Введение к работе
Актуальность темы. Е. carotovora subsp. atroseptlca - представитель группы бактерий, вызывающих "мягкие гнили" растений. В >тличие от родственных видов Е.chrysantheml и Е. carotovora subsp. carotovora эти микроорганизмы чаще встречаются в зонах с смеренным и холодным климатом, где вызывают бактериоз стеблей сартофеля ("черную ножку") и "мягкие гнили" различных овощных сультур при вегетации и их хранении. В отдельных случаях от поранения "мягкими гнилями" гибнет до 20-50 % собранного урожая (До-южкин и соавт.. 1989; Colmer. Bateman, 1981; Perombelon, Kelman. 1987).
Вирулентные свойства Erwlnla в значительной степени обуслов-іенн способностью синтезировать деполимеризующие ферменты, в тстности, пектолитические, эффективно разрушающие пектиновые ве-цества срединных пластинок и стенок растительных клеток, что приводит к мацерации тканей. Пектолитическая активность Erwlnla в количественном отношении обусловлена преимущественно пектатлиа-зой. представленной несколькими изоферментами. Очевидно, что для зыяснения роли этого фермента во взаимодействии Erwlnla с растениями необходимо детальное изучение свойств изоферментов пектат-пиазы и основных закономерностей регуляции их синтеза.
Ферменты Erwlnla отличаются широким оптимумом действия (рН 5,0 - 10,0) и различной субстратной специфичностью ( низко- и вы-сокометилированный пектин). Это обстоятельство обусловливает возможность использования пектолитаческих ферментов Erwlnla во многих технологиях, связанных с переработкой растительного сырья, вместо либо одновременно с широко применяемыми в настоящее время пектолитическими препаратами грибного происхождения. Представляется перспективным применение бактериальных пектиназ в пищевой, винодельческой, легкой и фармацевтической промышленностях. Все вышесказанное определяет необходимость получения штаммов бактерий с повышенной продукцией пектолитаческих ферментов, в частности, пектатлиазы.
Кроме того.пектатлиаза,экскретируемая клетками Erwlnla во внешнюю среду,является удобным объектом для изучения механизма секрени» белков грамотрицательными бактериями.Эта проблема приобрела особую актуальность в связи с использованием микроорганизмов ь качества продуцентов ряда биологически активных гицесть оопко
ВОЙ ГрфиДЫ.
сертационная работа выполнялась в лаборатории молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии биологического факультети Белгосуниверситета в течение 1990 - 1995 гг. в соответствии о планами научно-исследовательских работ в рамках темы "Изучение детерминант вирулентности и сравнительный анализ геномов бактерии рода Erwlnla" (г/б 392/57).
Цель и задачи исследования, Цель работы заключалась в изучении некоторых закономерностей синтеза и секреции пектатлиази у бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca. что. в свою очередь, обусловило решение следующих задач:
анализ качественного и количественного состава пектиназно-го комплекса, образуемого исследованными бактериями на средах с различными источниками углерода, а также некоторыми нативными компонентами растительных тканей;
характеристика регуляторних мутантов Е. carotovora subsp. atroseptlca;
- изучение процессов синтеза и секреции пектатлиази в разных стадиях роста бактериальной культуры и распределения этого фермента в клетках дикого типа и секреторных мутантов;
- установление некоторых закономерностей продукции и секре
ция иектатлиаз, детерминируемых в клетках Е. carotovora subsp.
atroseptlca клонированными генами других бактерий рода Erwlnla.
Научная новизна полученных результатов. Установлено, что пектатлиаза у исследованных бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca представлена несколькими (не менее пяти) изоферментами. Выявлены основные закономерности регуляции синтеза индивидуальных форм пектатлиази. Показано, что синтез иектатлиаз у Е. carotovora subsp. atroseptlca, как и у других представителей рода Erwlnla. индуцируется пектиновыми веществами и подвержен катаболитнои репрессии глюкозой. Продукция разных иэоферментов регулируется независимо друг от друга и характеризуется различной чувствительностью к индуцирующим агентам и катаболитнои репрессии. Получены новые данные о формировании определенных спектров иэоферментов пектатлиази в инфицированных растительных тканях в зависимости от их химического состава. Изолирован регуляторний мутант бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca, характеризующийся повышенной продукцией нескольких укзофераентов (пектатлиазы. целлюлазы, про-
теазы) и нечувствительностью их синтеза к катаболитной репрессии глюкозой. Установлено, что данная мутация ведет к дерепрессии синтеза преимущественно одного изофермента - пектатлиазы Еса4.
