиков наиболее целесообразно применять унифицированный комплекс питательных
сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата. Использование способа определения антагонистических свойств препаратов, предусматривающего оценку изо- и гомоантагонистической активности, а также экспресс-теста ингибирования микробиолюминесценции, позволяет ограничить применение патогенных тест-культур при их контроле.
Биологическая активность комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС», разработанного на основе лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ и L, acidophilus К1Щ24, превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерин, ацилакт).
Новый препарат «Микростим», содержащий низкомолекулярные метаболиты лактобактерий, обладает стимулирующим влиянием на бактерии нормофлоры, а также антибактериальным действием по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научной конференции «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии», Томск, 1991; Научной конференции «Экспериментальная и прикладная иммунология», Пермь, 1991; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994; Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995; Международной научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики», Москва, 1996; I и II Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы», Пермь, 1996, 2005; Международной научной конференции «Современная вакцинология», Пермь, 1998; Международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2000; Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения
иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград-Пермь, 2001; V Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2001; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», Москва, 2004.
Диссертация апробирована и рекомендована к защите на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Пермское НПО «Биомед».
По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы, из них 8 патентов РФ на изобретение.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе отделения препаратов бактериотерапии и лаборатории биорегуляторов в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации: 01.9.80.0.07822, 01.200.1.08828, 01.200.1.08829).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 277 страницах, содержит 55 таблиц и 29 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 415 источников, из них 236 отечественных и 179 иностранных авторов.
Значение и функции нормальной микрофлоры организма человека, роль лактобактерий
Наиболее сложные по составу микробиоценозы - это микрофлора толстой кишки, рта и носоглотки. В полости рта встречается более 300 видов микробов [395], в кишечнике - более 500 [53, 243, 256]. Общая численность бактериальных клеток у взрослого человека достигает 1014, что на порядок больше числа клеток всех органов и тканей макроорганизма [31, 327].
Максимальное количество бактерий присутствует в толстом кишечнике, где оно составляет 400 млрд микробных клеток на 1 г содержимого [21, 289, 352, 392]. Биомасса микробов, заселяющих кишечник взрослого человека, достигает 3 кг [332]. Основу нормальной микрофлоры кишечника составляют облигатно-анаэробные бактерии (бифидобактерии и бактероиды), на долю которых приходится 90% всех микроорганизмов. Остальные 10% микроорганизмов -аэробные и факультативно-анаэробные бактерии: лактобактерии, кишечная палочка, энтеробактерии, стрептококки и другие [243, 307, 374, 395].
Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) представляет собой сложно организованную систему, в структуре которой можно выделить две основные популяции: просветную и пристеночную [375]. Формирование просветного микробиоценоза зависит от многих экзогенных и эндогенных факторов, а его окончательный состав является результатом смешивания транзиторных и индигенных микроорганизмов. Наибольшее количество микробов составляет пристеночную микрофлору, содержащуюся в муциновом слое [48, 227].
Нормальная микрофлора кишечника выполняет и регулирует многие процессы в организме человека [32, 53, 243, 332]. Одной из важнейших функций нормофлоры является поддержание колонизационной резистентности, под которой понимают совокупность механизмов, придающих стабильность индигенной микрофлоре и предотвращающих заселение макроорганизма посторонними микробами [407]. К факторам, обеспечивающим колонизационную резистентность относятся: - эффект «экранирования» слизистой от проникновения условно патогенных микроорганизмов за счет высокой адгезивной активности индигенных бактерий [252, 376, 395]; - выработка нормальной микрофлорой комплекса веществ, оказывающих антагонистическое действие [237, 243, 256, 270]; - стимуляция местного иммунитета, активация синтеза секреторного IgA, который препятствует адгезии условно-патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам [215, 254, 333, 365]; - конкуренция с экзогенными микробами за питательные субстраты [352, 360]. Микроорганизмы нормальной микрофлоры принимают активное участие в процессах переваривания и всасывания пищи. Они усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, метаболизируют жиры и клетчатку [256, 274, 378, 399]. Нормофлора регулирует перистальтику ЖКТ через образование и катаболизм биогенных аминов (брадикинина и гистамина); продукцию простагландинов; метаболизм желчных кислот с образованием метаболитов, ускоряющих моторику [8].
