Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Антарктида 9
1.2 Антарктические оазисы и свободные ото льда участки суши 9
1.3 Антарктические поверхностные пресноводные озера 12
1.4 Методы и подходы, применяемые для изучения бактериального разнообразия в антарк-тических пресноводных озерах 13
1.5 Физико-химические факторы, влияющие на бактериальное разнообразие в поверхност-ных пресноводных озерах
1.5.1 Влияние низкой температуры 18
1.5.2 Адаптация к субоптимальным концентрациям питательного субстрата 19
1.5.3 Световой режим 21
1.6 Бактериальное разнообразие в поверхностных пресноводных озерах различных оазисов
и свободных ото льда участках суши Антарктиды 22
1.6.1 Бактериальное разнообразие в озерах оазисов и Земли Виктория Восточной Антаркти ды 22
1.6.1.1 Оазис Ширмахера 22
1.6.1.2 Оазис Холмы Ларсеманн 27
1.6.1.3 Оазис Бангера 28
1.6.1.4 Оазис Вестфолль 29
1.6.1.5 Земля Виктории 31
1.6.2 Бактериальное разнообразие в озерах Западной Антарктиды, на примере озер острова Сигни и района залив Надежды 32
1.6.2.1 Остров Сигни (Южные Оркнейские острова) 32
1.6.2.2 Залив Надежды (Hope Bay)
1.7 Физико-географические условия расположения оазиса Эймери 36
1.8 Краткая история изучения озера Радок 37
1.9 Биологические исследования озера 38
2 Материалы и методы 39
2.1 Физико-химическая характеристика озера Радок 39
2.2 Отбор образцов воды 40
2.3 Обработка образцов воды и определение клеточных концентраций 40
2.4 Бактериальное культивирование 41
2.5 Экстракция геномной ДНК 41
2.6 Амплификация генов 16S рРНК 42
2.7 Молекулярное клонирование 42
2.8 ПЦР с вектор-специфичными праймерами 42
2.9 Приготовление клеточных лизатов 2.10 Риботипирование ДНК фрагментов 43
2.11 Очистка ДНК 43
2.12 Секвенирование ДНК фрагментов 43
2.13 Анализ нуклеотидных последовательностей 44
2.14 Статистический анализ 44
3 Результаты и обсуждение 46
3.1 Сравнение двух библиотек 367А и 367В нижнего горизонта по области v3-v5 46
3.2 Сравнение двух экспериментальных библиотек 31R и 37R нижнего горизонта по области v4-v8 48
3.3 Анализ микробного разнообразия верхнего горизонта по трем (v3-v5, v4-v8, ПГ) облас-тям гена 16S рРНК 51
3.4 Анализ микробного разнообразия 100 м горизонта по двум (v3-v5 и v4-v8) областям гена 16S рРНК 54
3.5 Анализ микробного разнообразия 200 м горизонта по двум (v3-v5 и v4-v8) областям гена 16S рРНК 56
3.6 Анализ микробного разнообразия нижнего 367 м горизонта по трем (v3-v5, v4-v8, ПГ) областям гена 16S рРНК 58
3.7 Сравнительный анализ микробного разнообразия 4-х горизонтов озера с использованием двух различных областей гена 16S рРНК
3.7.1 Сравнение микробного разнообразия 4-х горизонтов по области v3-v5 гена 16S рРНК 62
3.7.2 Сравнение микробного разнообразия 4-х горизонтов по области v4-v8 гена 16S рРНК 63
3.7.3 Сравнение микробного разнообразия 4-х горизонтов по объединенным данным облас-тей v3-v5 и v4-v8 гена 16S рРНК 3.8 Сравнительный анализ трех (v3-v5, v4-v8, ПГ) областей гена 16S рРНК 68
3.9 Молекулярно-биологический анализ дополнительного образца (исток реки Межозерная (глубина 2 м)) по двум (v3-v5 и v4-v8) областям гена 16S рРНК
3.10 Культивирование бактерий филума Planctomycetes из 4-х горизонтов водного столба озера 73
3.11 Филогенетический анализ доминантных некультивируемых и культивируемых бактери-альных филотипов 74
3.12 Значимые находки, имеющие отношение к холодным местообитаниям 77
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 78
Выводы 81
Список сокращений и определений 82
Список литературы 83
Приложение 97
Благодарности 1
- Физико-химические факторы, влияющие на бактериальное разнообразие в поверхност-ных пресноводных озерах
- Бактериальное разнообразие в озерах Западной Антарктиды, на примере озер острова Сигни и района залив Надежды
- Обработка образцов воды и определение клеточных концентраций
- Молекулярно-биологический анализ дополнительного образца (исток реки Межозерная (глубина 2 м)) по двум (v3-v5 и v4-v8) областям гена 16S рРНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Озерные экосистемы в Антарктиде являются
уникальными объектами, представляющими из себя природные лаборатории для
проведения фундаментальных исследований в области изучения связи между
климатом, эволюционными процессами и молекулярной адаптацией
микроорганизмов к экстремальным условиям существования (Rogers et al., 2007).