Выявлен ряд закономерностей в процессе секреции пектатлиазы у Е. carotovora subsp. atroseptica: транслокация синтезируемого в цитоплазме фермента в периплазматическое пространство и экспорт его из периплазмы через наружную мембрану во внешнюю среду. На основании данных по изучению экспрессии в клетках Е. carotovora subsp. atroseptica клонированных генов пектатлиаз других представителей рода Erwlnla можно сделать вывод о высокой специфичности системы секреции пектиназ у Erwlnla, принадлежащих не только к разным видам, но даже подвидам.
Практическая значимость полученных результатов, В результате экспериментов по изучению синтеза пектолитических ферментов с использованием синтетических сред с различными эффекторами синтеза пектатлиазы. а также сред с растительными компонентами выявлены основные факторы, позволяющие осуществлять модуляцию количественного и качественного состава пектолитических ферментов в процессе их синтеза. Показана также возможность использования различных источников углерода для получения пектолитических ферментов определенного состава.
Получены мутанты бактерий Е.. carotovora subsp. atroseptica 36А. по продуктивности пектатлиазы превосходящие в 2-6 раз исходный штамм. Мутанты могут найти применение для получения высокоэффективных ферментных препаратов пектолитического действия.
Результаты работы расширяют сведения о физиологии и биохимии факторов вирулентности одного из важнейших для Беларуси фитопато-генов Е. carotovora subsp. atroseptica.
Экономическая значимость полученных результатов. Штаммы бактерий - продуцентов пектолитических ферментов, а также получаемые с их помощью фьрментние препараты мацерирующего действия могут представлять определенный интерес для использования в различных отраслях пищевой, легкой, фармацевтической промышленности и в научных исследованиях.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
- Регуляция синтеза пектатлиазы у Е. carotovora subsp. atroseptica осуществляется путем индукции пектиновыми вещео/гпами, г.а таболигной репрессии глюкозой и зависит от Фазы роста бактєрігпь-ных клеток.
Пектатлиаза Е. carotovora subsp. atroseptlca представлена множественными молекулярными Формами, различающимися по степени индукции и чувствительности к катаболитной "репрессии.
Показана возможность формирования определенных спектров изиферментоа пектатлиазы в инфицированных растительных тканях.
Охарактеризованы мутанты бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca с дерепрессированным синтезом пектатлиазы, а также некоторых других внеклеточных ферментов (целлюлазы, протеазы). Установлено избирательное действие описываемой мутации на продукцию различных изоферментов пектатлиазы.
Показана идентичность качественного состава внеклеточных и внутриклеточных пектатлиаз, продуцируемых бактериями Е. carotovora subsp. atrposeptlca дикого типа и секреторными мутантами.
В .процессе секреции пектатлиаз из клеток Е. carotovora subsp. atroseptlca можно выделить две стадии: транслокация синтезируемого фермента в периплазму и экспорт через наружную мембрану во внешнюю среду.
Выявлена высокая специфичность системы секреции пектатлиазы у Erwlnla; показана низкая эффективность секреции клетками Е. carotovora subsp. atroseptlca изоферментов, принадлежащих к другим видам и подвидам данного рода.
Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал диссертационной работы получен, обработан и проанализирован автором.
Апробация результатов диссертации. Результаты исследований представлялись на Всесоюзном совещании "Фитонциды. Бактериальные болезни растений" (Ужгород,. 1990), YI съезде Белорусского отделения Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Горки, 1992), YI съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Минск. 1992). YI конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994).
Опубликованность результатов, Результаты исследований опубликованы в пяти статьях в научных журналах и четырех тезисах конференций. Одна статья находится в печати (журнал "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология").
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, анализа и обобщения резуль татов исследований, выводов, списка использованных источников.