Индигенные микроорганизмы способствуют всасыванию и участвуют в синтезе витаминов группы В, витамина К, фолиевой, никотиновой, аскорбиновой кислоты и ряда незаменимых аминокислот, способствуют абсорбции в кишечнике солей железа, кальция и витамина D [227, 332]. Микроорганизмы ЖКТ участвуют в водно-солевом обмене [189], в рециркуляции желчных кислот, обмене холестерина, стероидов и других макромолекул [352, 399]. Продуктами жизнедеятельности индигенных бактерий являются летучие жирные кислоты, гормоны и медиаторы, влияющие на функцию печени, сердечно-сосудистой системы, кроветворения, обмен веществ и т.д. [26, 227, 241, 356, 369, 381].
Нормофлора оказывает морфокинетическое действие [53]. Стимуляция роста эпителиальных клеток микроорганизмами, по мнению W. Roediger [376], обусловлена тем, что продукты микробного метаболизма служат дополнительным важным источником питания клеток слизистой оболочки. Кроме того, жирные кислоты, продуцируемые анаэробами, стимулируют регенерацию эпителия. Их отсутствие в просвете кишечника приводит к развитию язвенного колита и других заболеваний [26].
Симбионтная микрофлора осуществляет детоксикацию экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов, утилизируя непереваренные пищевые вещества и инактивируя канцерогенные соединения [265]. Ряд индигенных бактерий имеет высокую активность нитратредуктазы (пропионибактерии, пептококки, вейлонеллы, грамотрицательные энтеробактерии и другие), за счет чего они предотвращают развитие метгемоглобинемии при высоком содержании нитратов. Особенно это важно у детей раннего детского возраста, имеющих высокую долю фетального гемоглобина [332].
Хорошо известна иммуномодулирующая функция облигатных микроорганизмов кишечника [32, 64, 306, 311, 339]. Опыты на гнотобионтах показали, что антигенная стимуляция представителями нормальной микрофлоры необходима для формирования лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми, и для полноценного функционирования иммунной системы всего организма [48, 215]. Становление иммунного ответа формируется в первые часы неонатального периода именно под влиянием микробного окружения [34]. При отсутствии микроорганизмов происходит уменьшение глубины крипт слизистой, снижение высоты ворсин, истончение собственной пластины, уменьшение пейеровых бляшек. По сравнению с обычными животными безмикробные особи характеризуются более низким содержанием Ig всех типов, сниженной фагоцитарной активностью [372]. Размер селезенки у гнотобионтов уменьшен почти в два раза, слабо выражен лимфопоэз [221].
Унификация глубинного культивирования производственных бактериальных штаммов
Штаммы бактерий, используемые для получения известных препаратов (лактобактерин, ацилакт, бифидумбактерин, колибактерин и др.), относятся к разряду высокотребовательных к источникам питания. Основными субстратами питательных сред, лимитирующими рост и влияющими на физиологическую активность данных бактериальных культур, являются источники азота и углерода. Для улучшения накопления биомассы им необходимы также дополнительные ростовые факторы (витамины, пуриновые и пиримидиновые основания, аминосахара и др.), которые должны быть представлены в готовом виде, так как эти бактерии неспособны синтезировать все компоненты, входящие в состав клеточного вещества. Этим обусловлено применение производственных сред сложного состава, содержащих наряду с питательными основами и значительное количество ростстимулирующих компонентов [23, 95, 178, 194, 391].