Из-за крайне неблагоприятных климатических условий, сложившихся в Антарктиде
за последние 14 млн лет (Priscu et al., 2009), экосистемы континентальных
водоемов, в т. ч. и пресноводных озер, отличаются крайне низкой концентрацией
питательных веществ. Вследствие чего большинство пресноводных антарктических
озер характеризуются упрощенными и укороченными пищевыми цепочками
(Laybourn-Parry and Pearce, 2007). В таких водоемах существуют
высокоприспособленные экстремофильные, преимущественно прокариотные, реликтовые сообщества микроорганизмов (Нетрусов, 2004), которые могут представлять интерес для биотехнологии.
Актуальность изучения водной микробиологии пресноводных антарктических озер связана также с исследованием биогеохимических циклов, одну из ключевых ролей в которых играют бактерии водной толщи. В связи с этим возникает необходимость в определении биоразнообразия и состава бактериальных сообществ в рассматриваемых экосистемах в сопоставлении с физико-химическими параметрами среды.
В настоящее время, несмотря на резко увеличившийся интерес к подобного рода исследованиям, до сих пор работы в области молекулярной микробиологии антарктических пресноводных озер представлены в незначительном количестве по сравнению с работами, посвященными водоемам более высоких широт. Отчасти это связано как с удаленностью самого континента, так и с суровостью климата на нем, что сокращает число мест для расположения полярных станций и тем самым существенно ограничивает доступ к озерам.
Таким образом, изучение биоразнообразия и структуры микробных сообществ антарктических озер вызывает повышенный интерес не только к проблеме функционирования таких экстремальных экосистем, но и определению механизмов адаптации и эволюции микроорганизмов к холоду, а также выявлению новых таксонов (Laybourn-Parry and Pearce, 2007). Помимо этого данные водные объекты могут служить ключевым звеном в понимании того, как могут функционировать подобные экосистемы, возможно существующие на других ледовых планетах и лунах (Priscu et al., 2009).
Цель и задачи исследования. Цель работы – с использованием молекулярно-биологических и филогенетических методов охарактеризовать бактериальное разнообразие оз. Радок на примере изучения образцов различных горизонтов водного столба и истока р. Межозерной.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи.
-
Сравнение трех областей (v3–v5, v4–v8 и полноразмерный ген – ПГ) генов 16S рРНК, используемых в ПЦР для выявления бактериального разнообразия.
-
Изучение и сравнение бактериального разнообразия четырех горизонтов (от 1,3 до 367 м) водного столба оз. Радок.
-
Изучение бактериального разнообразия дополнительного образца (глубина 2 м) в районе истока р. Межозерной.
4. Культивирование бактерий филума Planctomycetes водного столба
оз. Радок.
Научная новизна. Впервые методом секвенирования бактериальных генов 16S рРНК выявлено и описано бактериальное разнообразие самого глубокого в Антарктиде поверхностного пресноводного оз. Радок. Впервые для изучения бактериальных сообществ антарктического озера были использованы праймерные системы сразу на три различные области гена 16S рРНК (полноразмерного гена, областей v3–v5 и v4–v8), тогда как в работах других авторов, посвященных микробной молекулярной экологии антарктических озер, использовали не более одной области данного гена. Такой подход позволил более широко охарактеризовать бактериальное разнообразие оз. Радок. Так, благодаря использованию области v4–v8 гена 16S рРНК выявленные нами в оз. Радок представители филума Planctomycetes (три филотипа из сем. Planctomycetaceae и один из сем. Phycisphaeraceae), оказались в числе доминирующих филумов бактериальных сообществ пресноводных антарктических озер. Полученные в работе последовательности генов 16S рРНК депонированы в международную базу данных NCBI под номерами: JF901736–JF901755, KR811200–KR811209.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют наше представление о составе и разнообразии бактериальных сообществ пресноводных антарктических озер, что способствует пониманию механизмов функционирования и адаптации бактериальных сообществ в течение длительного периода времени к изменяющимся факторам внешней среды. Данные экосистемы, практически не подверженные антропогенному влиянию, служат прекрасной моделью для изучения и отслеживания любых природных изменений, влияющих на бактериальный состав этих деликатных водных объектов. Также показано, что для более полного описания бактериального разнообразия пресноводных антарктических озер необходимо использовать как минимум две области гена 16S рРНК, учитывая биотехнологический потенциал этих водоемов.
Апробация работы и публикации. Основные материалы работы были представлены на международных и российских конференциях и симпозиумах: 13-й Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009); VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010); III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия» (Н. Новгород, 2010); The 4th International Сonference on Polar and Alpine Microbiology (Ljubljana, Slovenia, 2011); CAREX Сonference on Life in Extreme Environments (Dublin, Ireland, 2011); 14th International Symposium on Microbial Ecology (Copenhagen, Denmark, 2012); 1-й Всероссийской научной школе-конференции по астробиологии (Пущино, 2012). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезиса докладов.
Положения, выносимые на защиту.