Микробиологическая практика свидетельствует, что, как правило, эффективные среды для культивирования указанных бактерий могут быть изготовлены с применением питательных основ из достаточно широкого спектра взаимозаменяемых субстратов животного, растительного или иного происхождения [138]. Питательную основу, содержащую необходимые нутриенты для метабиоза разных микроорганизмов, можно использовать в качестве универсального базового компонента при конструировании бактериологических сред различного назначения. При этом появляется возможность разработки унифицированных комплексов питательных сред для производственного применения. Питательная среда в данном случае, как структурная единица унифицированного комплекса, должна состоять из 2 частей: постоянной (универсальной), включающей базовый субстрат, а также переменной (специфичной), зависящей от потребностей конкретного производственного штамма бактерий. Приготовление такой среды может включать раздельную подготовку обеих частей, а их сведение можно осуществлять непосредственно перед или в ходе культивирования микроорганизмов.
Алгоритм конструирования унифицированных комплексов питательных сред для массового производства пробиотиков включает несколько необходимых этапов: предварительный выбор питательных субстратов с учетом критериев биологической ценности, доступности и экономичности; получение питательных основ и оценка их эффективности на модели регламентированных питательных сред; разработка и оценка способов получения питательных основ с учетом критериев технологичности и трудоемкости; балансировка состава питательных сред. Из ранее разработанных нами [138] комплексов были отобраны для практического использования при получении пробиотиков казеиново-дрожжевые среды. Это связано с тем, что они в большей степени отвечают требованиям массового производства по совокупности биологических, технологических и экономических параметров. Остальные варианты сред, несмотря на их высокую эффективность [138], не нашли практического применения по ряду причин: альбуминовые (на основе ферментативного гидролизата лошадиного сывороточного альбумина) - из-за ограниченности сырьевой базы и трудоемкости предварительной подготовки белкового субстрата к гидролизу; соевые (на основе ферментативного гидролизата соевого шрота) - из-за содержания в сырье генномодифицированного белка и низкой эффективности процесса гидролиза; сывороточно-дрожжевые (на основе молочной сыворотки и аутолизата пекарских дрожжей) - из-за несоответствия физических свойств получаемых лиофилизированных препаратов (цветность, структура сухой биомассы) требованиям нормативной документации. Панкреатический гидролизат казеина и аутолизат пекарских дрожжей, составляющие основу казеиново-дрожжевых (КД) сред, широко применяются в микробиологической практике, в т.ч. в производстве иммунобиологических препаратов. Технология изготовления указанных полуфабрикатов достаточно хорошо отработана и не требует внесения существенных корректив. Единственное изменение, связанное с получением аутолизата, включало использование метода сепарации вместо длительного (10-12 суток) отстаивания нативного аутолизата для удаления (отделения) дрожжевой клеточной стромы. Практический опыт применения КД сред свидетельствует, что изготовление ограниченной номенклатуры полуфабрикатов для питательной основы унифицированных комплексов в условиях массового выпуска пробиотиков позволяет значительно снизить трудоемкость и увеличить эффективность процесса подготовки к реакторному культивированию. Специфичность балансировки состава питательной среды в производстве пробиотиков обусловлена необходимостью учета влияния ее компонентов на физические свойства сухой биомассы, получаемой в ходе лиофилизации. Одна из основных задач оптимизации заключается в снижении расхода дорогостоящих составляющих производственной питательной среды при сохранении ее эффективности и технологичности. Следует отметить, что, помимо первичной балансировки, при практическом использовании питательной среды возникает необходимость корректировки состава при внесении существенных изменений в сопряженные с производственным культивированием технологические операции, связанные с получением маточной культуры и высушиванием препарата. Более чем десятилетний опыт применения в НПО «Биомед» КД сред свидетельствует, что перманентный процесс их модернизации является необходимой составной частью общего усовершенствования технологии пробиотиков. В настоящее время КД среды являются основными производственными средами на предприятиях, выпускающих отечественные пробиотические препараты.
Разработка унифицированного комплекса питательных сред для определения специфической активности пробиотиков
Определение специфической активности является необходимой и регламентированной составной частью производственного цикла при выпуске любого пробиотика. Контролируемый спектр показателей, которые должны соответствовать нормативным требованиям, включает антагонистическую активность, уровень v кислотообразования и количество жизнеспособных клеток в дозе препарата. Традиционно используемые культуральные методы контроля этих показателей базируются на применении питательных сред. Номенклатура последних достаточно широка и специфична для каждого препарата.
Возможные пути совершенствования контроля пробиотиков в условиях массового производства могут быть направлены как на оптимизацию существующих, так и на разработку новых методов определения параметров специфической активности. Комплексный подход к решению указанной проблемы предполагает унификацию традиционных методик, в частности, использование унифицированных питательных сред, а также применение более экономичных и экспрессных способов биоиндикации.
В настоящей главе представлены результаты исследований, связанных с разработкой набора питательных сред для определения показателей специфической активности, с применением новых методических подходов при проведении и оценке результатов теста отсроченного антагонизма, а также с изучением и практическим использованием реакции ингибирования микробиолюминесценции при контроле пробиотиков.
Наряду с питательными средами для производственного культивирования бактерий проблема ограничения номенклатуры актуальна и для сред, используемых для контроля пробиотиков. Подход к конструированию комплекса сред для этой цели принципиально не отличается от ранее рассмотренного. В связи с тем, что в данном случае отсутствовали ограничения, обусловленные технологией изготовления препаратов, в качестве универсального субстрата была использована сывороточно-дрожжевая (СД) питательная основа, содержащая молочную сыворотку и дрожжевой аутолизат. Указанная основа по сравнению с казеиново-дрожжевой более экономична и имеет ряд технологических преимуществ при приготовлении.
Разрабатываемые среды для контроля пробиотиков не должны уступать регламентированным по совокупности биологических характеристик: чувствительности, скорости роста и стабильности основных свойств микроорганизмов [129]. Эти параметры наряду с экономичностью и технологичностью являются основными критериями при оценке пригодности питательных сред указанного назначения.
В настоящем разделе приводятся результаты исследований, относящиеся к способу получения и апробации жидких, полужидких и плотных вариантов СД сред. Представлены данные по сравнительному применению разработанных и регламентированных сред при контроле специфической активности пробиотиков.
Технологические аспекты приготовления и состав сывороточно дрожэкевых сред Дрожжевой аутолизат и молочная сыворотка являются известными питательными субстратами, которые достаточно широко применяются в микробиологической и биотехнологической практике. Предварительный анализ трофического потенциала этих веществ позволял предполагать, что их сочетание соответствует диапазону основных потребностей производственных штаммов бактерий и может быть использовано в качестве универсальной питательной основы при конструировании сред для контроля препаратов. Технологическая предпосылка сочетанного применения дрожжевого аутолизата и молочной сыворотки включала следующие значимые для производства факторы: - отсутствие необходимости использования ферментных препаратов в процессе изготовления питательной основы; - высокое содержание углеводов в молочной сыворотке, исключающее их дополнительное введение в состав питательной среды; - наличие отработанного способа получения дрожжевого аутолизата, входящего в состав производственных казеиново-дрожжевых сред. При получении питательной основы технологическая обработка молочной сыворотки была направлена на сохранение ее трофической ценности. В связи с тем, что теплообработка и осветление способствуют повышению ростовых свойств молочной сыворотки [83], процесс ее подготовки включал термокоагуляцию остаточного количества казеина путем кипячения с последующим охлаждением и удалением осадка. Такая обработка позволяет получить осветленную сыворотку необходимой прозрачности, но приводит к снижению содержания аминного азота с (0,68±0,02) до (0,25±0,02) мг/мл.
Конструирование бактериальной композиции: сравнительная характеристика и оценка совместимости производственных штаммов лактобактерий
Регламентированное определение антагонистической активности пробиотиков (препаратов и производственных штаммов) базируется на угнетении развития патогенных и условно-патогенных культур, работа с которыми относительно трудоемка и требует специальных условий. Это обстоятельство учитывалось при проработке вариантов проведения теста отсроченного антагонизма.