1. Во всех изученных горизонтах озера доминирующей группой бактерий
оказался видовой комплекс, состоящий из трех филотипов,
близкородственных виду-кандидату Candidatus Planktophila limnetica из Actinobacteria.
-
Состав бактериальных сообществ в различных горизонтах значительно варьировался как на уровне филумов, так и филотипов, несмотря на однородные физико-химические характеристики водного столба озера.
-
Секвенирование как минимум двух областей (v3–v5 и v4–v8) генов 16S рРНК, амплифицированных в ПЦР, позволяет полнее охарактеризовать бактериальное разнообразие.
-
Из 40 выявленных филотипов 33 оказались новыми неизвестными видами (из них 14 филотипов – неидентифицированные).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 таблицами, 15 рисунками, содержит 3 приложения. Список литературы включает в себя 183 источника, в т. ч. 32 отечественных и 151 иностранных.
Физико-химические факторы, влияющие на бактериальное разнообразие в поверхност-ных пресноводных озерах
Ранние микробиологические работы по изучению антарктических пресноводных озерных систем проводились с использованием классических методов культивирования и прямого микроскопирования водных образцов (Pearce et al., 2003). Одними из первых подобного рода исследований проводились на озерах островов Субантарктики, а также на континентальных озерах Ванда и Бонну (Goldman, 1967; Чеботарев, 2003). Применение же молекулярно-биологических методов для изучения разнообразия и экологии микроорганизмов в природных образцах началось примерно с конца 1980-х годов (Head et al., 1998). Данные методы, основанные на изучении последовательности ДНК, полностью перевернули представление о микробном разнообразии в природе, существенно расширив возможности изучения любых экониш, в том числе и холодных мест обитания (Брюханов, 2012). Общепринятым в данный момент является мнение, что культивированию поддаются менее 0,1 % видов прокариот, существующих на Земле. Наиболее популярными молекулярно-биологическими методами изучения бактериальных сообществ антарктических озер являются: метод разделения в градиентных гелях и клонирования ампликонов генов 16S рРНК (Huang et al., 2013; Villaescusa et al., 2013; Michaud et al., 2012; Kojima et al., 2014), ДГГЭ (Foreman et al., 2011; Karr et al., 2003; Villaescusa et al., 2010; Schiaffino et al., 2009), а также FISH-гибридизация, при условии достаточности биомассы (Pearce et al., 2003; Pearce, 2005).
Нередко для более полного “вскрытия” микробного разнообразия некоторые авторы используют комбинацию сразу из нескольких методов (Huang et al., 2013; Foreman et al., 2011). Например, Дэвид Пирс первым применил для изучения бактериального разнообразия в пресноводном антарктическом озере Мох одновременно методы ДГГЭ (денатурирующий градиентный гель-электрофорез) и FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) (Pearce et al., 2003).
Краеугольным камнем в любом исследовании микробного разнообразия, в особенности при работе с образцами с низкой биомассой, является проблема контаминации образцов чужеродной ДНК. Игнорирование или недолжная степень внимания к этой крайне острой проблеме приводит к ошибочным, а зачастую и к совершенно противоположным результатам и выводам. Ярким примером этому являются данные, полученные в процессе изучения атмосферного и озерного льда подледникового озера Восток (Антарктида). Так, методом проточной цитофлуориметрии было определено общее содержание клеток в концентрированных образцах воды атмосферного и озерного льда типа 1 и 2 над озером Восток, которое оказалось в пределах 0 – 24 кл/мл воды (Булат и др., 2009). Полученные авторами данные на 2 – 3 порядка оказались ниже, чем опубликованные ранее (Priscu et al., 1999; Karl et al., 1999). Помимо этого, почти все филотипы, выявленные методом молекулярного клонирования, после тщательного анализа были однозначно отнесены к контаминантам (Bulat et al., 2004), что опять же, абсолютно не согласуется с опубликованными ранее результатами (Priscu et al., 1999; Karl et al., 1999). В связи с этим при работе с подобного рода объектами первостепенной важностью является задача предотвращения загрязнения чужеродной микробиотой при отборе и последующей обработке образцов льда или воды (Bulat et al., 2004; Булат и др., 2009).
Известно, что метод ПЦР, несмотря на огромные преимущества, обладает недостатками, среди которых основным является преимущественная амплификация одних молекул перед другими (Нетрусов, 2004) в связи с тем, что используемые так называемые «универсальные» праймеры “покрывают” лишь часть известных бактериальных филумов. Именно поэтому внимание ученых сосредоточилось на оптимизации этого революционного метода, в то время как экстракции ДНК, не менее важному этапу в изучении природных образцов, уделялось несравненно меньшее внимание. Неоднократно показано, что не только различные методы, например, энзиматический и механический способ разрушения клеток, на выходе дают неодинаковые результаты, но даже разные коммерческие наборы в рамках одного метода экстрагируют ДНК, концентрация которой может отличаться в несколько раз (Lakay et al., 2007; Nocker et al., 2007; Delmont, 2012). Удивительно, но, несмотря на эти факты в некоторых современных публикациях, посвященных бактериальному разнообразию антарктических озер, авторы в качестве способа экстракции ДНК используют кипячение (Mojib, 2009), что явно недостаточно для разрушения клеток и высвобождению гДНК.