Известно, что рост бактериальной культуры на плотной питательной среде сопровождается продукцией и диффузией комплекса метаболитов, участвующих как во внутривидовой, так и в межвидовой коммуникации микроорганизмов. Метаболиты, угнетающие рост и деление клеток, могут быть активны по отношению к гетеро-, гомо- и изологичным штаммам бактерий. Накопление лимитирующих метаболитов вызывает специфическое изменение питательной среды и делает ее непригодной для развития других популяций. При этом наблюдается подавление роста как патогенных, так и непатогенных микробов. Следовательно, в искусственно созданных условиях межпопуляционного взаимодействия подавляющая активность испытуемой бактериальной культуры проявляется в виде гетероантагонизма (подавление микроорганизмов других родов), гомоантагонизма (подавление роста штаммов того же вида, рода) и изоантагонизма (подавление роста того же штамма) [172].
Вышеуказанное позволяет предполагать, что оценка антагонистической активности может быть основана на определении любой ее составляющей или их совокупности, а для исследования гетеро- и гомоантагонизма пробиотиков наряду с патогенными и условно-патогенными микробами можно использовать сопоставимые с ними по чувствительности бактерии различных таксономических групп, в т.ч. производственные штаммы.
При постановке теста отсроченного антагонизма существенное влияние на фенотипическое проявление антагонистических свойств испытуемой культуры оказывает состав и качество питательных сред. Унификация теста предполагает применение универсального варианта плотной питательной среды. В этом качестве при исследовании антагонистических свойств пробиотиков была апробирована сывороточно-дрожжевая среда СД-4 (см. раздел 4.1).
При сравнительном изучении изо-, гомо- и гетероантагонизма пробиотиков на общепринятых средах и среде СД-4 применялись регламентированные условия проведения теста для каждого препарата (штамма), включая продолжительность роста испытуемой культуры и совместной инкубации с контрольными штаммами. Для выявления возможных отличий в проявлении биологических свойств в результате технологического воздействия параллельно исследовались лиофилизированные культуры производственных штаммов и готовые препараты (не менее 10 серий).
При определении антагонистической активности Е. coli М-17 (колибактерин, бификол) использовали стандартный набор тест-штаммов из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (гетеро- и гомоантагонизм), непатогенные штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4 (гетероантагонизм), а также изологичную культуру (изоантагонизм). Представленные в табл. 19 результаты свидетельствуют об аналогичной подавляющей активности образцов лиофилизированного штамма и полученных на его основе препаратов.
На регламентированной среде Гаузе №2 количественные показатели подавления роста изологичной культуры и штаммов, входящих в стандартный набор, не имели существенных отличий (р 0,05), обладали высокой корреляцией (г 0,8) и во всех случаях превышали нормированный минимальный уровень (15 мм). Размеры зон отсутствия роста тест-штаммов на среде СД-4 достоверно не отличались от таковых на регламентированной среде (р 0,05). Подавление культур из стандартного набора на СД среде было достоверно выше изоантагонизма (р 0,05) и во всех случаях зоны отсутствия роста превышали 15 мм. Показатели всех составляющих антагонистической активности на разработанной среде обладали высоким коэффициентом корреляции между собой (г 0,8) и с аналогичными показателями на среде Гаузе №2 (г 0,8). На обеих питательных средах культуры Е. coli М-17 не ингибировали рост штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4.
Анализ полученных результатов позволил установить количественные параметры антагонистической активности культуры Е. coli М-17 при использовании среды СД-4. Также как на среде Гаузе №2, зона подавления роста каждого тест-штамма, входящего в регламентированный набор, должна составлять не менее 15 мм и всегда превышать уровень изоантагонистической активности.
Антагонистическую активность лактобактерий L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4 определяли, используя эти же культуры (изо- и гомоантагонизм), а также регламентированный набор тест-штаммов и Е. coli М-17 (гетероантагонизм). Полученные результаты (табл. 20 и 21) свидетельствуют, что подавляющее действие на тест-культуры в одинаковой степени выражено как у лиофилизированных штаммов, так и у сухих препаратов (лактобактерин), приготовленных на их основе.