Наиболее распространенным методом выявления микробного разнообразия в пресноводных водоемах Антарктиды в настоящее время является метод молекулярного клонирования с последующим секвенированием по Сэнджеру (Villaescusa, 2013; Kojima et al., 2014) или пиросеквенированием ампликонов генов 16S рРНК. К безусловным преимуществам метода молекулярного клонирования относится его высокое филогенетическое разрешение полученных ОТЕ (операционная таксономическая единица), что способствует однозначной идентификации выявленных филотипов в различных мировых базах данных (Nocker et al., 2007), а значит, выявлению их метаболического потенциала и физико-химических характеристик, поддерживающих метаболизм и клеточное деление, исходя из свойств коллекционного материала. Минусами данного подхода считаются его относительная сложность (трудоемкость), проблематичность в выявлении редких членов сообществ (неполное “покрытие” библиотек), а также возможная избирательность генов при амплификации (Нетрусов, 2004), что зависит от используемых праймеров. Последним “грешит” и метод пиросеквенирования ампликонов генов 16S рРНК. Метод ДГГЭ имеет ряд несомненных преимуществ, в сравнении с молекулярным клонированием. Однако, этот метод пригоден для сравнительно большой биомассы и задач, ставящих сравнение различных экониш или временных интервалов существования сообществ в данных эконишах. Если речь идет об изучении одного образца и разового получения данных метод теряет свою значимость, т.е. он позволяет получить оценку разнообразию бактериального сообщества в процессе изменений факторов среды (Нетрусов, 2004). Вместе с тем метод ДГГЭ имеет также определенные ограничения. Так, с его помощью достоверно разделяются только гены из сравнительно малочисленных сообществ, содержащих несколько десятков представителей (Нетрусов, 2004). Кроме того, для эффективного разделения н.п. необходимо использовать относительно небольшие фрагменты ДНК в 300 - 400 по (Ovreas, 2000), но не более 500 по (Брюханов, 2012). Тем самым, данный метод затрудняет получение надежной филогенетической информации и однозначной таксономической идентификации филотипов микробных сообществ (Nocker et al., 2007; Schiaffino et al., 2009).
Ещё одним популярным методом, применяемым в изучении микробного разнообразия в антарктических водных экосистемах, является метод FISH. Он позволяет идентифицировать различные филогенетические группы (зонды, как и «универсальные» праймеры, не “покрывают” всего разнообразия) непосредственно в природном образце без применения метода ПЦР, при условии достаточности биомассы. К тому же FISH способен оценить число метаболически активных клеток, что невозможно осуществить при использовании методов ДГГЭ и молекулярного клонирования. В тоже время, для того чтобы определить количество жизнеспособных клеток, образцы необходимо фиксировать сразу, либо хранить очень непродолжительное время в определенных условиях (Брюханов, 2012). Все это существенно ограничивает применение этого метода в условиях, не соответствующих стандартам чистоты, антарктических станций.
Благодаря серьезному усовершенствованию методов секвенирования ДНК в последнее время к изучению бактериального разнообразия применяются метагеномные подходы (Ng et al., 2010; Lauro, 2011; Yau & Cavicchioli, 2011; Vick-Majors et al., 2014). С появлением этих методов появилась возможность более глубокого анализа природного биоразнообразия, а также намного лучшего понимания метаболического и биогеохимического потенциала изучаемых сообществ, тем самым, сократив разрыв между фенотипом и функцией (Riesenfeld, 2004; Nocker et al., 2007). Метагеномный анализ позволил расширить границу наших знаний о разнообразии микроорганизмов, но, вместе с тем, привнес новые проблемы в виде огромного массива входящих данных (миллионы и миллиарды последовательностей), которые трудны в обработке и интерпретации, требующих применение программ, отличающихся от используемых при работе с несколькими десятками последовательностями (метод клонирования).
Бактериальное разнообразие в озерах Западной Антарктиды, на примере озер острова Сигни и района залив Надежды
Полученные ДНК последовательности анализировали с помощью программы Chromas Lite 2.01. Множественное выравнивание и сравнение нуклеотидных последовательностей проводили, используя программу CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Нуклеотидные последовательности, показывающие 98 % сходства между собой, а также одинаковый перечень последовательностей в мировой базе Genbank с использованием программы BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), объединяли в один филотип или ОТЕ. Выявленные филотипы сравнивали сперва с собственной БК (базой контаминантов) (Bulat et al. 2004), содержащей бактериальные филотипы из разного рода контрольных реакций (холостая экстракция гДНК, негативная ПЦР и пр.). Идентификацию филотипов, прошедших тест на контаминацию, проводили при помощи алгоритма BLAST и RDP (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). Последовательности, показавшие 90 % сходства с ближайшими известными (опубликованными) таксонами, относили к неидентифицированным филотипам, тогда как филотипы, которые нельзя было отнести ни к одному из известных филогенетических разделов определяли, как неклассифицируемые. Филотипы, представленные тремя и более клонами в клоновой библиотеке, рассматривали как доминантные. Филотипы, показавшие в GenBank 98 % сходства с ОТЕ, выявленными при изучении микробиоты человека (здоровых и больных), были отнесены к HA-филотипам (Human Associated – связанные с человеком), рассматриваемым как контаминанты человеческого происхождения.
Построение филогенетического дерева проводили методом “максимального правдоподобия” с помощью программного пакета MEGA6 (Kumar et al. 2008). Статистическую достоверность топологии выбранного дерева оценивали методом бутстрэп - анализа 500 альтернативных деревьев в той же программе. Клоны (нуклеотидные последовательности), представляющие выявленные филотипы, депонированы в базу данных GenBank под номерами: JF901736 -JF901755, KR811200 - KR811209.
Оценку достаточности покрытия клоновых библиотек рассчитывали по формуле Гуда: (1 -n/N) x 100, где n – это число единичных клонов, N - общее число клонов в библиотеке [Good, 1953], а также путем построения аналитических кривых (тест «Rarefaction») с помощью программы aRarefact Win 1.3 (http://strata.uga.edu/software/anRareReadme.html). Для расчета индексов разнообразия Shannon–Weaver (География и мониторинг биоразнообразия, 2002) и индекса видового богатства Chao1 (Chao, 1984) использовали программу DOTUR 1.53 (Schloss and Handelsman 2005). Входные данные для программы подготавливали с помощью программ CLUSTALW2 и Phylip DNADist (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=dnadist). В связи с тем, что секвенировались только репрезентативные клоны от каждого риботипа, допускали, что несеквенированые клоны, входящие в один риботип, сходны по нуклеотидной последовательности на 100 % между собой. 3 Результаты и обсуждение
Всего для 4-х горизонтов водного столба озера и дополнительного образца истока реки Межозерная было создано 14 клоновых библиотек и проанализировано 540 клонов по трем областям генов 16S рРНК. Все исследуемые клоны были объединены в рибогруппы, представители которых были секвенированы. Выявленные филотипы были проверены по БК и на статус HA-филотипов. В результате число “истинных” филотипов (прошедших все контроли на контаминацию) составило 40 из них 20 филотипов были отнесены к доминантным (см. приложение 1). HA-филотипы среди доминантных выявлены не были. Отметим, что совокупная доля минорных филотипов (1-2 клона в филотипе), не превышала 25 % от их общего числа в каждом из водных горизонтов.
Оценка клеточных концентраций микроорганизмов в образцах воды с 4-х глубин показала их содержание в ранге (1,6 – 2,4) х 104 кл/мл, что на порядок ниже, чем в соседнем эпишельфовым озере Бивер (Laybourn-Parry et al., 2006) и говорит о сравнительно низкой биомассе. В то время как в подледниковом озере Восток число клеток составляет 0 – 24 кл/мл (Bulat et al., 2009)
Обе библиотеки были созданы на основе двух водных образцов, отобранных с глубины 367 м путем секвенирования v3-v5 области генов 16S рРНК. Первоначальный объем выборки для библиотеки R367A составил 47 клонов, а для R367B – 41 клон. После сопоставления референтных последовательностей с БК в первой выборке были обнаружены 2, а во второй 3 филотипа-контаминанта. Тем самым, окончательный размер выборки для библиотеки R367A составил 44 клона, а для R367B – 35 клонов (Табл. 2; Рис. 3).
Сравнительный анализ двух экспериментальных библиотек (2 независимых выделения ДНК) показал, что все филумы были общими, кроме класса -proteobacteria, представленным филотипом (R6-2) отдаленно родственным (83 % сходства) Desulfomicrobium hypogeium и выявленным только в библиотеке R367A. Библиотеки R367A и R367B были представлена 3 филумами и 1 отделом. В обеих библиотеках явным численным превосходством обладали филотипы филума Actinobacteria, составившие в сумме 63 % в R367B и 77 % в R367A, соответственно. При этом, если библиотека R367A была представлена 5 ОТЕ, то R367B только 3 ОТЕ, которые оказались общими для обеих библиотек.
Обработка образцов воды и определение клеточных концентраций
Клоны 37R-2 и 37R-31 принадлежавшие к acI-AVI и acI-AIV кладу acI линии (Warnecke et al., 2004) пресноводных Actinobacteria были сходны на 97 % с “Candidatus” P. limnetica (Jezbera et al.). Клон 37R-26 был идентичен на 98,8 % с M. pyrenivorans. Филотипы 31R-1 и 31R-2 были близкородственны на 99 % с Sediminibacterium salmoneum и на 95,4 % с C. sancti, соответственно. Филотипы 37R-15 и 37R-7 показали близкородственное сходство на уровне 97,3 % с R. frigidaquae и на уровне 94,1 % с Rhodovarius lipocyclicus, соответственно. Филотип 37R-35 показал отдаленное родство (85 %) с Algisphaera agarilytica и, тем самым, был отнесен нами к неидентифицированным. Филотип 31R-8 оказался на 99,6 % идентичным зеленой водоросли Mychonastes huancayensi. Отметим, что два последних филотипа были уникальны для данной библиотеки, т.е. они не были обнаружены ни в одной другой библиотеке даже в минорных количествах. Кроме филотипа 37R-35 к неидентифицированным был отнесен также филотип 37R-39 показавший 74 % сходства с мтДНК страменомила N. oceanica.
Согласно проведенному нуклеотидному анализу в библиотеке f3R было выявлено 4 бактериальных филума: Bacteroidetes (3 филотип), Proteobacteria ( (2) и (1)), Planctomycetes (2), Actinobacteria (1) и 2 эукариотических отдела: Viridiplantae (1) и Dictyochophyceae (1). Среди бактерий доминировал только 1 филотип (клон f3R-35) филума Bacteroidetes, тогда как в эукариотических – оба филотипа. Причем, если филотип f3R-8 отдаленно родственный (93,5 %) хпДНК M. arctica из Dictyochophyceae составил в библиотеке 10 % от общего числа клонов, то филотип f3R-22 родственный на 88 % хпДНК P. minor из Viridiplantae – 54 % от всей выборки. Таким образом, филотип f3R-22 был отнесен к неидентифицированным. Филотип f3R-35 показал высокое сходства на уровне 99 % с S. salmoneum из филума Bacteroidetes.
Сравнение трех библиотек показало, что в f3R (ПГ) было найдено только три доминантных филотипа, тогда как в R367A+B (v3-v5) и 37R/31R (v4-v8) - 8 и 11 таких филотипов, соответственно. В результате этого даже на уровне филумов и отделов все библиотеки существенно различались. Так, в библиотеке R367A+B подавляющее большинство (70 % от общего числа клонов) составили представители филума Actinobacteria (в том числе группа филотипов, близкородственных “Candidatus” P. limnetica), тогда как в библиотеке f3R преобладал (54 %) один представитель отдела Viridiplantae. Отметим, что значительную долю (26 %) в данной библиотеке составили минорные филотипы. Библиотека 37R/31R оказалась «выравненной» по составу – 34 % филотипов из Actinobacteria и по 14 % филумы Bacteroidetes (2 доминантных филотипа: S. salmoneum и C. sancti (95,4 %)) и Planctomycetes (3 неидентифицированных филотипа). Общих доминантных филотипов для трех библиотек выявлено не было. Для R367A+B и 37R/31R общими оказались 3 доминантных филотипа, близкородственные “Candidatus” P. limnetica, M. pyrenivorans и R. frigidaquae. Для библиотек 37R/31R и f3R – S. salmoneum и M. arctica, а для R367A+B и f3R – P. minor. В библиотеках R367A+B и 37R/31R было выявлено по 2 уникальных (выявленных только в этих библиотеках) доминантных филотипа. В первой, неидентифицированный филотип, отдаленно родственный (83 %) Desulfomicrobium hypogeium (-proteobacteria), а также неизвестный представитель Candidate division OD1. Во-второй, неидентифицированный филотип, родственный (85 %) Algisphaera agarilytica (Planctomycetes) и филотип, родственный (99,6 %) гДНК зеленой водоросли M. huancayensi.
Всего во всех трех библиотеках было обнаружено 12 неидентифицированных филотипов: 11 уникальных (R367A+B – 4, 37R/31R – 5, f3R – 2) и один общий для всех трех библиотек. Так в библиотеке R367A+B было выявлено три доминантных (3R-7, R6-2 и R6-20) и два минорных (R6-46 и 3R-33) филотипа, тогда как библиотека 37R/31R содержала два доминантных (37R-35 и 37R-39) и четыре минорных (31R-6, 37R-12, 37R-36, 37R-6) филотипа. В библиотеке f3R было обнаружено один доминантный (f3R-22) и два минорных (f3R-3 и f3R-5) неидентифицированных филотипа. Кроме того, в двух библиотеках (f3R и 37R/31R) было выявлено по одному минорному HA-филотипу. В обоих случаях был отмечен высокий процент сходства на уровне 99,8 % для клона 37R-3 и 98,7 % для клона f3R-36 с филотипами, являющимися частью микробиома кожи человека (Gao et al., 2007; Kong et al., 2012).
Судя по анализу статистических данных наименьшей степенью покрытия (85 %) обладала библиотека f3R, что также подтверждается уровнем наклона аналитической кривой (табл. 5, рис. 12). Показатели значения индекса Чао 1 для 37R/31R и R367A+B составили 22,5 и 19,5 соответственно. Интересно, что показатели значения индекса Чао 1 были практически идентичны для всех библиотек, подтверждая тот факт, что выборка библиотеки f3R была недобрана. Так, при значении показателя индекса Чао 1 равным 19 число выявленных филотипов в библиотеке было 12, среди которых 7 были представлены единичными находками. Наибольшее биоразнообразие среди всех созданных (всего 14) библиотек показала библиотека 37R/31R (индекс Шэннона-Уивера - 2,7).
В результате секвенирования 4-х библиотек (горизонты 1,3 м, 100 м, 200 м и 367 м), созданных по области v3-v5 генов 16S рРНК наибольшее биоразнообразие на уровне филумов и отделов было выявлено в 100 метровом горизонте (6), тогда как наименьшее (4) в 200 метровом горизонте (рис. 9). Причем, по числу филотипов (15) горизонт 367 м в два раза превышал остальные. В каждом из горизонтов были выявлены филотипы из филума Actinobacteria, составлявшие от 50 до 70 % клонов в каждой библиотеке. Причем, подавляющее большинство (от 42 до 55 %) этих филотипов принадлежало к acI-AVI кладу, acI-AIV кладу и неопределенному кладу acI линии пресноводных Actinobacteria сходных на 97 % с “Candidatus” P. limnetica. Также во всех горизонтах встречалась ОТЕ близко родственная M. pyrenivorans. Помимо представителей филума Actinobacteria, во всех горизонтах были также выявлены ОТЕ филума Verrucomicrobia, представленные, правда, только в минорных количествах. Во всех горизонтах также была выявлена последовательность, принадлежащая разделу Viridiplantae, отдаленно родственная (88 %) хпДНК P. minor и хорошо представленная в двух верхних горизонтах. Что можно объяснить достаточным количеством солнечной радиации, по сравнению с нижними горизонтами, достигающей данных глубин. Только филум Bacteroidetes и класс -proteobacteria были обнаружены в каком-то одном из горизонтов. Первый – в верхнем, а второй – в нижнем горизонте. Оба были представлены одним доминантным филотипом.
Согласно индексу Гуда, все выборки для 4-х библиотек были достаточно репрезентативны с покрытием 92 %. Для библиотек R1B (1,3 м) и R200B (200 м) высокая степень достаточности выборок подтверждается также выходом аналитических кривых на плато (рис.12). Судя по индексу видового богатства Чао1 биоразнообразие библиотеки R367B (горизонт 367 м) потенциально в 2,5 – 3 раза выше, чем у остальных (табл.5). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
Молекулярно-биологический анализ дополнительного образца (исток реки Межозерная (глубина 2 м)) по двум (v3-v5 и v4-v8) областям гена 16S рРНК
Изолят R367B/33 показал близкое родство на уровне вида (99,6 %) с Arthrobacter agilis (приложение 2). Штаммы этой бактерии были выделены как из осадков Северного Ледовитого океана (Yuan et al., 2014), так и из придонных матов некоторых озер, расположенных в Сухих Долинах Антарктиды (Rojas et al., 2009). Как сообщает Рохас с соавторами (2009) два штамма А.г agilis производили сильные антибактериальные вещества с направленным действием против грамположительных бактерий.
Изолят R367B/1A оказался конспецифичным (100 %) штамму Brevundimonas vesicularis, выделенному из седиментов отступающего (тающего) арктического ледника на архипелаге Шпицберген (Reddy et al., 2009).
Единственный из бета-протеобактерий 16S рДНК филотип 17R-29, доминирующий лишь в верхнем горизонте, был идентифицирован как Limnohabitans planktonicus. Данный штамм был выделен из пресноводного мезо-/эвтотрофного резервуара в Чехии (Kasalick et al., 2010) и определен как хемоорганотроф и факультативный анаэроб, способный к росту в диапазоне температур от 4 до 34 С. Как было установлено, L. planktonicus относится к Lhab-A1 трибе, входящей в космополитичный betI-A клад, встречающийся почти во всех изученных на данный момент пресноводных озерах (Newton et al., 2011). Выявленный нами 16S рДНК филотип f3R-35 оказался конспецифичным (99 % сходства) Sediminibacterium salmoneum NJ-44T, выделенному из осадков эвтотрофного (t воды около 19 С) резервуара в Пекине (Qu and Yuan 2008).
Из эукариот (в дерево не включены) 16S рДНК филотип 31R-8 оказался конспецифичным (99,6 % сходства с 18S рРНК) зеленой водоросли Mychonastes huancayensi, обнаруженной в озере Уанкайо, Перу (Krienitz et al., 2011). Представители рода Mychonastes, представляют собой нано-и пикопланктонные водоросли, обитающие в пресноводных и солоноватых водах Азии, Африки и Ю. Америки (Krienitz et al., 2011)
На глубинах 1,3 и 100 м нами был выявлен 16S рДНК филотип 17R-9 (его лучший аллельный вариант имеет номер R1007-4) одного вида (99,9 % сходства с мтДНК) с пресноводной водорослью Nannochloropsis limnetica (Stramenopiles). Впервые этот вид был найден и выделен одновременно из политрофного озера Ротер и гипертрофного пруда, находящихся в Германии (Krienitz et al., 2000). На данный момент 3 штамма этого вида были обнаружены в озере Байкал (Fietz et al., 2005). Также штаммы N. limnetica были выявлены в холодном Антарктическом озере Бонней, Сухие Долины (Bielewicz et al., 2011). По современным представлениям N. limnetica встречается в водоемах различного трофического статуса от олиготрофных до гипертрофных (Krienitz and Wirth 2006). Благодаря высокой скорости размножения и роста, а также большому содержанию жирных кислот, в сравнении с другими пресноводными видами рода Nannochloropsis, N. limnetica обладает значительным потенциалом применения в пресноводной аквакультуре и биотехнологии (Krienitz and Wirth 2006).
В целом, несмотря на однородность физико-химических параметров по вертикали в водном столбе озера наблюдали выраженную микробную стратификацию, как на уровне филумов и отделов, так и филотипов, в особенности в верхнем и нижнем горизонтах. Так, Planctomycetes, Viridiplantae и Bacteroidetes были выявлены только в верхнем и нижнем горизонтах, тогда как класс fi-proteobacteria - только в верхнем, а -proteobacteria и OD1 - только в нижнем.
Большее микробное разнообразие в верхнем горизонте, в сравнении с глубинами 100 и 200 м, по-видимому, связано с относительной доступностью солнечной радиации, что благоприятно для развития первичных продуцентов, населяющих верхние горизонты озер, и построения элементарных трофических цепочек. Что касается нижнего горизонта, то, как предполагает Вильяэскуса с соавторами (2013), стабильные условия для бактериопланктона в придонном слое озера могут создавать мхи (Villaescusa et al., 2013). К сожалению, наличие мхов на такой глубине (367,5 м) в озере Радок пока не подтверждается (Wagner and Seppelt, 2006). В то же время было установлено, что обломочный материал может, осыпаясь, скатываться по подводным склонам котловины, тем самым нарушая не только естественную стратификацию донных осадков (Wagner and Cremer, 2006), но, по-видимому, способствуя переносу микроорганизмов из верхних горизонтов на дно озера. Между тем, судя по наличию большого числа уникальных филотипов на глубине 367,5 м, придонный горизонт всё-таки обладает собственным автохтонным микробным сообществом.
Всего было выявлено 40 филотипов (20 доминантных), принадлежащих 6 филумам бактерий: Actinobacteria, Proteobacteria (, р - и ), Bacteroidetes, Planctomycetes, OD1, Verrucomicrobia, а также 4-м отделам эукариот: Dictyochophyceae, Xanthophyta, Chrysophyceae и Viridiplantae. Из них 33 филотипа показали 98 % сходства с ближайшими таксонами в мировой базе данных GenBank и, тем самым, были отнесены к новым неизвестным видам микроорганизмов, тогда как 14 филотипов, показавших 90 % сходства, остались неидентифицированными. Численно из бактерий превалировали актинобактерии (157 клонов - 41 % от общего количества и 5 доминантных филотипов). Из них во всех 4-х горизонтах преобладала группа филотипов (3 клада ас1-А подгруппы) “Candidatus” P. limnetica. Из эукариот - зеленые водоросли (23 клона - 6 % от общего числа и 2 филотипа). Отметим, что из доминантных филотипов 13 оказались уникальными, характерными только для определенного, в основном, нижнего горизонта.
Вместе с тем, несмотря на гетерогенность водного столба в плане микробного разнообразия, доминантные филотипы в горизонтах 100 и 200 м полностью совпали с филотипами, обитающими в верхнем и нижнем горизонтах, кроме одного (R2007-5), идентифицированного нами как Mesorhizobium loti. Интересно, что впервые, благодаря использованию области v4-v8 гена 16S рРНК, выявленные нами в оз. Радок представители филума Planctomycetes (3 филотипа из сем. Planctomycetaceae и 1 из сем. Phycisphaeraceae), оказались в числе доминирующих филумов бактериальных сообществ пресноводных антарктических озер. На данный момент доминатными филумами в бактериальной структуре пресноводных озер Антарктиды является триада Proteobacteria, Actinobacteria и Bacteroidetes, тогда как филотипы филума Planctomycetes до сих пор встречались только в очень небольших количествах.
Сравнение микробного разнообразия, выявленного на основе двух областей (v3-v5 и v4-v8) гена 16S рРНК, показало существенное различие, как на уровне филумов и отделов, так и на уровне филотипов. Например, только по области v3-v5 были выявлены филум OD1 и класс -proteobacteria, тогда как по области v4-v8 филум Planctomycetes, класс -proteobacteria и мтДНК страменопилов. Всё это показывает, что недостаточно использовать для вскрытия микробного разнообразия только одну область гена 16S рРНК, амплифицированную с любыми из известных универсальных праймеров. В качестве перспективы в дальнейшей работе при изучении микробного разнообразия в воде оз. Радок следует применить метагеномные методы как для выявления минорных филотипов, так и для сравнения метода клоновых бибилиотек с новейшими подходами в области микробной экологии. Интересно проследить изменения в составе микробного сообщества по результатам данной работы, основанной на образцах, полученных в 2005 г. из озера, с новыми ещё не отобранными образцами. Также, немаловажный интерес связан не только с изучением биоразнообразия в самой воде озера, но и бактериальных сообществ в его донных осадках.